Summary
Une méthode rapide pour modifier le génome d'
Abstract
Plusieurs méthodes sont disponibles pour manipuler les chromosomes bactériens 1-3. La plupart de ces protocoles reposent sur l'insertion des plasmides réplicatifs conditionnelle (par exemple abriter des réplicons pir-dépendants ou sensibles à la température 1,2). Ces plasmides sont intégrés dans les chromosomes bactériens basés sur l'homologie médiée par recombinaison. Ces mutants d'insertion sont souvent utilisés directement dans des cadres expérimentaux. En variante, la sélection pour l'excision du plasmide suivie par la perte peut être effectuée, pour laquelle les bactéries Gram négatif dépend souvent de l'enzyme contre-sélectionnable sucrase lévane codée par le gène sacB 4. L'excision pouvez restaurer le génotype de pré-insertion ou le résultat d'un échange entre le chromosome et la copie plasmidique du gène modifié. Un inconvénient de cette technique est qu'elle prend beaucoup de temps. Le plasmide doit être cloné premier, il nécessite de transfert horizontal V. cholerae la plupart (n otably par accouplement avec un E. coli souche donneuse) ou artificielle transformation de celui-ci, et l'excision du plasmide est aléatoire et peut soit restaurer le génotype initial ou créer la modification souhaitée si aucune sélection positive est exercée. Ici, nous présentons une méthode pour la manipulation rapide de l'V. chromosome cholerae (s) 5 (figure 1). Cette méthode est basée sur TransFLP la chitine récemment découvert à médiation par induction de compétence naturelle dans cette organisme représentatif 6 et d'autre du genre Vibrio tels que V. fischeri 7. Compétence naturelle permet l'absorption de l'ADN libre, y compris des fragments d'ADN générés par PCR. Une fois pris, l'ADN recombine avec le chromosome étant donné la présence d'un minimum de 250-500 pb de la région flanquante homologue 8. Comprenant un marqueur de sélection entre-deux de ces régions adjacentes permet une détection facile des transformants fréquentes.
t "> Cette méthode peut être utilisée pour différentes manipulations génétiques de V. cholerae et potentiellement d'autres bactéries naturellement compétentes. Nous fournissons trois exemples de nouvelles sur ce qui peut être accompli par cette méthode, en plus de notre étude précédemment publiée sur les suppressions monogéniques et le plus d'affinité tag séquences 5. Plusieurs étapes d'optimisation concernant le protocole initial de la chitine induite par la transformation naturelle 6 sont intégrés dans le présent protocole TransFLP. Ceux-ci comprennent entre autres le remplacement des fragments de coquilles de crabe en flocons disponible dans le commerce chitine 8, le don de la PCR dérivée d'ADN transformant en matériau 9, et l'ajout de sites cibles FLP-FRT recombinaison () 5. sites FRT permettre l'excision dirigée vers le site du marqueur de sélection par l'intermédiaire de la recombinase Flp 10.Protocol
La méthode TransFLP (figure 1) est illustrée par trois approches différentes: I) la suppression de deux gènes adjacents codant pour des déterminants de virulence de V. cholerae (par exemple, ΔctxAB), ii) l'élimination d'un îlot de pathogénicité (par exemple, ΔVPI-1), et iii) l'intégration d'une séquence T7 polymérase dépendante de l'ARN promoteur en amont d'un gène d'intérêt, ce qui permet par la suite de son expression artificielle dans le fond souche respective (par exemple, T7-TFox) (figure 2).
1. Préparation des flocons de chitine
- Poids 50-80 mg de flocons de chitine dans un tube en plastique standard de 1,5 ml. Cela peut être préparé en vrac. Flocons de chitine sont disponibles dans le commerce auprès de Sigma (cat. nombre C9213).
- Autoclaver les flocons de maintien des couvercles des tubes ouverts.
- Immédiatement fermer les paupières après l'autoclave est refroidi.
- Magasin autoclavé flocons de chitineà la température ambiante.
2. Option: Transformation artificielle de V. cholerae avec la recombinase FLP plasmide codant
- Préparer électrocompétentes V. cellules cholerae utilisant des méthodes standard 11. Stocker des aliquotes de cellules compétentes à -80 ° C.
