Summary
Eine schnelle Methode, um das Genom zu ändern
Abstract
Mehrere Methoden stehen zur Verfügung, um zu manipulieren bakteriellen Chromosomen 1-3. Die meisten dieser Protokolle beruhen auf der Einbringung von konditional replizierende Plasmide (z. beherbergen pir-abhängigen oder temperaturempfindlichen Replikons 1,2). Diese Plasmide sind in bakteriellen Chromosomen auf Homologie-vermittelte Rekombination integriert. Solche Insertions-Mutanten werden häufig direkt in der experimentellen Einstellungen verwendet. Alternativ kann Selektion auf Plasmid Exzision durch seinen Verlust gefolgt durchgeführt werden, die für Gram-negative Bakterien häufig der Zähler wählbare Levansucrase Enzyms durch die sacB Gen 4 codiert wird. Die Excision kann entweder wieder die vor dem Einsetzen Genotyp oder führen zu einem Austausch zwischen dem Chromosom und dem Plasmid-kodierten Kopie des modifizierten Gens. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass es zeitraubend ist. Das Plasmid muss zuerst geklont werden, sondern erfordert horizontalen Transfer in V. cholerae (höchstens n otably durch Paarung mit einem E. coli Donor-Stamm) oder künstliche Umwandlung der letzteren, und die Exzision des Plasmids ist zufällig und kann entweder wieder die anfängliche Genotyp oder erzeugen die gewünschte Modifikation, wenn kein positiver Selektion ausgeübt wird. Hier präsentieren wir eine Methode für die schnelle Manipulation der V. cholerae-Chromosom (s) 5 (Abbildung 1). Diese TransFLP Verfahren basiert auf der kürzlich entdeckten Chitin-vermittelte Induktion der natürliche Kompetenz in diesem Organismus 6 und anderen Vertreter der Gattung Vibrio wie V. basierend fischeri 7. Natürliche Kompetenz ermöglicht die Aufnahme von freier DNA einschließlich PCR-generierten DNA-Fragmenten. Sobald aufgenommen, rekombiniert die DNA mit dem Chromosom bei Vorliegen einer minimalen von 250-500 bp der flankierenden homologen Bereich 8. Einschließlich einen Selektionsmarker in-zwischen diesen flankierenden Regionen ermöglicht eine einfache Erkennung von häufig auftretenden Transformanten.
t "> Diese Methode kann für verschiedene genetische Manipulationen von V. cholerae verwendet werden und möglicherweise auch andere natürlich kompetente Bakterien. Wir bieten drei neue Beispiele, was man mit dieser Methode zusätzlich zu unseren bereits veröffentlichten Studie auf einzelne Gen-Deletionen und durchgeführt werden Neben der Affinität-tag-Sequenzen 5. Mehrere Optimierungsschritte über die erste Protokoll von Chitin-induzierte natürliche Transformation 6 sind in diesem TransFLP Protokoll aufgenommen. Dazu gehören unter anderem der Austausch von Krabben Granatsplitter durch kommerziell erhältliche Chitin Flocken 8, die Spende von PCR abgeleiteten DNA als transformierenden Materials 9, und die Addition von FLP-Rekombination Zielstellen (FRT) 5. FRT erlauben ortsspezifische Exzision des Selektionsmarkers durch die Rekombinase Flp 10 vermittelt.Protocol
Die TransFLP Methode (Abbildung 1) durch drei verschiedene Ansätze exemplifiziert: I) die Deletion von zwei benachbarten Genen Virulenzeigenschaften V. cholerae (zB ΔctxAB), II) die Entnahme einer Pathogenitätsinsel (zB ΔVPI-1), und III) die Integration eines T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotorsequenz stromauf von einer Gen-von-Interesse, das anschließend erlaubt seinen künstliche Expression in dem jeweiligen Stamm Hintergrund (zB T7-tfox) (Abbildung 2).
