Summary
Un metodo rapido per modificare il genoma di
Abstract
Sono disponibili diversi metodi per manipolare cromosomi batterici 1-3. La maggior parte di questi protocolli invocare l'inserimento di plasmidi replicativi condizionale (es. ospitano repliconi pir-dipendenti ovvero termosensibili 1,2). Questi plasmidi sono integrati in cromosomi batterici basati su omologia-mediata ricombinazione. Tali mutanti inserzionali sono spesso direttamente utilizzati in contesti sperimentali. In alternativa, la selezione per escissione plasmide seguita dalla perdita può essere eseguita, per cui batteri Gram-negativi dipende spesso contro-selezionabile enzimatico saccarasi Levan codificata dal gene sacB 4. L'escissione può ripristinare il pre-inserimento genotipo o provocare uno scambio tra il cromosoma e il plasmidica copia del gene modificato. Uno svantaggio di questa tecnica è che richiede tempo. Il plasmide deve essere clonato prima, richiede trasferimento orizzontale in V. cholerae la maggior parte (n otably con l'accoppiamento con una E. coli ceppo donatore) o trasformazione artificiale di quest'ultimo, e l'escissione del plasmide è casuale e può ripristinare il genotipo iniziale o creare la modifica desiderata in assenza di selezione positiva viene esercitata. Qui, presentiamo un metodo per la manipolazione rapida V. cholerae cromosoma (s) 5 (Figura 1). Questo metodo TransFLP si basa sulla recente scoperta chitina-mediata induzione di competenza naturale in questo organismo rappresentativo 6 e altri del genere Vibrio come V. fischeri 7. Competenza naturale permette l'assunzione di DNA libero tra cui PCR generati frammenti di DNA. Una volta assunto, il DNA ricombina con il cromosoma data la presenza di un minimo di 250-500 bp fiancheggianti della regione omologa 8. Compreso un marcatore di selezione in-tra le regioni a fianco permette la facile individuazione dei trasformanti frequenti.
t "> Questo metodo può essere utilizzato per diverse manipolazioni genetiche V. cholerae e batteri naturalmente competenti potenzialmente anche altri. Forniamo tre esempi nuovi su ciò che può essere realizzato con questo metodo, oltre al nostro studio precedentemente pubblicato sul gene delezioni singole e la aggiunta di affinità-tag sequenze 5. procedura di ottimizzazione in materia di protocollo iniziale di chitina-trasformazione indotta naturale 6 sono incorporati nel presente protocollo TransFLP., tra cui tra l'altro la sostituzione di frammenti di conchiglie granchio disponibile in commercio da chitina fiocchi 8, la donazione di PCR derivato da DNA trasformante materiale 9, e l'aggiunta di FLP-ricombinazione siti bersaglio (FRT) 5. siti FRT consentono escissione sito-diretta del marcatore di selezione mediata dalla ricombinasi Flp 10.Protocol
Il metodo TransFLP (Figura 1) è esemplificato da tre diversi approcci: I) la delezione di due geni adiacenti codificano determinanti di virulenza di V. cholerae (ad esempio, ΔctxAB), II), la rimozione di un'isola patogenicità (ad esempio, ΔVPI-1) e iii) l'integrazione di una sequenza polimerasi dipendente dal promotore T7 RNA monte di un gene d'interesse, che consente successivamente il suo espressione artificiale in background ceppo corrispondente (ad esempio, T7-TFox) (Figura 2).
1. Preparazione di fiocchi chitina
- Peso 50-80 mg di fiocchi chitina in un tubo di plastica standard da 1,5 ml. Questo può essere preparato in bulk. Fiocchi di chitina sono disponibili in commercio da Sigma (cat. numero C9213).
- Autoclavare i fiocchi mantenendo i coperchi dei tubi aperto.
- Immediatamente chiudere i coperchi dopo l'autoclave si è raffreddato.
- Conservare autoclavato chitina fiocchia temperatura ambiente.
2. Opzionale: trasformazione artificiale di V. cholerae con ricombinasi Flp-plasmide codificante
- Preparare electrocompetent V. cellule cholerae utilizzando metodi standard 11. Memorizzare aliquote di cellule competenti a -80 ° C.