- Ajouter 1-2 pl d'une mini-préparation régulière de plasmide pBR-flp 5 à la électrocompétentes V. cholerae et transférer les cellules du mélange dans une cuvette d'électroporation (0,2 cm largeur de l'intervalle).
- Appliquer une impulsion de 1,6 kV.
- Ajouter 0,9 ml milieu SOC, doucement transfert de cellule à une norme de tube 14 ml. Incuber non mobile de 2,5 à 3 h à 30 ° C.
- Plaque 100 ul et 300 ul sur des plaques LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline et incuber à 30 ° C pendant la nuit.
- Purifier clone unique et l'enregistrer comme stock de glycérol pour des expériences futures TransFLP.
3. Conception oligonucléotide et Polymerase Chain Reaction
- Au moins six oligonucléotides sont nécessaires pour amplifier la région d'ADN (s) d'intérêt ainsi que la FRT-cassettes antibiotique flanqué par PCR (figure 3). Il est recommandé d'inclure également une paire d'amorçage oligonucléotides en dehors du fragment inséré PCR. Cela permet de vérifier l'intégration et l'excision correcte de la cassette FRT-flanqué de résistance aux antibiotiques (par exemple, décrit comme «chk-up 'et les amorces« chk-down »dans les figures 3 à 5).
- Concevoir des oligonucléotides # 2, # 3, # 4 et # 5 avec soin. Ils devraient être en mesure de suffisamment recuit (par exemple, ~ 28 pb) à la matrice d'ADN. La matrice d'ADN est un ADN génomique (ADNg) pour les amorces n ° 2 et n ° 5 et FRT-Kan-FRT contenant l'ADN plasmidique comme pROD17 12 et pBR-FRT-KAN-FRT (cette étude) pour les amorces # 3 et # 4 ( La figure 3A).
- Concevoir des amorces # 2 à # 5 permettant vaste appariement de bases à leur extrémité 5 'entre # 2 / # 3 et # 4 / # 5, respectivement (figure 3A
- Effectuer trois réactions PCR indépendantes comme un 1 er tour de la PCR. La première sera amplifier la région en amont du gène / ADN région d'intérêt à l'aide d'oligonucléotides N ° 1 et N ° 2. La PCR devrait se traduire par un fragment d'au moins 500 pb de longueur pour permettre la recombinaison homologue dans les cellules. Des fragments plus courts (~ 250 pb) peut être de 8 suffisante, mais ne sont pas recommandés.
- En parallèle effectuer la deuxième PCR qui amplifie la cassette FRT-flanqué antibiotique. Pour les exemples fournis ici, nous avons surtout utilisé aph (kan R). Oligonucléotides utilisation n ° 3 et n ° 4 pour cette réaction (figure 3A).
- De façon concomitante, amplifier la région d'ADN en aval par PCR (troisième échantillon). Le fragment de PCR devrait également être d'au moins 500 pb de longueur. Effectuer la PCR avec ADNg comme matrice et les oligonucléotides # 5 et # 6 (figure 3A).
- Après purification PCR de tous les troisfragments, effectuez la 2 ème tour de la PCR. Utilisez un mélange à parts égales de chacun des trois fragments obtenus au premier tour en tant que modèle. L'amplification est catalysée par des oligonucléotides n ° 1 et n ° 6. Le fragment obtenu par PCR (figure 3B) sert de l'ADN transformant dans l'expérience la transformation naturelle (figure 1).
4. La chitine induite par la transformation naturelle
- Cultivez V. cholerae cellules en aérobiose dans un milieu riche à 30 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent une densité optique à 600 nm d'environ 0,5.
- Récolter les bactéries par centrifugation. Laver à granulés une fois dans un milieu artificiel défini (DASW 6) avant de remettre en suspension les cellules dans 2 volumes de DASW. Ajouter 1 ml de culture à 50-80 mg de flocons stériles chitine (expliqué au point 1). Si les bactéries port plasmide pBR-flp (facultatif point 2), ajouter l'ampicilline (50 ug / ml) à la culture. Incuber à 30 ° C pendant 16-24 heures sans mouvement.