Ein. Vorbereitung der Chitin Flakes
- Gewicht 50-80 mg von Chitin Flocken in einem Standard 1,5 ml Plastikröhrchen. Dies kann in Substanz hergestellt werden. Chitin Flocken sind kommerziell erhältlich von Sigma (Kat. Zahl C9213).
- Autoklavieren der Flocken halten die Deckel der Rohre offen.
- Schließen Sie sofort die Deckel nach dem Autoklav abgekühlt hat.
- Shop autoklaviert Chitin Flockenbei Raumtemperatur.
2. Optional: Artificial Transformation von V. cholerae mit Flp-Rekombinase-kodierende Plasmide
- Bereiten elektrokompetente V. cholerae Zellen unter Verwendung von Standardverfahren 11. Aliquots speichern kompetenter Zellen bei -80 ° C
- Fügen Sie 1-2 ul einer regelmäßigen Mini-Präparation von Plasmid pBR-flp 5 zum elektrokompetente V. cholerae-Zellen und Übertragen der Mischung in eine Elektroporation Küvette (0,2 cm Spaltbreite).
- Tragen Sie einen Puls bei 1,6 kV.
- Fügen Sie 0,9 ml SOC-Medium, übertragen Sie leicht Zelle zu einer Standard-14-ml-Tube. Inkubieren unbewegten für 2,5 bis 3 Stunden bei 30 ° C.
- Tafel 100 ul und 300 ul auf LB-Platten mit 100 ug / ml Ampicillin und inkubieren bei 30 ° C über Nacht.
- Entschlacken einzigen Klon und speichern wie Glycerin Lager für zukünftige TransFLP Experimente.
3. Oligonukleotid Design und Polymerase-Kettenreaktion
- Mindestens sechs Oligonukleotiden erforderlich sind, um die DNA-Region (en) von Interesse als auch die FRT-Kassette flankiert Antibiotikums durch PCR (Abbildung 3) zu amplifizieren. Es empfiehlt sich, auch ein Paar von Oligonukleotiden Priming außerhalb des PCR-Fragment eingefügt. Dies ermöglicht die Überprüfung der Integration und Excision des korrekten FRT-flankiert Antibiotikaresistenz Kassette (z. B. als "CHK-up" und "CHK-down"-Primer in den 3 bis 5 dargestellt).
- Entwerfen der Oligonukleotide # 2, # 3, # 4 und # 5 mit Sorgfalt. Sie sollten in der Lage sein, ausreichend annealen (zB ~ 28 bp) an die Template-DNA. Der Template-DNA genomische DNA ist (gDNA) zum Primern # 2 und # 5 und FRT-Kan-FRT-enthaltenden Plasmid-DNA, wie pROD17 12 und pBR-FRT-KAN-FRT (diese Studie) zum Primern # 3 und # 4 ( 3A).
- Design Die Primer # 2 bis # 5 ermöglicht eine umfassende Basenpaarung an ihrem 5'-Ende zwischen Nr. 2 / Nr. 3 und Nr. 4 / Nr. 5 bzw. (3A
- Führen Sie drei unabhängige PCR-Reaktionen als 1 Runde der PCR. Die erste wird amplifizieren die upstream-Region des Gens / DNA-Bereich-von-Interesse mit Hilfe der Oligonukleotide Nr. 1 und Nr. 2. Das PCR sollte in einem Fragment von mindestens 500 bp in der Länge um eine homologe Rekombination in den Zellen ermöglichen führen. Kürzere Fragmente (~ 250 bp) eine ausreichende 8 sein, aber werden nicht empfohlen.
- Parallel führt die zweite PCR, die die FRT-Kassette flankiert Antibiotikum verstärkt. Für die Beispiele hier bereitgestellten wir hauptsächlich verwendet aph (kan R). Verwendung Oligonukleotiden # 3 und # 4 für diese Reaktion (Abbildung 3A).
- Begleitend verstärken die stromabwärts gelegenen DNA-Bereich durch PCR (drittes Beispiel). Das PCR-Fragment sollte ebenfalls mindestens 500 bp in der Länge sein. Durchführen der PCR mit gDNA als Template und Oligonukleotide # 5 und # 6 (Abbildung 3A).