- Aggiungere 1-2 ml di un normale mini-preparazione del plasmide PBR-FLP 5 al electrocompetent V. cellule cholerae e trasferire il composto in una cuvetta elettroporazione (0,2 fessura cm).
- Applicare un impulso a 1,6 kV.
- Aggiungere 0,9 ml di terreno SOC, delicatamente trasferire cella a una standard 14 ml tubetto. Incubare non in movimento per 2,5 a 3 ore a 30 ° C.
- Piastra 100 ul e 300 ul su piastre LB contenenti 100 pg / ml di ampicillina e incubare a 30 ° C per una notte.
- Purificare singolo clone e negozio come stock in glicerolo per esperimenti TransFLP futuri.
3. Progettazione Oligonucleotide e Polymerase Chain Reaction
- Almeno sei oligonucleotidi sono necessari per amplificare la regione di DNA (s) di interesse e l'FRT-fiancheggiato cassetta antibiotico mediante PCR (Figura 3). Si raccomanda di includere anche una coppia di oligonucleotidi innesco fuori del frammento inserito PCR. Ciò consente il controllo per l'integrazione e escissione corretta FRT-fiancheggiato cassette resistenza agli antibiotici (ad esempio raffigurato come 'chk-up' e 'chk-down' primer nelle figure 3 a 5).
- Progettare gli oligonucleotidi # 2, # 3, # 4 e # 5 con cura. Essi dovrebbero essere in grado di ricottura sufficiente (ad es ~ 28 bp) al DNA stampo. Il DNA stampo il DNA genomico (gDNA) per i primer # 2 e # 5 e FRT-Kan-FRT-DNA plasmide contenente come pROD17 12 e pBR-FRT-KAN-FRT (questo studio) per i primer # 3 e # 4 ( Figura 3A).
- Progettare i primer # 2 a # 5 che consente ampia base-accoppiamento alla loro 5'-end tra # 2 / # 3 e # 4 / # 5, rispettivamente (Figura 3A
- Eseguire tre reazioni PCR indipendenti come un giro 1 ° di PCR. Il primo sarà amplificare la regione a monte del gene / DNA regione d'interesse con l'ausilio di oligonucleotidi # 1 e # 2. La PCR dovrebbe risultare in un frammento di almeno 500 bp di lunghezza per consentire ricombinazione omologa all'interno delle cellule. Brevi frammenti (~ 250 bp) può essere sufficiente 8 ma non sono raccomandati.
- Parallelamente effettuare la seconda PCR, che amplifica la cassetta FRT-fiancheggiata antibiotico. Per gli esempi forniti qui abbiamo usato principalmente aph (kan R). Oligonucleotidi uso # 3 e # 4 di questa reazione (Figura 3A).
- Allo stesso tempo, amplificare la regione a valle del DNA mediante PCR (terzo campione). Il frammento PCR deve essere almeno 500 bp di lunghezza. Eseguire la PCR con gDNA come stampo e oligonucleotidi # 5 e # 6 (Figura 3A).
- Dopo purificazione di tutti e tre PCRframmenti, eseguire il 2 turno di PCR. Usare una miscela uguale di tutti e tre i frammenti ottenuti al primo turno come template. L'amplificazione è catalizzata da oligonucleotidi # 1 e # 6. Il risultante frammento di PCR (Figura 3B) serve da trasformare DNA nell'esperimento trasformazione naturale (Figura 1).
4. La chitina-indotta trasformazione naturale
- Grow V. cellule cholerae aerobiosi in terreno ricco a 30 ° C fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm di circa 0,5.
- Raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Lavare pellet volta in mezzo artificiale definito (DASW 6) prima di risospendere le cellule in 2 volumi di DASW. Aggiungere 1 ml di coltura a 50-80 mg di sterile fiocchi di chitina (spiegato al punto 1). Se i batteri porto plasmide pBR-FLP (opzionale punto 2), add ampicillina (50 pg / ml) alla cultura. Incubare a 30 ° C per 16-24 hr senza movimento.
- Aggiungi & ge, 200 ng del II-tutto PCR derivato da due frammenti (indicato al punto 3). Mescolare con cura, evitando ampiamente staccare i batteri dalle superfici chitina. Incubare a 30 ° C per 24 ore senza movimento.
