Summary
Een snelle methode om het genoom ervan te wijzigen
Abstract
Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor manipuleren bacteriële chromosomen 1-3. De meeste van deze protocollen gebaseerd op het inbrengen van conditioneel replicerende plasmiden (bijv. herbergen pir-afhankelijke of temperatuurgevoelige replicons 1,2). Deze plasmiden geïntegreerd in bacteriële chromosomen basis van homologie-gemedieerde recombinatie. Dergelijke insertie mutanten zijn vaak direct gebruikt in experimentele settings. Als alternatief kan selectie voor plasmide excisie gevolgd door het verlies worden uitgevoerd, die voor Gram-negatieve bacteriën berusten vaak op de teller instelbare levansucrase enzym gecodeerd door het sacB gen 4. De excisie kan herstellen vóór het inbrengen genotype of resulteren in een uitwisseling tussen het chromosoom en het plasmide-gecodeerde kopie van het gemodificeerde gen. Een nadeel van deze techniek is dat het tijdrovend. Het plasmide moet eerst worden gekloneerd, het vereist horizontale overdracht V. cholerae (n meeste otably door paring met een E. coli donor stam) of kunstmatige transformatie van de laatste, en de excisie van het plasmide is willekeurig en kan het herstel van de oorspronkelijke genotype of maak de gewenste wijzigingen als er geen positieve selectie wordt uitgeoefend. Hier geven we een werkwijze voor snelle manipulatie van de V. cholerae chromosoom (en) 5 (figuur 1). Deze TransFLP methode is gebaseerd op de recent ontdekte chitine-gemedieerde inductie van natuurlijke deskundigheid op dit organisme 6 en andere representatieve van het geslacht Vibrio zoals V. fischeri 7. Natuurlijke competentie maakt de opname van vrij DNA waaronder PCR-gegenereerde DNA-fragmenten. Eenmaal opgenomen, de DNA recombineert met het chromosoom gezien de aanwezigheid van een minimum van 250-500 bp flankerend homoloog gebied 8. Inclusief een selectiemerker in-tussen deze flankerende gebieden maakt een eenvoudige detectie van veel voorkomende transformanten.
t "> Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende genetische manipulatie van V. cholerae en mogelijk ook andere natuurlijk competente bacteriën. We geven drie nieuwe voorbeelden van wat kan worden bereikt door deze methode naast onze eerder gepubliceerde studie in enige gendeleties en de toevoeging van affiniteit-tag sequenties 5. Verschillende optimalisatie stappen met betrekking tot de initiële protocol van chitine-geïnduceerde natuurlijke transformatie 6 zijn opgenomen in dit TransFLP protocol. Hieronder vallen onder andere de vervanging van krab schelp fragmenten door in de handel verkrijgbare chitine vlokken 8, de donatie van PCR afgeleide DNA omzetmaterialen 9 en de toevoeging van FLP-recombinatie doelplaatsen (FRT) 5. FRT er rekening plaatsgerichte excisie van de selectiemerker gemedieerd door de Flp recombinase 10.Protocol
De TransFLP methode (figuur 1) wordt geïllustreerd door drie verschillende benaderingen: I) het schrappen van twee aangrenzende genen die coderen virulentiedeterminanten van V. cholerae (bijvoorbeeld ΔctxAB), II) het verwijderen van een eiland pathogeniteit (bijvoorbeeld ΔVPI-1) en III) de integratie van een T7 RNA polymerase promoter-afhankelijke sequentie stroomopwaarts van een gen van belang, dat vervolgens kan de kunstmatige expressie in de respectieve stam achtergrond (bijvoorbeeld T7-TFox) (Figuur 2).
1. Voorbereiding van Chitine Flakes
- 50-80 mg gewicht van chitine vlokken in een standaard 1,5 ml plastic buis. Dit kan worden bereid in bulk. Chitine vlokken zijn commercieel verkrijgbaar bij Sigma (cat. nummer C9213).
- Autoclaveren de vlokken houden de deksels van de buizen open.
- Onmiddellijk sluit de deksels na de autoclaaf is afgekoeld.
- Store geautoclaveerd chitine vlokkenbij kamertemperatuur.
2. Optioneel: Kunstmatige Transformatie van V. cholerae met FLP recombinase coderende Plasmide
- Bereid elektrocompetente V. cholerae cellen met standaard methoden 11. Opslaan van competente cellen aliquots bij -80 ° C.