- Nach Reinigung aller drei PCRFragmente, führen Sie die 2. Runde der PCR. Verwenden Sie die gleiche Mischung aus allen drei Fragmente in der ersten Runde als Vorlage erhalten. Die Verstärkung wird durch Oligonukleotide Nr. 1 und Nr. 6 katalysiert. Das resultierende PCR-Fragment (3B) als transformierende DNA in der natürlichen Transformation Experiment (Abbildung 1).
4. Chitin-induzierte Natural Transformation
- Wachsen V. cholerae Zellen aerob in Vollmedium bei 30 ° C, bis sie eine optische Dichte erreicht bei 600 nm von etwa 0,5.
- Ernte der Bakterien durch Zentrifugieren. Waschen Pellet einmal in definierten künstlichen Medium (DASW 6) vor Resuspendieren der Zellen in 2 Volumina DASW. 1 ml der Kultur auf 50-80 mg steriles Chitin Flocken (erläutert unter Punkt 1). Wenn Bakterien Hafen Plasmid pBR-flp (optional Punkt 2), Add Ampicillin (50 ug / ml) zu der Kultur. Inkubation bei 30 ° C für 16-24 Stunden ohne Bewegung.
- Add & ge; 200 ng des 2 nd-Runde PCR-abgeleiteten Fragment (erläutert unter Punkt 3). Vorsichtig mischen, ohne ausgiebig Ablösen der Bakterien von den Chitin Oberflächen. Inkubieren bei 30 ° C für 24 Stunden ohne Bewegung.
- Vortex die Kultur ausgiebig für ≥ 30 sec. Verteilt 100-300 ul auf selektiven LB-Medium-Platten (zB Kanamycin oder Gentamicin-haltigen LB-Platten für die bereitgestellten Beispiele hier). Verwenden Sie doppelt selektiven Platten, wenn die Bakterien, die das Plasmid pBR-flp indem Ampicillin gleichzeitig die übrigen Antibiotika beherbergen. Inkubieren Platten bei 30 ° C für 16-24 h oder bis Kolonien sichtbar.
- Isolieren einzelner Transformanten von selektiven Platten. Solche Transformanten haben den ursprünglichen chromosomalen Locus durch die PCR-Fragment durch eine doppelte Crossover-Ereignis ersetzt. Diese Stämme können direkt für weitere Versuche verwendet werden, falls das Entfernen des Antibiotikums Kassette nicht notwendig ist.
5. Entfernung von Selective Cassette (s) durch Flp-Rekombination
- Künstlich verwandeln Sie Ihr Transformanten mit Plasmid pBR-flp wie unter Punkt 2 beschrieben, wenn nicht vor dem natürlichen Transformation Assay.
- Die Bakterien wachsen auf LB-Agarplatten mit Ampicillin bei 37 ° C für 16-24 Stunden. Optionen: Ändern Sie die Temperatur zwischen 2-3 Stunden auf 40 ° C als Ausdruck flp aus dem Plasmid pBR-flp bei höheren Temperaturen 5,10 de-unterdrückt; Übertragung Bakterien auf frische Platten nach ca. 8 h Inkubation.
- Test für Antibiotika-Empfindlichkeit (hier für Kanamycin gezeigt; Abbildung 1) durch restreaking die Klone parallel auf Antibiotika-haltigen und Antibiotika-freien Agarplatten. Isolieren einzelner sensitive Kolonien. Frieren Ampicillin-resistente Klon als Glycerin Lager, wenn Sie weiter zu modifizieren die Belastung mit anderen Deletion / Insertion mit TransFLP wollen.
6. Plasmid Curing
- Wachsen Kultur über Nacht unter aeroben Bedingungen undbei 30 ° C. Verwenden Vollmedium ohne Zusatz von Antibiotika.
- Optional: Wachsen frische Kultur für 3-6 Stunden durch Verdünnen der Übernachtkultur 1:100 in frischem Antibiotika-freien Mediums.