- Vortex la cultura ampiamente per ≥ 30 sec. Stendere 100-300 microlitri su piastre di terreno selettivo LB (ad esempio gentamicina o kanamicina contenenti piastre LB per gli esempi forniti qui). Utilizzare doppio selettive piastre se i batteri ospitano il plasmide pBR-flp aggiungendo ampicillina concomitanza ad altri antibiotici. Incubare le piastre a 30 ° C per 16-24 ore o fino colonie sono visibili.
- Isolare trasformanti singoli dalle piastre selettive. Tali trasformanti hanno sostituito il locus cromosomico originale dal frammento PCR a causa di un evento di crossover doppia. Questi ceppi possono essere direttamente utilizzati per ulteriori esperimenti nel caso la rimozione della cassetta antibiotico non è necessario.
5. Rimozione di cassetta selettivo (s) da Flp-Ricombinazione
- Artificialmente trasformare i trasformanti con il plasmide PBR-flp come descritto al punto 2, se non ancora effettuato il test di trasformazione naturale.
- Crescere i batteri su piastre di agar LB contenenti ampicillina a 37 ° C per 16-24 ore. Opzioni: consente di modificare la temperatura in mezzo per 2-3 ore a 40 ° C come espressione della FLP dal plasmide PBR-FLP è de-represso alle alte temperature; 5,10 batteri trasferimento a piatti freschi dopo ca. 8 ore di incubazione.
- Di prova per antibiotico-sensibilità (dimostrato qui per kanamicina, figura 1) da restreaking i cloni in parallelo su piastre di agar contenenti antibiotici e antibiotico-free. Isolare singole colonie sensibili. Congelare ampicillina-clone resistente come stock in glicerolo se si intende modificare ulteriormente la tensione con delezione altri / inserimento utilizzando TransFLP.
6. Polimerizzazione plasmide
- Crescere la cultura durante la notte in condizioni aerobiche ea 30 ° C. Utilizzare terreno ricco senza l'aggiunta di qualsiasi antibiotico.
- Opzionale: crescere coltura fresco per 3-6 ore diluendo il 1:100 notte cultura in fresco antibiotici terreno privo.
- Piatto o striscia di diluizione (s) della cultura sulla piastra piana agar LB (s) e incubare a 30 ° C per 8-16 ore (fino a quando le colonie sono visibili).
- Test per ampicillina sensibilità dei cloni restreaking dai cloni in parallelo su piastre di agar contenenti antibiotici e antibiotico-libera (figura 1). Congelare ampicillina sensibile ceppo stock in glicerolo.
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Representative Results
Risultati rappresentativi di tre esempi sono mostrati nelle figure 4 a 6. Il primo approccio volto a eliminare i geni vicini ctxA e ctxB. Insieme codificare il principale fattore di virulenza V. cholerae, tossina del colera. Abbiamo progettato oligonucleotidi per il metodo TransFLP come sopra descritto e secondo la figura 3. Il ceppo parentale, il ceppo intermedio ospitare la FRT-fiancheggiato cassetta antibiotico resistenza al locus DNA originale ctxAB e il ceppo finale eliminato per ctxAB e liberato della cassetta di resistenza sono stati testati per la loro genotipo (Figura 4). Il metodo di scelta è stata whole-cell PCR. Abbiamo usato primer che non annealing per trasformare il frammento PCR ma solo DNA cromosomico (Figura 3). Questo ha permesso di verificare il sito-specifica di scambio del frammento PCR con la regione omologa del cromosoma (Figura 4A). I frammenti PCR sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio standard per determinare la loro dimensione (Figura 4B). Questa strategia può essere utilizzato per controllare intermedi di deformazione e di confermare il costrutto finale ceppo (s).