- Ajouter & ge, 200 ng de la 2 e ronde PCR dérivé fragment (expliqué au point 3). Mélanger soigneusement sans beaucoup détacher les bactéries de la surface de chitine. Incuber à 30 ° C pendant 24 heures sans mouvement.
- Vortex de la culture extensive de ≥ 30 sec. Fais 100-300 ul sur des plaques de milieu LB sélectif (par exemple la kanamycine ou des plaques LB contenant de la gentamicine pour les exemples fournis ici). Utilisez deux plaques sélectives si les bactéries abriter le plasmide pBR-flp en ajoutant à l'ampicilline en association aux autres antibiotiques. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 16-24 heures ou jusqu'à ce que les colonies sont visibles.
- Isoler transformants simples à partir de plaques sélectives. Ces transformants ont remplacé le lieu d'origine chromosomique par le fragment de PCR en raison d'un événement croisée en double. Ces souches peuvent être directement utilisés pour d'autres expériences dans le cas où le retrait de la cassette antibiotique n'est pas nécessaire.
5. Retrait de la cassette sélectif (s) par Flp-Recombinaison
- Artificiellement transformer vos transformants avec le plasmide pBR-flp comme décrit au point 2 s'il n'est pas effectué avant l'essai de transformation naturelle.
- Cultiver les bactéries sur des plaques de gélose LB contenant de l'ampicilline à 37 ° C pendant 16-24 heures. Options: changer la température dans l'intervalle de 2-3 heures à 40 ° C comme expression de flp à partir du plasmide pBR-de-flp est réprimée à 5,10 températures plus élevées, bactéries transfert aux plaques fraîches après env. 8 heures d'incubation.
- Test de sensibilité aux antibiotiques (montré ici pour la kanamycine; figure 1) par restreaking les clones en parallèle sur des plaques d'agar contenant des antibiotiques et sans antibiotique. Isoler simples colonies sensibles. Congelez résistant à l'ampicilline clone comme stock de glycerol si vous avez l'intention de modifier encore la souche avec suppression autre / d'insertion en utilisant TransFLP.
6. Curage du plasmide
- Développer la culture du jour au lendemain dans des conditions aérobies età 30 ° C. Utilisez un milieu riche sans l'addition d'un antibiotique.
- En option: croissance de culture frais pour 3-6 heures par dilution de la culture d'une nuit 1:100 en eau douce milieu sans antibiotique.
- Dilution plaque ou série (s) de la culture sur plaque LB agar plaine (s) et incuber à 30 ° C pendant 8-16 heures (jusqu'à ce que les colonies sont visibles).
- Test de sensibilité à l'ampicilline des clones par restreaking les clones en parallèle sur des plaques de gélose contenant l'antibiotique et sans antibiotique (figure 1). Geler l'ampicilline souche sensible que les stocks de glycérol.
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Representative Results
Les résultats représentatifs des trois exemples sont présentés dans les figures 4 à 6. La première approche vise à supprimer les gènes voisins ctxA et ctxB. Ensemble, ils codent le facteur de virulence majeur de V. cholerae, la toxine cholérique. Nous avons conçu des oligonucléotides pour la méthode TransFLP comme décrit ci-dessus et conformément à la figure 3. La souche parentale, la souche intermédiaire hébergeant FRT de la cassette de résistance aux antibiotiques, flanquée au locus d'ADN d'origine de la souche et ctxAB finale supprimée pour ctxAB et libéré de la cassette de résistance ont tous été testés pour leur génotype (figure 4). La méthode de choix est la cellule entière PCR. Nous avons utilisé des amorces qui ne s'hybrident pas à la transformation fragment PCR mais uniquement à l'ADN chromosomique (figure 3). Cela nous a permis de vérifier l'échange spécifique au site du fragment PCR avec la région homologue du chromosome (Figure 4A). Les fragments de PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose norme pour déterminer leur taille (figure 4B). Cette stratégie peut être utilisée pour vérifier intermédiaires de déformation et de confirmer la construction souche finale (s).