- Voeg 1-2 ul van een vaste mini-bereiding van plasmide pBR-flp 5 bij de elektrocompetente V. cholerae cellen en breng het mengsel in een elektroporatie cuvette (0,2 cm tussenruimte).
- Breng een puls op 1,6 kV.
- Voeg 0,9 ml SOC-medium, zacht overdracht cel om een standaard 14 ml buis. Incubeer stilstaande gedurende 2,5 tot 3 uur bij 30 ° C.
- Plaat 100 pl en 300 pl op LB-platen met 100 ug / ml ampicilline en incubeer bij 30 ° C geroerd.
- Zuiver enkele kloon en op te slaan als glycerol voorraad voor levering de toekomst TransFLP experimenten.
3. Oligonucleotide Ontwerp en Polymerase Chain Reaction
- Ten minste zes oligonucleotiden moeten de DNA regio (s) van belang en de FRT-geflankeerd antibioticum cassette door PCR (Figuur 3) te amplificeren. Het verdient aanbeveling om ook een paar oligonucleotiden priming buiten geplaatst PCR fragment. Hierdoor kan controleren op correcte integratie en excisie van de FRT-geflankeerd antibioticaresistentie cassette (bijvoorbeeld weergegeven als "CHK-up" en "CHK-down 'primers in de figuren 3 tot 5).
- Ontwerp oligonucleotiden # 2, # 3, # 4 en # 5 met zorg. Zij moeten in staat zijn voldoende (bijvoorbeeld ~ 28 bp) hybridiseren aan het matrijs-DNA. De template DNA genomisch DNA (gDNA) van primers # 2 en # 5 en FRT-Kan-FRT-bevattende plasmide DNA zoals pROD17 12 en pBR-FRT-KAN-FRT (dit onderzoek) voor primers # 3 en # 4 ( figuur 3A).
- Ontwerp de primers # 2 # 5 waardoor uitgebreide basenparing aan hun 5'-uiteinde van # 2 / # 3 en # 4 / # 5, respectievelijk (Figuur 3A
- Voer drie onafhankelijke PCR reacties als 1e ronde van PCR. De eerste zal versterken het stroomopwaartse gebied van het gen / DNA regio-of-interest met behulp van oligonucleotiden # 1 en # 2. De PCR moet resulteren in een fragment van ten minste 500 bp in lengte homologe recombinatie mogelijk is binnen de cellen. Kortere fragmenten (~ 250 bp) kan volstaan 8 maar worden niet aanbevolen.
- Parallel uitvoeren van de tweede PCR, die de FRT-geflankeerd antibiotica cassette versterkt. Voor de voorbeelden die we hier vooral gebruikt aph (kan R). Gebruik oligonucleotiden # 3 en # 4 voor deze reactie (Figuur 3A).
- Daarmee samenhangend versterken de stroomafwaartse DNA-regio door middel van PCR (derde monster). Het PCR fragment moet ook ten minste 500 bp in lengte. De PCR met gDNA als template en oligonucleotiden # 5 en # 6 (Figuur 3A).
- Na zuivering van de drie PCRfragmenten Voer de 2e ronde van PCR. Gebruik een gelijk mengsel van alle drie fragmenten verkregen in de eerste ronde als template. De amplificatie wordt gekatalyseerd door oligonucleotiden # 1 en # 6. Het verkregen PCR fragment (Figuur 3B) dient als transformerende DNA in de natuurlijke transformatie experiment (figuur 1).
4. Chitine-geïnduceerde Natural Transformation
- Grow V. cholerae cellen aëroob in rijk medium bij 30 ° C totdat zij een optische dichtheid bereiken bij 600 nm van ongeveer 0,5.
- Oogst de bacteriën door centrifugatie. Was de pellet in gedefinieerde kunstmatig medium (DASW 6) voordat resuspenderen de cellen in 2 delen DASW. Voeg 1 ml van cultuur aan 50 tot 80 mg steriele chitine vlokken (onder punt 1). Als bacteriën haven plasmide pBR-flp (optioneel punt 2), add ampicilline (50 ug / ml) aan de kweek. Incubeer bij 30 ° C gedurende 16-24 uur zonder beweging.