Per il secondo esempio, la rimozione di una intera isola genomica, abbiamo scelto la patogenicità Vibrio isola 1 (VPI-1) come bersaglio 13. La procedura TransFLP standard precedentemente descritta è riuscito in questo caso. Era noto da studi precedenti che una regione di DNA di grandi dimensioni può essere scambiato da una regione di DNA di dimensioni simili utilizzando chitina trasformazione indotta naturale 9. Abbiamo quindi ipotizzato che la differenza di dimensioni tra la regione-to-be-deleted e piuttosto breve frammento di trasformare PCR (<3,5 kb) potrebbe essere il fattore limitante. Abbiamo quindi deciso di utilizzare il metodo TransFLP in due fasi: per prima cosa integrato il gene aph (kan R), preceduto da un singolo FRSito T all'inizio del VPI-1 (illustrato in figura 5A). Abbiamo quindi effettuato un secondo ciclo di trasformazione naturale, che ci permetteva di inserire un cassetto aggiuntivo resistenza agli antibiotici (gm R, che conferisce la resistenza alla gentamicina) seguito da un sito FRT secondo alla fine dell'isola patogenicità (Figura 5A). Il rispettivo doppio ceppo resistente è stato elettroporata inserire plasmide pBR-Flp e il metodo TransFLP stato continuato come descritto sopra. Il ceppo risultante mancava tutta VPI-1, come accertato mediante PCR su DNA genomico purificato (Figura 5B).
Per il terzo esempio abbiamo integrato una polimerasi T7 RNA-dipendente sequenza di promotore a monte di un gene d'interesse, nel nostro caso il gene codificante il principale regolatore della trasformazione naturale TFox 6. Questo è stato fatto usando il metodo TransFLP con una leggera modifica del protocollo standard: abbiamo incluso il p T7 RNA dipendenteromoter sequenza consenso secondo Rif. 14 come sbalzi nei oligonucleotidi # 4 e # 5. Con questa strategia la polimerasi T7 RNA-dipendente sequenza promotore è stato mantenuto sul cromosoma anche dopo che la cassetta è stata escissa resistenza agli antibiotici (Figura 6). Abbiamo integrato il costrutto in V. cholerae ceppo ADVCH-T7POL, che ospita la polimerasi T7 RNA gene guidata dal promotore lacUV5 (Blokesch, non pubblicata). Per verificare la funzionalità del costrutto, cioè la T7 RNA polimerasi-dipendente espressione di TFox, abbiamo effettuato analisi di trasformazione naturali in mezzo LB. Il ceppo parentale non è naturalmente trasformabile in queste condizioni a causa della mancanza di trascrizione TFox in terreno ricco e in assenza di induttore sua chitina naturale (Figura 6). Questo fenotipo era indipendente se la polimerasi T7 RNA è stato artificialmente indotto da IPTG o meno (Figura 6, corsie 1 e 2, respectively). Tuttavia, l'TransFLP generato ceppo ADVCH-T7POL-T7-TFox :: FRT, che contiene la polimerasi T7 RNA-dipendente promotore a monte del gene competenza TFox, era effettivamente naturalmente trasformabile in terreno ricco (figura 6, corsie 3 e 4) . A causa della perdita del promotore lacUV5 in terreno LB 15 il prodotto T7 RNA polimerasi TFox già trascritto dalla RNA polimerasi T7 promotore dipendente senza induzione. Questa competenza avviato naturale e trasformazione confermare la funzionalità della T7 RNA polimerasi integrato-dipendente sequenza promotore (Figura 6, corsia 3). Questo fenotipo è stato notevolmente migliorato per induzione completa della polimerasi T7 RNA per aggiunta di induttore del promotore lacUV5, IPTG (Figura 6, corsia 4).