Pour le deuxième exemple, la suppression d'un îlot génomique ensemble, nous avons choisi la pathogénicité de Vibrio île 1 (VPI-1) comme cible 13. La procédure décrite ci-dessus TransFLP norme a échoué dans ce cas. On l'a connu à partir des études précédentes qu'une telle région d'ADN de grande taille peut être remplacée par une région d'ADN de taille similaire en utilisant la chitine induite par la transformation naturelle 9. Nous avons donc émis l'hypothèse que la différence de taille entre la région-à-être-supprimé et l'assez court fragment de transformer PCR (<3,5 kb) pourrait être le facteur limitant. Nous avons donc décidé d'utiliser la méthode TransFLP en deux étapes: tout d'abord intégré le gène aph (kan R) précédée d'une seule FRSite de T au début de VPI-1 (illustré sur la figure 5A). Nous avons ensuite effectué un second tour de la transformation naturelle, qui nous a permis d'insérer une cassette de résistance aux antibiotiques supplémentaire (R g, conférant la résistance à la gentamicine) suivi d'un site FRT seconde à la fin de l'îlot de pathogénicité (figure 5A). La respectif double souche résistante a été soumis à une électroporation d'insérer plasmide pBR-flp et la méthode TransFLP a été poursuivi comme décrit ci-dessus. La souche résultante manquait l'ensemble VPI-1 tel que vérifié par PCR de l'ADN génomique purifié (figure 5B).
Pour le troisième exemple nous avons intégré une polymérase de T7-ARN dépendante séquence promotrice en amont d'un gène d'intérêt, dans notre cas, le gène codant pour le régulateur majeur de la transformation naturelle TFox 6. Cela a été fait en utilisant la méthode TransFLP avec une légère modification du protocole standard: nous avons inclus l'ARN T7 p dépendanteséquence consensus romoter selon Réf. 14 comme surplombs dans les oligonucléotides # 4 et # 5. Avec cette stratégie, la T7 polymérase dépendante de l'ARN séquence promotrice a été maintenu sur le chromosome même après la cassette de résistance aux antibiotiques a été excisée (figure 6). Nous avons intégré la construction dans V. cholerae souche ADVCH-T7POL, qui héberge le gène de la T7 ARN polymérase dirigée par le promoteur lacUV5 (Blokesch, non publié). Pour tester la fonctionnalité de la construction, à savoir la T7 ARN polymérase dépendante de l'expression de TFox, nous avons effectué des essais de transformation naturelles en milieu LB. La souche parentale n'est pas naturellement transformable dans ces conditions, en raison de l'absence de transcription TFox dans un milieu riche et en l'absence de son chitine inducteur naturel (figure 6). Ce phénotype est indépendante du fait que l'ARN polymérase T7 a été artificiellement induite par l'IPTG ou non (figure 6, lignes 1 et 2, respectively). Cependant, la souche TransFLP généré par ADVCH-T7POL-T7-TFox :: FRT, qui contient la T7 ARN polymérase dépendante de promoteur en amont du gène de la compétence TFox, était en effet naturellement transformable en milieu riche (figure 6, pistes 3 et 4) . En raison de la fuite du promoteur lacUV5 dans 15 milieu LB le produit T7 RNA polymérase TFox déjà transcrit à partir de l'ARN polymérase T7-dépendante promoteur sans induction. Cette compétence a lancé naturel et la transformation de confirmer la fonctionnalité de la séquence intégrée T7 ARN polymérase dépendante de promoteur (Figure 6, ligne 3). Ce phénotype a été considérablement amélioré par induction complète de l'ARN polymérase T7 due à l'addition de l'inducteur du promoteur lacUV5, de l'IPTG (figure 6, ligne 4).