- Voeg & ge, 200 ng van de 2 e-round PCR-afgeleide fragment (onder punt 3). Meng voorzichtig, zonder uitgebreid verwijderen van de bacteriën uit de chitine oppervlakken. Incubeer bij 30 ° C gedurende 24 uur zonder beweging.
- Vortex de cultuur uitgebreid voor ≥ 30 sec. Verspreid 1-300 ul op selectieve LB-medium platen (bijv. kanamycine of gentamicine-bevattende LB-platen voor voorbeelden hier aanwezig). Gebruik dubbele selectieve platen als de bacterie herbergen het plasmide pBR-flp door het toevoegen van ampicilline gelijktijdig aan de andere antibiotica. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 16-24 uur of totdat kolonies zichtbaar.
- Isoleer enkele transformanten van selectieve platen. Dergelijke transformanten zijn vervangen door de oorspronkelijke chromosomale locus door PCR fragment door een dubbele crossover event. Deze stammen kunnen direct worden gebruikt voor verdere experimenten bij de verwijdering van het antibioticum cassette niet nodig.
5. Verwijdering van Selectieve Cassette (s) door Flp-Recombinatie
- Kunstmatig transformeren uw transformanten met plasmide pBR-flp zoals beschreven onder punt 2 indien niet gedaan voordat de natuurlijke transformatie test.
- De bacteriën groeien op LB-agarplaten met ampicilline bij 37 ° C gedurende 16-24 uur. Opties: verandering in de temperatuur tussen 2-3 uur tot 40 ° C als expressie van flp van plasmide pBR-flp is de-onderdrukt bij hogere temperaturen 5,10; overdracht bacteriën verse platen na ca. 8 uur incubatie.
- Test voor antibiotica-gevoeligheid (hier aangetoond voor kanamycine, figuur 1) door restreaking de klonen in parallel op antibiotica-bevattende en antibiotica vrij agarplaten. Isoleer enkele gevoelige kolonies. Freeze ampicilline-resistente kloon als glycerol voorraad als u van plan verder wijzigen van de stam met andere schrapping / invoegen met behulp van TransFLP.
6. Plasmide Curing
- Een dag te behalen cultuur onder aërobe conditie enbij 30 ° C. Gebruik rijk medium zonder de toevoeging van een antibioticum.
- Optioneel: Grow verse cultuur voor 3-6 uur door verdunning van de kweek van een nacht 1:100 in verse antibiotica-vrij medium.
- Plaat of strook verdunning (s) van de cultuur op gewoon LB-agar plaat (platen) en incubeer bij 30 ° C gedurende 8-16 uur (tot kolonies zichtbaar zijn).
- Test voor ampicilline-gevoeligheid van de klonen door restreaking de klonen in parallel op antibiotica-bevattende en antibiotica vrij agarplaten (figuur 1). Freeze ampicilline-gevoelige stam als glycerol voorraad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten van de drie voorbeelden worden getoond in figuren 4 tot 6. De eerste benadering die gericht zijn op het verwijderen van de naburige genen ctxA en ctxB. Samen coderen belangrijke virulentiefactor van V. cholerae choleratoxine. We ontwierpen oligonucleotiden voor de TransFLP werkwijze zoals boven beschreven en volgens figuur 3. De parentale stam, werden de tussenliggende stam die de FRT-geflankeerd antibioticaresistentie cassette in de oorspronkelijke DNA locus van ctxAB en de uiteindelijke druk verwijderd voor ctxAB en bevrijd van alle resistentiecassette getest op hun genotype (figuur 4). Werkwijze keuze was gehele cellen PCR. We gebruikten primers die niet hybridiseren aan de transformerende PCR fragment maar chromosomale DNA (Figuur 3). Dit liet ons toe om de site-specifieke uitwisseling van de PCR-fragment gaan of aan de homologe gebied van de chromosoom (Figure 4A). De PCR fragmenten werden gescheiden door standaard agarose gel elektroforese om de omvang te bepalen (Figuur 4B). Deze strategie kan worden gebruikt om spanning tussenproducten controleren en het uiteindelijke construct stam (s) bevestigen.