Figura 1.Diagramma di flusso del metodo TransFLP. I sei punti descritti in questo protocollo sono redatti:.. 1) Preparazione di fiocchi di chitina, 2) Opzionale: trasformazione artificiale di V. cholerae con ricombinasi Flp-plasmide codificante,. 3) disegno degli oligonucleotidi e reazione a catena della polimerasi,. 4) La chitina-indotta naturale trasformazione; 5) la rimozione della cassetta selettiva (s) da FLP-ricombinazione,... 6) polimerizzazione Plasmid Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Rappresentazione schematica di tre possibilità di applicazione per il metodo TransFLP. I) Un DNA di 1458 bp, contenente la tossina colerica codifica geni ctxA e ctxB, è stato eliminato come indicato da Δ. II) Il ~ 40 kb Vibrio patogenicità isola 1 (VPI-1 13)è stato eliminato dal ceppo selvatico. III) Una polimerasi RNA-dipendente sequenza promotrice T7 (28 bp) è stato integrato a monte del gene TFox. Il rettangolo rosso indica la sinistra dietro breve sequenza nucleotidica di un singolo sito FRT 10. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Spiegazione per il design e le prestazioni di innesco PCR basato sulla cancellazione di ctxAB. Pannello A: Per il 1 ° turno di DNA genomico PCR (gDNA) e plasmidi pROD17 12 e PBR-FRT-Kan-FRT, rispettivamente, sono serviti come modelli. Gli oligonucleotidi richiesti sono # 1 a # 6. Il primer # 2 / # 3 e # 4/5 ° (esempio in riquadro) deve anche possedere una significativa sovrapposizione tra loro a loro 5'ends. Pannello B: Dopo il giro di 2 °PCR, che si basa su il 1 ° turno frammenti di PCR come modelli, un frammento di tempo deve essere ottenuta usando la coppia di primer # 1 + # 6. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Risultato atteso esemplificato per la strategia di eliminazione ctxAB. Il ceppo originario (wild-type), il mutante inserzionale Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, e la finale ceppo Δ ctxAB :: FRT sono stati testati per i loro genotipi. Un pannello: Rappresentazione schematica della potenza differenziazione della coppia di primer CTX-chk-up e CTX-chk-down, in particolare per quanto riguarda la escissione della cassetta antibiotico. Pannello B: cellule batteriche intere sono state usate come stampo nelle reazioni PCR. Per controllare il DNA modificato locus primer chk chk-up e-down sono stati utilizzati. I frammenti amplificati PCR sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio e visualizzati mediante colorazione SYBR DNA sicuro. Corsia 1: Wild-tipo V. cholerae ceppo; corsia 2: ceppo Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, corsia 3: Δ ctxAB :: FRT. Attesi dimensioni dei frammenti di PCR secondo pannello A sono indicati sulla destra. L, scala 1kb (Invitrogen). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. Strategia per verificare l'eliminazione dell 'isola genomica. Pannello A: Schema di patogenicità dell'isola Vibrio 1 (VPI-1) (liberamente adattato da Rif. 16, non in scala.). Per il ceppo di tipo selvatico della regione di interesse non è amplificabile mediante PCR standard e il VPI-1-specifici primer chk-up e CHK-down (~ 40 kb). Pertanto un ulterioreoligonucleotide ricottura all'interno della regione to-be-deleted è stato applicato (VC0817-back) con VPI-chk-up. Pannello B: risultato rappresentativa utilizzando DNA genomico dei ceppi rispettivi come stampo e le coppie di primer indicati sopra ciascuna immagine. I ceppi testati: Wild-tipo V. cholerae ceppo (corsia 1), ceppo VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (corsia 2), e ΔVPI-1 :: FRT (corsia 3). Dimensioni dei frammenti di PCR, come previsto nel quadro A sono indicati sulla destra. L, scala 1kb (Invitrogen). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6. Fenotipo rappresentativa dopo l'inserimento di una sequenza promotore artificiale. La polimerasi T7 RNA-dipendente sequenza promotore è stato integrato a monte del gene TFox regolamentazione competenza utilizzando la metodologia TransFLPd (disegno grafico precedente). I genitori V. cholerae ceppo (ADVCH-T7POL) contiene un gene T7 RNA polimerasi guidata dal promotore lacUV5. Grafico: Il ceppo parentale ADVCH-T7POL (corsie 1 e 2) e il ceppo manipolato da TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-TFox :: FRT; corsie 3 e 4) sono state testate per trasformabilità naturale in assenza (corsie 1 e 3 ) o presenza di 1 mM IPTG (corsie 2 e 4). Trasformando DNA genomico è stato derivato dal ceppo A1552-LacZ-Kan 8. Frequenze di trasformazione sono riportati sulla Y. <Dl, al di sotto del limite di rilevazione ~ 5 x 10 -8. ** P <0.01 (secondo il test t di Student di log-trasformati dati). Freccia nera con 'T7' text:. T7 RNA polimerasi-dipendente sequenza promotore Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Il metodo sopra descritto TransFLP e altrove 5 è stato ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio. Il tipo di manipolazioni genetiche che sono fattibili includono tra gli altri: delezione di geni singoli e gruppi di geni, delezione di isole genomiche (es., VPI-1), l'inserimento di sequenze a monte di un gene di interesse (ad esempio, sequenze promotore) ed inserimento di sequenze alla fine di un gene specifico (ad esempio, codifica tag di affinità).