- Platte oder Streifen Verdünnung (n) der Kultur auf einfache LB-Agarplatte (en) und Inkubation bei 30 ° C für 8-16 h (bis Kolonien sichtbar sind).
- Test auf Ampicillin-Sensitivität der Klone durch restreaking die Klone, die parallel auf Antibiotikum-haltigen und Antibiotika-freien Agarplatten (Abbildung 1). Frieren Ampicillin-sensitiven Stamm wie Glycerin Lager.
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse der drei Beispiele sind in den 4 bis 6 gezeigt. Der erste Ansatz, der die Streichung der benachbarten Gene ctxA und ctxB soll. Gemeinsam codieren die wichtigsten Virulenzfaktor von V. cholerae, Cholera-Toxin. Wir entwickelten Oligonukleotiden zur TransFLP Verfahren wie oben beschrieben und gemäß 3. Die elterliche Stamm wurden die Zwischenschicht Stamm, die FRT-flankiert Antibiotikaresistenz Kassette in der ursprünglichen DNA-Lokus ctxAB und der endgültige Belastung für ctxAB gelöscht und befreite des Resistenzkassette alle für ihre Genotyp getestet (Abbildung 4). Die Methode der Wahl war whole-cell PCR. Wir verwendeten Primern, die nicht zum Transformieren PCR Fragment sondern nur auf chromosomale DNA (Abbildung 3) haben annealen. Dies ermöglichte es uns, die ortsspezifischen Austausch des PCR-Fragments mit der homologen Region des Chromosoms (F überprüfenBBILDUNG 4A). Die PCR-Fragmente wurden durch Standard-Agarosegel-Elektrophorese getrennt, um ihre Größe zu bestimmen (4B). Diese Strategie kann verwendet werden, um Stamm Zwischenprodukte zu überprüfen und das endgültige Dehnung Konstrukt (en) zu bestätigen.
Für das zweite Beispiel die Entfernung eines ganzen genomische Insel, wählten wir die Vibrio Pathogenitätsinsel 1 (VPI-1) als Ziel 13. Der Standard TransFLP oben beschriebenen Verfahren wurde dabei nicht erfolgreich. Es wurde aus früheren Studien bekannt, daß eine so große DNA-Bereich durch einen ähnlich großen DNA-Region mit Chitin-induzierte natürlichen Transformation 9 ausgetauscht werden können. Wir haben daher die Hypothese auf, dass der Größenunterschied zwischen der Region zu-gelöscht werden und die relativ kurzen Transformieren PCR-Fragment (<3,5 kb) könnte der limitierende Faktor sein kann. Wir haben daher beschlossen, die TransFLP Verfahren in zwei Schritten verwenden: wir zuerst die APH-Gen (kan R) vorangestellt durch einen einzelnen FR integriertT-Stelle am Beginn der VPI-1 (dargestellt in 5A). Wir haben dann durchgeführt, eine zweite Runde der natürlichen Transformation, die uns eine zusätzliche Antibiotika-Resistenz-Kassette (gm R, verleiht Gentamicinresistenz) durch einen zweiten FRT-Stelle am Ende der Pathogenität Insel (5A), gefolgt einzufügen erlaubt. Die jeweilige Doppel-resistenten Stamm elektroporiert, um Plasmid pBR-flp und die TransFLP Methode wurde wie oben beschrieben fortgesetzt einzufügen. Der resultierende Stamm fehlte die gesamte VPI-1, wie durch PCR der gereinigte genomische DNA (5B) verifiziert.