Voor het tweede voorbeeld, het verwijderen van een hele genoom eiland, hebben we gekozen voor de Vibrio pathogeniteit eiland 1 (VPI-1) als doel 13. De standaard TransFLP hierboven beschreven procedure succesvol was in dit geval. Het is bekend uit eerdere studies dat zo'n groot DNA-gebied kan worden uitgewisseld met een vergelijkbare grootte DNA gebied met chitine geïnduceerde natuurlijke transformatie 9. Wij veronderstelden dat het verschil in grootte tussen de regio tot-geschrapt en vrij korte transformeren PCR fragment (<3,5 kb) kan de beperkende factor zijn. We hebben daarom besloten om de TransFLP methode te gebruiken in twee stappen: eerst integreerde de aph-gen (kan R) voorafgegaan door een enkel FRT plaats aan het begin van VPI-1 (in figuur 5A). Vervolgens verricht een tweede natuurlijke transformatie, waardoor we een extra antibioticaresistentie cassette (gm R, gentamicine verleent weerstand) gevolgd door een tweede FRT plaats aan het einde van de pathogeniteit lopen (Figuur 5A) plaatsen. De respectieve dubbele resistente stam werd geëlektroporeerd om plasmide pBR-FLP en het TransFLP werkwijze voortgezet zoals hierboven beschreven plaats. De resulterende stam ontbrak geheel VPI-1 is bevestigd door PCR van genomisch DNA gezuiverd (Figuur 5B).
Voor het derde voorbeeld een geïntegreerd T7 RNA polymerase-afhankelijke promoter sequentie stroomopwaarts van een gen van belang, in ons geval het gen voor de belangrijke regulator van natuurlijke transformatie TFox 6. Dit werd gedaan met behulp van de TransFLP methode met een kleine wijziging van het standaard protocol: we waren de T7-RNA-afhankelijke promoter consensus sequentie volgens Ref. overhangen 14 als in de oligonucleotiden # 4 en # 5. Met deze strategie de T7 RNA polymerase promoter-afhankelijke sequentie werd gehouden op het chromosoom zelfs na de resistentie cassette werd uitgesneden (Figuur 6). We integreerden het construct in V. cholerae stam ADVCH-T7POL, die T7 RNA polymerase gen gedreven door de lacUV5 promoter (Blokesch, ongepubliceerd) herbergt. Om te testen op de functionaliteit van het construct, namelijk de T7 RNA polymerase-afhankelijke expressie van TFox, we natuurlijke transformatie assays uitgevoerd in LB medium. De ouderstam nature niet veranderbaar onder deze omstandigheden door het ontbreken van TFox transcriptie in rijk medium en bij afwezigheid van zijn natuurlijke inducer chitine (Figuur 6). Dit fenotype onafhankelijk of het T7 RNA polymerase werd geïnduceerd door IPTG kunstmatig of niet (Figuur 6, lanen 1 en 2, respectively). De TransFLP gegenereerde stam ADVCH-T7POL-T7-TFox :: FRT, die T7 RNA polymerase-afhankelijke promoter bevat stroomopwaarts van het gen bevoegdheid TFox, inderdaad nature veranderbaar in rijk medium (figuur 6, lanen 3 en 4) . Door lekkage van de lacUV5 promoter in LB medium 15 het geproduceerde T7 RNA polymerase getranscribeerd al TFox van de T7 RNA polymerase promoter-afhankelijke zonder inductie. Dit stelde natuurlijke competentie en transformatie bevestiging van de functionaliteit van de geïntegreerde T7 RNA polymerase-afhankelijke promoter sequentie (Figuur 6, laan 3). Dit fenotype significant verbeterd door volledige inductie van het T7 RNA polymerase door toevoeging van de inductor van de lacUV5 promoter, IPTG (Figuur 6, laan 4).