Figure 1.Diagramme de la méthode TransFLP. Les six points décrits dans le présent protocole est rédigé:.. 1) Préparation des flocons de chitine; 2) En option: la transformation artificielle de V. cholerae par Flp recombinase plasmide codant;. 3) la conception d'oligonucléotides et de la réaction en chaîne par polymérase;. 4) La chitine induite par la transformation naturelle; 5) Retrait de la cassette sélective (s) par flp-recombinaison;... 6) durcissement plasmide Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Représentation schématique de trois possibilités d'application de la méthode TransFLP. I) un fragment d'ADN 1458 paires de bases, contenant la toxine cholérique codage des gènes ctxA et ctxB, a été supprimée, comme indiqué par Δ. II) Le ~ 40 kb Vibrio pathogène île 1 (VPI-1 13)a été supprimée à partir de la souche de type sauvage. III) A T7 polymérase dépendante de l'ARN séquence promotrice (28 pb) a été intégré en amont du gène TFox. Le rectangle rouge indique la gauche, derrière courte séquence nucléotidique d'un seul site FRT 10. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Explication de conception d'amorce et de la performance de la PCR basée sur la suppression de ctxAB. Panel A: Pour le 1 er tour de l'ADN génomique par PCR (ADNg) et des plasmides pROD17 12 et pBR-FRT-Kan-FRT, respectivement, ont servi de modèles. Les oligonucléotides sont nécessaires # 1 à # 6. L'apprêt # 2 / # 3 et # 4/5 (par exemple dans l'encadré) doivent également posséder un chevauchement important entre elles à leurs extrémités 5 '. Groupe B: Après le 2 e tour dePCR, qui est basée sur les fragments 1 er cycle de PCR en tant que modèles, un long fragment devrait être obtenus en utilisant paire d'amorces # 1 + # 6. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Résultat attendu exemple de la stratégie de suppression ctxAB. La souche d'origine (de type sauvage), le mutant d'insertion Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, et la finale souche Δ ctxAB :: FRT ont été testés pour leur génotype. Panel A: Représentation schématique de la puissance différenciation de la paire d'amorces ctx-chk-vous et ctx-chk-bas, notamment en ce qui concerne l'excision de la cassette antibiotique. Groupe B: cellules bactériennes entières ont été utilisés comme matrice dans des réactions de PCR. Pour vérifier l'ADN modifié locus amorces chk chk-vous et vers le bas ont été utilisés. Les fragments amplifiés par PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose et visualisés en utilisant l'ADN SYBR sûr tache. Piste 1: Wild-type V. souche cholerae; piste 2: souche Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT; piste 3: Δ ctxAB :: FRT. Attendus taille des fragments de PCR selon la partie A sont indiquées sur la droite. L, échelle 1kb (Invitrogen). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. Stratégie pour vérifier la suppression de l'îlot génomique. Panel A: Programme de la pathogénicité de Vibrio île 1 (VPI-1) (librement adapté de référence 16; pas à l'échelle.). Pour la souche de type sauvage de la région d'intérêt est non amplifiable au moyen de la PCR standard et les amorces VPI-1-spécifique chk chk-et-bas (~ 40 kb). Par conséquent, une plusoligonucléotide recuit dans la région pour-être-supprimé a été appliquée (VC0817-back) avec VPI-chk-up. Panneau B: résultat représentative en utilisant l'ADN génomique des souches respectives comme matrice et des paires d'amorces indiquées ci-dessus chaque image. Les souches testées: Wild-type V. cholerae souche (piste 1), la souche VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (piste 2), et ΔVPI-1 :: FRT (piste 3). Tailles des fragments de PCR comme prédit dans la partie A sont indiquées sur la droite. L, échelle 1kb (Invitrogen). Cliquez ici pour agrandir la figure .
La figure 6. Phénotype représentative après l'insertion d'une séquence de promoteur artificiel. Le T7 polymérase dépendante de l'ARN séquence promotrice a été intégrée en amont du gène TFox compétence réglementaire en utilisant la métho TransFLPd (esquisse graphique ci-dessus). Le parentale V. cholerae souche (ADVCH-T7POL) contient un gène de la T7 ARN polymérase dirigée par le promoteur lacUV5. Graphique: La souche parentale ADVCH-T7POL (pistes 1 et 2) et la souche manipulée par TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-TFox :: FRT; pistes 3 et 4) ont été testés pour transformabilité naturelle en l'absence (pistes 1 et 3 ) ou en présence de 1 mM IPTG (lignes 2 et 4). Transformer l'ADN génomique a été dérivé de la souche A1552-LacZ-Kan 8. Fréquences de transformation sont indiquées sur l'axe des ordonnées. <Dl, au-dessous de la limite de détection de ~ 5 x 10 -8. ** P <0,01 (tel que déterminé par le test t de Student de vous connecter données transformées). Flèche noire avec «T7» texte:. T7 ARN polymérase séquence promoteur dépendant Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
La méthode décrite ci-dessus et TransFLP ailleurs 5 a été largement utilisée dans notre laboratoire. Le genre de manipulations génétiques qui sont réalisables comprennent entre autres: la suppression de gènes individuels et groupes de gènes, la suppression des îlots génomiques (par exemple, VPI-1), l'insertion de séquences en amont d'un gène d'intérêt (par exemple, des séquences promotrices) et l'insertion de séquences à la fin d'un gène spécifique (par exemple, des marqueurs d'affinité d'encodage).