Für das dritte Beispiel enthält einen T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotorsequenz integriert stromaufwärts eines Gens von interessierenden, in unserem Fall der kodierenden Gens wichtiger Regulator der natürlichen Transformation tfox 6. Dies geschah mit dem TransFLP Methode mit einer leichten Modifikation der Standard-Protokoll: Wir waren die T7 RNA-abhängige promoter Konsensussequenz nach Lit.. Überhänge 14 als in den Oligonukleotiden # 4 und # 5. Mit dieser Strategie der T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor-Sequenz wurde auf dem Chromosom selbst nachdem das Antibiotikum Resistenzkassette herausgeschnitten wurde (Abbildung 6) gehalten wird. Wir integrieren das Konstrukt in V. Cholera-Stamm ADVCH-T7POL, die die T7-RNA-Polymerase-Gen durch die lacUV5 Promotor (Blokesch, unveröffentlicht) angetrieben birgt. Um für die Funktionalität des Konstrukts testen, nämlich die T7-RNA-Polymerase-abhängige Expression von tfox führten wir natürlichen Transformation Assays in LB-Medium. Der elterliche Stamm nicht natürlich transformierbar unter diesen Bedingungen aufgrund der mangelnden tfox Transkription in reichem Medium und in Abwesenheit des natürlichen Induktor Chitin (Abbildung 6). Dieser Phänotyp war unabhängig davon, ob die T7-RNA-Polymerase wurde künstlich durch IPTG induziert oder nicht (6, Bahnen 1 und 2, respectively). Jedoch war die TransFLP generierte Stamm ADVCH-T7POL-T7-tfox :: FRT, das die T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor enthält stromaufwärts des Gens Kompetenz tfox zwar natürlich transformierbaren in Vollmedium (6, Spuren 3 und 4) . Aufgrund der Leckage des lacUV5-Promotors in LB-Medium 15 das erzeugte T7-RNA-Polymerase transkribiert tfox bereits aus der T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor ohne Induktion. Dies initiiert natürliche Kompetenz und Transformation die Funktionsfähigkeit des integrierten T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor-Sequenz (Figur 6, Spur 3). Dieser Phänotyp wurde signifikant durch die vollständige Induktion der T7-RNA-Polymerase durch Zugabe der Induktor des lacUV5-Promotor, IPTG (Figur 6, Spur 4) verbessert.
Abbildung 1.Flussdiagramm des TransFLP Methode. Die sechs Punkte in diesem Protokoll beschriebenen entworfen:.. 1) Herstellung von Chitin Flocken; 2) Optional: Artificial Transformation von V. cholerae mit Flp-Rekombinase-kodierende Plasmid;. 3) Oligonukleotid Design und Polymerasekettenreaktion;. 4) Chitin-induzierte natürlichen Transformation; 5) Entfernen der selektiven Kassette (n) durch Flp-Rekombination;... 6) Plasmid Härtung hier Klicken größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Schematische Darstellung der drei Einsatzmöglichkeiten für die TransFLP Methode. I) A 1458 bp DNA-Fragment, welches das Cholera-Toxin kodierende Gene ctxA und ctxB, wurde gestrichen, da durch Δ angezeigt. II) Die ~ 40 kb Vibrio Pathogenitätsinsel 1 (VPI-1 13)wurde aus dem Wildtyp-Stamm gelöscht. III) A T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor-Sequenz (28 bp) wurde stromaufwärts des tfox Gens integriert. Das rote Rechteck zeigt die links hinter kurzen Nukleotidsequenz eines einzigen FRT-Stelle 10. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. Erklärung für die Primer-Design und Durchführung von PCR zur Streichung des ctxAB basiert. Panel A: Für die 1. PCR-Runde genomische DNA (gDNA) und Plasmide pROD17 12 und pBR-FRT-Kan-FRT jeweils als Template diente. Die erforderlichen Oligonukleotide # 1 bis # 6. Der Primer # 2 / # 3 und # 4 / # 5 (beispielsweise in Einschub) sollen auch über signifikante Überlappung miteinander an ihren 5'-Enden. Panel B: Nach der 2. Runde derPCR, die auf den 1. Runde PCR-Fragmente als Vorlagen, ein langes Fragment unter Verwendung Primerpaar # 1 + # 6 werden sollte basiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 4. Erwartetes Ergebnis für die ctxAB Streichung Strategie veranschaulicht. Der ursprüngliche Stamm (Wildtyp), die Insertions-Mutante Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, und die endgültige Belastung Δ ctxAB :: FRT wurden für ihre Genotypen getestet. Panel A: Schematische Darstellung der Differenzierung Leistung des Primerpaars ctx-CHK-up und ctx-CHK-down, vor allem in Bezug auf die Excision des Antibiotikums Kassette. Panel B: Gesamter Bakterienzellen wurden als Matrize in PCR-Reaktionen verwendet. Um der veränderten DNA überprüfen locus Primer chk-und chk-down verwendet wurden. Die amplifizierten PCR-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht mit SYBR sicheren DNA färben. Lane 1: Wild-Typ V. Cholera-Stamm, Spur 2: strain Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT; Spur 3: Δ ctxAB :: FRT. Erwartete PCR-Fragment Größen nach Panel A sind auf der rechten Seite angezeigt. L, 1kb ladder (Invitrogen). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 5. Strategie, um das Löschen der genomischen Insel zu überprüfen. Panel A: Schema der Vibrio Pathogenitätsinsel 1 (VPI-1) (frei aus Lit. 16; nicht maßstabsgetreu.). Für den Wildtypstamm die interessierende Region nicht-amplifizierbar mittels Standard-PCR und der VPI-1-spezifische Primer CHK-up und CHK-down (~ 40 kb). Daher ein zusätzlicherOligonukleotid Glühen innerhalb der Region an--gelöscht werden angewendet wurde (VC0817-back) zusammen mit VPI-chk-up. Panel B: Repräsentative Ergebnisses unter Verwendung genomischer DNA der jeweiligen Stämme als Matrize und der Primer-Paare oben angegebene jedes Bild. Stämme getestet: Wild-Typ V. cholerae Stamm (Spur 1), Stamm VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (Spur 2) und ΔVPI-1 :: FRT (Bahn 3). Größen der PCR-Fragmente, wie in Tafel A vorhergesagt werden auf der rechten Seite angegeben. L, 1kb ladder (Invitrogen). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 6. Vertreter Phänotyp nach dem Einsetzen eines künstlichen Promotorsequenz. Die T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotorsequenz wurde stromaufwärts von der Kompetenz Regulatorgen tfox Verwendung des TransFLP metho integriertd (Skizze oben Grafik). Die elterliche V. cholerae-Stamm (ADVCH-T7POL) enthält einen T7-RNA-Polymerase-Gen durch den lacUV5-Promotor gesteuert. Chart: Die Elternstamm ADVCH-T7POL (Bahnen 1 und 2) und der Stamm durch TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-tfox :: FRT; Bahnen 3 und 4) manipuliert wurden für natürliche Transformierbarkeit in Abwesenheit geprüft (Bahnen 1 und 3 ) oder Gegenwart von 1mM IPTG (Bahnen 2 und 4). Transformieren genomische DNA wurde aus dem Stamm A1552-LacZ-Kan 8 abgeleitet. Transformationsfrequenzen sind auf der Y-Achse gegeben. <Dl, unterhalb der Nachweisgrenze von ca. 5 x 10 -8. ** P <0.01 (t-Test, wie durch Schülers von transformierten Log-Daten bestimmt). Schwarzer Pfeil mit dem Text "T7":. T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotorsequenz Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Die TransFLP oben beschriebenen Methode und anderswo 5 wurde ausgiebig in unserem Labor verwendet. Die Art der genetischen Manipulationen, die durchführbar sind, umfassen unter anderem: Deletion einzelner Gene und Gencluster, Deletion Genominseln (zB VPI-1), Insertion von Sequenzen stromaufwärts eines Gens von Interesse (z. B. Promotorsequenzen) und Einführen Sequenzen am Ende eines spezifischen Gens (zB Codierung Affinitätstags).