Figuur 1.Stroomschema van de methode TransFLP. De zes punten beschreven in dit protocol worden opgesteld:.. 1) Bereiding van chitine vlokken, 2) Optioneel: Kunstmatige transformatie van V. cholerae met Flp recombinase coderende plasmide, 3.) Oligonucleotide ontwerp en polymerase kettingreactie;. 4) chitine geïnduceerde natuurlijke transformatie, 5) Verwijdering van selectieve cassette (s) door flp-recombinatie... 6) Plasmide uitharding Hier grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Schematische weergave van drie toepassingsmogelijkheden voor de TransFLP methode. I) Een 1458 bp DNA fragment dat het cholera toxine coderende genen ctxA en ctxB werd verwijderd zoals aangegeven door Δ. II) De ~ 40 kb Vibrio pathogeniteit eiland 1 (VPI-1 13)werd verwijderd van de wild-type stam. III) een T7 RNA polymerase promoter sequentie-afhankelijke (28 bp) stroomopwaarts van de geïntegreerde TFox gen. De rode rechthoek geeft aan de linker achter korte nucleotide-sequentie van een enkele FRT plaats 10. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Verklaring voor primer ontwerp en de prestaties van PCR op basis van de verwijdering van ctxAB. Panel A: Voor de 1e ronde van PCR genomisch DNA (gDNA) en plasmiden pROD17 12 en pBR-FRT-Kan-FRT respectievelijk diende als templates. De vereiste oligonucleotiden # 1 tot # 6. De primer # 2 / # 3 en # 4 / # 5 (bijvoorbeeld in inzet) ook nog aanzienlijke overlap met elkaar aan hun 5'-uiteinden. Panel B: Na de 2e ronde vanPCR, die is gebaseerd op de 1 ste ronde PCR fragmenten templates, lange fragment worden verkregen met primer paar # 1 + # 6. Klik hier om groter bedrag bekijken .
Figuur 4. Verwacht resultaat geïllustreerd voor de verwijdering ctxAB strategie. De oorspronkelijke stam (wild-type), de insertie mutant Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT en de uiteindelijke spanning Δ ctxAB :: FRT werden getest op hun genotypes. Panel A: Schematische weergave van de differentiatie vermogen van de primer pair ctx-CHK-en ctx-CHK-down, vooral met betrekking tot de excisie van het antibioticum cassette. Panel B: Whole bacteriële cellen werden gebruikt als matrijs in PCR-reacties. Om te controleren of de gewijzigde DNA-locus primers chk-up en CHK-down werden gebruikt. De geamplificeerde PCR fragmenten werden gescheiden door agarose gelelektroforese en gevisualiseerd met behulp van SYBR safe DNA vlek. Laan 1: Wild-type V. cholerae stam; laan 2: stam Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, baan 3: Δ ctxAB :: FRT. Verwachte PCR-fragment maten volgens paneel A worden aangegeven aan de rechterkant. L, 1kb ladder (Invitrogen). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. Strategie om de verwijdering van de genomische eiland verifiëren. Paneel A: Schema van Vibrio pathogeniteit eiland 1 (VPI-1) (vrij naar Ref 16; niet op schaal.). Voor de wild-type stam het gebied van belang is niet amplificeerbare door middel van standaard PCR en VPI-1-specifieke primers chk-en CHK-down (~ 40 kb). Dus een extraoligonucleotide annealing binnen de regio te worden verwijderd-werd toegepast (VC0817-back) samen met VPI-chk-up. Panel B: Representatieve resultaten gebruikmaking van genomisch DNA van de respectievelijke stammen als template en de primerparen bovengenoemde elke afbeelding. Stammen getest: Wild-type V. cholerae stam (laan 1), stam VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (laan 2), en ΔVPI-1 :: FRT (laan 3). Afmetingen van de PCR fragmenten zoals voorspeld in paneel A worden aangegeven aan de rechterkant. L, 1kb ladder (Invitrogen). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 6. Representatieve fenotype na het inbrengen van een kunstmatige promoter sequentie. De T7 RNA polymerase-afhankelijke promoter sequentie werd stroomopwaarts opgenomen van de bekwaamheid regulerende gen TFox met de metho TransFLPd (schets bovenstaande grafiek). De ouderlijke V. cholerae stam (ADVCH-T7POL) bevat een T7 RNA polymerase gen gedreven door de lacUV5 promoter. Grafiek: de ouderstam ADVCH-T7POL (lanen 1 en 2) en de stam gemanipuleerd door TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-TFox :: FRT, lanen 3 en 4) werden getest op natuurlijke transformeerbaarheid in de afwezigheid (lanen 1 en 3 ) of aanwezigheid van 1 mM IPTG (banen 2 en 4). Transformerende genomisch DNA werd uit stam A1552-LacZ-Kan 8. De transformatiefrequenties staan op de Y-as. <Dl, onder de detectielimiet van ~ 5 x 10 -8. ** P <0,01 (volgens student t-test van log-getransformeerde gegevens). Zwarte pijl met 'T7' tekst:. T7 RNA-polymerase-afhankelijke promotorsequentie Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De TransFLP hierboven beschreven werkwijze en elders 5 veelvuldig gebruikt in ons laboratorium. Het soort genetische manipulaties die haalbaar zijn onder andere: deletie van enkele genen en clusters, deletie van genomische eilanden (bijv. VPI-1), insertie van sequenties stroomopwaarts van een gen van belang (bijvoorbeeld, promotersequenties) en insertie van sequenties aan het einde van een specifiek gen (bijvoorbeeld coderend affinity tags).