Une condition préalable pour l'importation TransFLP est que le respectif V. souche cholerae est naturellement transformable. Ce n'est pas toujours le cas, surtout dans les isolats provenant de patients atteints de choléra. De telles souches sont fréquemment muté dans le circuit de détection de quorum par exemple, dans le gène codant pour le régulateur principal de quorum sensing, HapR 17. Fournir une copie de revenir hapR restaure transformabilité naturel dans ces 6 souches que exempliFied pour la souche HapR défectueux N16961 18.
Les modifications éventuelles peuvent être incorporés, tels que l'enrichissement des bactéries après transformation naturelle 8 en cas la fréquence est trop faible. S'il vous plaît noter que la fréquence de transformation est en général faible dans le cas du plasmide pBR-flp est déjà présent tout en faisant l'essai de la chitine induite par la transformation naturelle. Ceci est probablement causé par une fuite partielle de l'expression sensible à la température du gène flp de pBR-flp, ce qui se traduirait par prématurée excision de la cassette de résistance aux antibiotiques et l'impossibilité de choisir pour ces transformants. Nous recommandons donc pour les cas critiques pour insérer le plasmide pBR-flp après l'étape de la transformation naturelle.
Une autre étape importante est le 2 ème tour de la PCR, qui combinera les 1 trois st-rondes fragments de PCR. Il peut arriver que des fragments partiels sont présents après la PCR raisonsction (par exemple, un assemblage partiel des fragments «haut» et «FRT-Kan-FRT" selon la figure 1). Ceci est négligeable, double recombinaison homologue à la région chromosomique ciblée ne peut pas se produire dans cette situation. Comme transformants hébergeant seulement la cassette de résistance aux antibiotiques sont choisis pour, tous les transformants avec d'autres échanges d'ADN non désirés sont exclus.
Un autre point à garder à l'esprit par rapport à la répétition de la procédure pendant plusieurs tours. Nous avons déjà réussi à combiner la suppression du groupe de gènes ctxAB avec la suppression de la pathogénicité (VPI-1) île et un autre cluster de gènes de virulence (Blokesch, non publié). En outre, nous avons effectivement intégré la T7 ARN polymérase dépendante de promoteur au sein de ces souches (en amont TFox et ailleurs). Toutefois, le génotype envisagé doit être testé en permanence pour tous les produits intermédiaires de déformation (par exemple, par PCR sur colonie que demonstrated sur la figure 4). Cela aidera à exclure la médiation indésirable Flp-recombinaison de la gauche derrière les cicatrices FRT (représentée ici en rouge rectangulaire dans toutes les figures) les uns avec les autres tout en le plasmide pBR-flp est toujours présent dans les bactéries. Cela peut sans doute être pris en compte aux gènes situés loin, comme la probabilité que l'excision de la région de l'entre-deux serait létale due à la délétion de gènes essentiels est très élevé.
Enfin, nous aimerions discuter de la suppression des gènes au sein opérons. Nous ne pouvons pas exclure que la suppression d'un gène en amont, ce qui laisse une cicatrice derrière FRT, peut changer l'expression du gène en aval (s). Afin de s'assurer que cet effet n'est pas l'origine du phénotype observable, mais que cela est bien causée par la suppression, un test de complémentation est recommandé. Un autre contrôle que nous avons déjà utilisée avec succès dans le laboratoire est l'intégration de l'aval cicatrice FRT de la withou gène d'intérêtt supprimant celui-ci. Nous n'avons pas observé de tels problèmes dans notre laboratoire, mais encore ne peut pas exclure leur existence.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Je tiens à souligner Olga De Souza Silva pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale suisse (FNS) Grant 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
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