Un requisito di importazione per TransFLP è che il rispettivo V. ceppo cholerae è naturalmente trasformabile. Questo non è il caso a volte, soprattutto negli isolati derivate da pazienti affetti da colera. Tali ceppi sono frequentemente mutato all'interno del quorum sensing ad esempio circuito, all'interno del gene che codifica per il principale regolatore del quorum sensing, hda aprile 17. Fornire indietro una copia di hda aprile ripristina trasformabilità naturale in questi ceppi 6 come esemplificatocato per il hda aprile a difettoso ceppo N16961 18.
Eventuali modifiche possono essere incorporate, come l'arricchimento dei batteri dopo trasformazione naturale 8 nel caso in cui la frequenza è troppo bassa. Si noti che la frequenza di trasformazione è in generale inferiore nel caso della pBR-flp plasmide è già presente, mentre facendo la chitina indotta saggio naturale trasformazione. Questo è probabilmente causato dalla perdita parziale della espressione sensibile alla temperatura del gene FLP da pBR-flp, che comporterebbe prematura escissione della cassetta resistenza antibiotica e l'incapacità di selezionare per questi trasformanti. Si consiglia pertanto di casi critici per inserire il PBR-FLP plasmide dopo la fase di trasformazione naturale.
Un altro passo importante è il 2 turno di PCR, che combinerà i tre 1 ST-round frammenti di PCR. Può accadere che i frammenti parziali sono presenti dopo la rea PCRction (ad esempio, un gruppo di frammenti solo parziale 'up' e 'FRT-Kan-FRT' secondo la figura 1). Questo è trascurabile, come doppia ricombinazione omologa con la regione cromosomica mirata non può avvenire in questa situazione. Come trasformanti solo ospitano la cassetta di resistenza agli antibiotici sono selezionati per tutti i trasformanti altri non desiderati scambi di DNA sono esclusi.
Un altro punto da tenere a mente è rispetto alla ripetizione della procedura per diversi round. Abbiamo già riusciti a combinare la soppressione del gene cluster ctxAB con la soppressione della patogenicità dell'isola (VPI-1) e un altro gruppo di geni di virulenza (Blokesch, non pubblicato). Inoltre, abbiamo effettivamente integrato la T7 RNA polimerasi-promotore dipendente all'interno di questi ceppi (a monte tfox e altrove). Tuttavia, il genotipo previsto dovrebbe essere costantemente testati per tutti gli intermedi di deformazione (ad esempio, dalla colonia PCR come demonstrated in Figura 4). Ciò contribuirà ad escludere l'indesiderato Flp-mediata ricombinazione del sinistro dietro cicatrici FRT (mostrato in rosso rettangolare in tutte le figure) con l'altro, mentre il plasmide pBR-flp è ancora presente nei batteri. Questo può probabilmente essere trascurato per geni remoto qualsiasi, come la probabilità che l'escissione della a-tra regione sarebbe letale a causa della delezione di geni essenziali è molto alta.
Infine, vorremmo discutere l'eliminazione di geni in operoni. Non si può escludere che la delezione di un gene a monte, che lascia una cicatrice FRT dietro, potrebbe modificare l'espressione del gene a valle (s). Per garantire che questo effetto non è la causa del fenotipo osservabile, ma che questa è infatti causata dalla delezione, un saggio di complementazione è raccomandato. Un altro controllo che abbiamo già utilizzato con successo in laboratorio è l'integrazione dei cicatrice FRT valle del gene d'interesse without eliminare quest'ultimo. Non abbiamo osservato questi problemi nel nostro laboratorio, ma ancora non può escludere la loro esistenza.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorrei ringraziare Olga de Souza Silva per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (FNS) Grant 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
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