Een import voorwaarde voor TransFLP is dat de respectieve V. cholerae stam is natuurlijk transformeerbaar. Dit is niet altijd het geval, vooral in isolaten uit cholera patiënten. Dergelijke stammen zijn in het frequent gemuteerde quorum sensing circuit bijvoorbeeld in het gen dat codeert voor het belangrijke regulator van quorum sensing, HapR 17. Ondersteuningsmaatregelen een kopie van hapR herstelt de natuurlijke transformeerbaarheid in deze stammen 6 als exempligeschied voor HapR defectieve stam N16961 18.
Eventuele wijzigingen kunnen worden opgenomen, zoals de verrijking van de bacteriën na natuurlijke transformatie 8 in het geval de frequentie te laag. Let op de transformatiefrequentie het algemeen lager bij de pBR-plasmide flp reeds aanwezig terwijl je de chitine geïnduceerde natuurlijke transformatie assay. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een gedeeltelijke lekkage van de temperatuurgevoelige expressie van het gen van pBR flp-flp, hetgeen zou resulteren in voortijdige excisie van de antibioticumresistentie cassette en het onvermogen om te selecteren op deze transformanten. Wij adviseren daarom voor kritische zaken aan de pBR-flp plasmide te voegen na de natuurlijke transformatie stap.
Een andere belangrijke stap is de 2e ronde van PCR, die zal combineren de drie 1e hele PCR fragmenten. Het kan voorkomen dat gedeeltelijke fragmenten aanwezig zijn na de PCR reactie (bijvoorbeeld een gedeeltelijke assemblage van slechts fragmenten 'up' en 'FRT-Kan-FRT' volgens figuur 1). Deze te verwaarlozen is, kan als dubbele homologe recombinatie met het beoogde chromosomale gebied niet in deze situatie. Aangezien alleen transformanten die het op resistentie cassette worden geselecteerd, worden alle andere transformanten met niet gewenste DNA uitwisseling uitgesloten.
Een ander punt om in gedachten te houden is met betrekking tot de herhaling van de procedure voor meerdere rondes. We hebben al met succes combineerde de schrapping van de ctxAB gencluster met de schrapping van de pathogeniteit eiland (VPI-1) en een andere virulentie gencluster (Blokesch, niet gepubliceerd). Verder hebben we effectief geïntegreerd de T7 RNA-polymerase-afhankelijke promotor binnen deze stammen (upstream TFox en elders). Evenwel de beoogde genotype constant worden getest voor alle stam tussenproducten (bijvoorbeeld door kolonie PCR als demonstrated in figuur 4). Dit zal helpen om de ongewenste Flp-bemiddelde recombinatie van de achterblijvende FRT littekens (getoond als rode rechthoekige in alle figuren) sluiten met elkaar terwijl de pBR-plasmide flp nog aanwezig in de bacteriën. Dit kan waarschijnlijk worden meegerekend bij verte gelokaliseerde genen, de waarschijnlijkheid dat de excisie van het tussenliggende gebied zou dodelijk zijn vanwege de deletie van essentiële genen is zeer hoog.
Tot slot willen we het verwijderen van genen te bespreken binnen operons. We kunnen niet uitsluiten dat het verwijderen van een upstream-gen, dat een FRT litteken achterlaat, kan de expressie van de downstream-gen (en) te wijzigen. Opdat deze werking niet waarneembare fenotype veroorzaakt, maar dat dit inderdaad veroorzaakt door het verwijderen wordt een complementatie assay aanbevolen. Een andere controle die we al met succes toegepast in het laboratorium is de integratie van de FRT litteken stroomafwaarts van het gen-van-belang without verwijderen van de laatste. We hebben nog niet te houden aan dergelijke problemen in ons laboratorium, maar kan niet uitsluiten hun bestaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ik wil Olga de Souza Silva erkennen voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNSF) Subsidie 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