Ein Import Voraussetzung für TransFLP ist, dass die jeweiligen V. cholerae-Stamm ist natürlich transformierbar. Dies ist manchmal nicht der Fall, insbesondere bei Isolaten von Cholera-Patienten stammt. Solche Stämme werden häufig innerhalb des Quorum Sensing-Schaltung zB mutierte innerhalb der kodierenden Gens wichtiger Regulator des Quorum Sensing, HapR 17. Providing wieder eine Kopie des hapR wieder natürliche Wandlungsfähigkeit in diesen Stämmen 6 als exempliFied für die HapR-defekte Stamm N16961 18.
Mögliche Modifikationen können eingearbeitet werden, wie beispielsweise die Anreicherung der Bakterien nach natürlichen Transformation 8 steht, wenn die Frequenz zu niedrig ist. Bitte beachten Sie, dass die Transformation Frequenz im allgemeinen niedriger ist im Falle der pBR-flp Plasmid bereits vorhanden ist, während Sie das Chitin-induzierte natürliche Transformation Test. Dies wird wahrscheinlich durch teilweise Austreten des temperaturempfindlichen Expression des Gens von pBR flp-flp, die zu vorzeitigem Exzision des Antibiotikum-Resistenz-Kassette und die Unfähigkeit, für diese Transformanten zu selektieren führen würde verursacht. Wir bitten daher um kritischen Fällen wird empfohlen, die pBR-flp Plasmid nach dem natürlichen Wandel Schritt einzufügen.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die 2. Runde der PCR, die die drei 1 st-Runde PCR-Fragmenten kombiniert werden. Es kann vorkommen, dass Teilfragmente vorhanden sind nach der PCR reaktion (zB eine partielle Montage nur Fragmente 'up' und 'FRT-Kan-FRT "nach Abbildung 1). Dies ist vernachlässigbar, kann als doppelt homologe Rekombination mit dem gezielten chromosomalen Bereich in dieser Situation nicht auftreten. Da nur Transformanten, die das Antibiotikum Resistenzkassette zur ausgewählt sind, werden alle anderen Transformanten mit nicht gewünschten DNA Austausch ausgeschlossen.
Ein weiterer Punkt zu beachten ist, in Bezug auf die Wiederholung der Prozedur für mehrere Runden. Wir haben bereits erfolgreich die Streichung des ctxAB Gencluster mit der Streichung der Pathogenität Insel (VPI-1) und anderen Virulenzgen Cluster (Blokesch, unveröffentlicht) kombiniert. Darüber hinaus haben wir effektiv die T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor innerhalb dieser Stämme (upstream tfox und anderswo) integriert ist. Allerdings sollte die vorgesehen Genotyp ständig für alle Zwischenprodukte Stamm getestet werden (zB durch Kolonie-PCR als demonstrated in 4). Dies wird helfen, die unerwünschte Flp-vermittelte Rekombination des linken hinter FRT Narben (gezeigt als roten rechteckigen in allen Figuren) miteinander auszuschließen, während der pBR-flp Plasmid ist noch in den Bakterien. Dies ist vermutlich für weit entfernten Genen vernachlässigt werden, da die Wahrscheinlichkeit, dass das Ausschneiden des dazwischen Region wäre aufgrund der letalen Deletion essentieller Gene ist sehr hoch.
Schließlich möchten wir die Deletion von Genen in Operons zu diskutieren. Es ist nicht ausgeschlossen, dass die Deletion eines Upstream-Gen, das eine Narbe FRT hinterlässt, kann die Expression des stromabwärts Gen (e) ändern. Um sicherzustellen, dass dieser Effekt ist nicht die Ursache der beobachtbaren Phänotyp, sondern dass dies in der Tat durch die Deletion ist eine Ergänzung Test empfohlen. Ein weiteres Steuerelement, das haben wir bereits erfolgreich im Labor verwendet wird, ist die Integration der FRT Narbe hinter dem Gen-of-interest without Löschen des letzteren. Konnten wir nicht beobachten solche Probleme in unserem Labor noch nicht, aber kann nicht ausschließen, ihre Existenz.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Ich möchte Olga de Souza Silva für die technische Unterstützung zu bestätigen. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) Grant 31003A_127029 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
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