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Immunology and Infection

TransFLP - 遺伝的に変更する方法 Published: October 8, 2012 doi: 10.3791/3761

Summary

のゲノムを変更するための簡単​​な方法

Abstract

いくつかの方法は1-3細菌の染色体を操作することが可能です。これらのプロトコルの大部分は、条件付きで複製プラスミドの挿入(1,2 PIR依存または温度感受性レプリコンを宿すなど )に依存しています。これらのプラスミドは、相同性媒介組換えに基づく細菌染色体に組み込まれています。このような挿入変異体はしばしば直接実験の設定に使用されています。あるいはまた、その損失が続くプラスミド切除の選択はしばしばsacB遺伝子4でエンコードされたカウンターで選択レバンスクラーゼの酵素に依存しているグラム陰性細菌に、これを行うことができます。切除は、事前挿入遺伝子型または染色体と改変された遺伝子のプラスミドにコードされたコピーの間の交流の結果を復元することができます。この手法の欠点は、時間がかかるということです。プラスミドは、最初にクローンする必要があり、それ Vへの水平転送を必要とするコレラ菌 (最大n otably E.との交配によって大腸菌ドナー株)または後者の人工変換、およびプラスミドの切除は、ランダムであり、どちらかの初期遺伝子型を復元するか、正の選択が発揮されていない場合、必要な変更を作成することができます。ここでは、Vの迅速な操作のための方法を提示するコレラ菌染色体(S)5( 図1)。このTransFLP法はこの生物6、などVのビブリオ属の他の代表の天然能力の最近発見されたキチン質を介した誘導に基づくシャリ 7。自然な能力は、PCRによって生成されたDNA断片を含む自由なDNAの取り込みを可能にします。一度取り上げ、染色体とDNAの再結合は、相同領域8に隣接するの250から500 bpの最小値の存在を与えられた。これらの隣接領域の中間の選択マーカーを含めることは頻繁に発生した形質転換体を容易に検出することができます。

tは">このメソッドはコレラ菌の異なる遺伝子操作のために使用され、潜在的にも他の天然有能なバクテリアすることができます我々は、以前に公開された単一遺伝子欠失の研究とに加えて、この方法によって達成することができるものに3小説の例を提供アフィニティータグ配列5。キチン誘発自然変換6の初期のプロトコルに関しては、いくつかの最適化のステップはこのTransFLPプロトコルに組み込まれているのに加え、これらは他の市販のキチンフレーク8、PCRの寄付によってカニ殻断片の交換中に含める由来の材料9の変換など、DNA、およびFLP組換え標的部位の付加(FRT)5。FRT部位は、FLPリコンビナーゼ10によって媒介される選択マーカーの部位特異的切除を可能にします。

Protocol

TransFLP法( 図1)は、3つの異なるアプローチが例示される:I)Vの病原性決定因子をコードする2つの隣接した遺伝子の欠失コレラ菌例えば 、ΔctxAB)、病原性島のⅡ)除去( 例えば 、ΔVPI-1)、およびその後にそのを可能にする目的遺伝子の上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性のプロモーター配列のIII)の統合それぞれのひずみ背景に人工的な発現( 例えば、T7-tfoX)( 図2)。

1。キチンフレークの調製

  1. 標準1.5mlのプラスチックチューブでキチンフレークの重量50から80ミリグラム。これは大量に調製することができます。キチンフレークは、Sigma(カタログ番号C9213)から市販されている。
  2. チューブの蓋が開いたままのフレークをオートクレーブ。
  3. オートクレーブを冷却した後、直ちに蓋を閉じます。
  4. ストアオートクレーブ処理キチンフレーク室温で。

2。オプション:Vの人工変換FLPリコンビナーゼをコードするプラスミドでコレラ

  1. エレクトロ準備V.標準的な方法11を用い の細胞。 -80℃でコンピテント細胞のアリコート℃で保存
  2. エレクトロにプラスミドpBR-FLP 5のレギュラーミニ準備中1-2μlを加えV.コレラ菌は、細胞およびエレクトロポレーションキュベット(0.2 cm商品のギャップ幅)に混合物を移す。
  3. 1.6 kVでパルスを印加します。
  4. 0.9ミリリットルのSOC培地を加え、穏やかに、標準の14 mlチューブに細胞を移す。 30℃で2.5から3時間にわたり非移動インキュベート℃に
  5. プレートを100μl、30℃で一晩100μg/ mlのアンピシリンとインキュベートを含むLBプレート上に300μlの。
  6. 将来TransFLP実験のグリセロールストックのような単一のクローンや店舗を精製する。

3。オリゴヌクレオチドの設計およびポリメラーゼ連鎖反応

  1. 少なくとも6つのオリゴヌクレオチドは、目的とするDNA領域(複数可)と同様にPCRによりFRT-挟まれた抗生物質カセット( 図3)を増幅する必要があります。また、挿入されたPCR断片外オリゴヌクレオチドプライミングのペアを含めることをお勧めします。これは、統合とFRT-挟ま抗生物質耐性カセット( 例えば 図3〜図5に'CHKアップ'と'CHKダウン'プライマーとして描かれている)の正確な切除をチェックすることができます。
  2. オリゴヌクレオチド#2、#3、#4、#5の注意を払って設計を行ってください。彼らは十分に鋳型DNAに( 例えば 〜28 bp)をアニールすることができるはずです。テンプレートDNA、プライマー#2と#5などpROD17 12及びプライマー#3と#4のPBR-FRT-KAN-FRT(本研究)(としてFRT-カンイFRT含有プラスミドDNAのゲノムDNA(gDNA)です図3A)。
  3. (それぞれ、#2 /#3、#4 /#5の間にそれらの5 '末端の塩基対広範図3Aを許可#5#2プライマーを設計
  4. PCRの第1ラウンドとして3独立したPCR反応を行う。最初のものは、オリゴヌクレオチド#1と#2を用いて遺伝子/ DNA関心領域の上流領域を増幅する。 PCR法は、細胞内での相同組換えを可能にするために、長さが少なくとも500bpの断片をもたらすべきである。短い断片(約250 bp)は8で十分できますが、推奨されていません。
  5. 並列にFRT-挟ま抗生物質カセットを増幅する第2のPCRを行う。例はここで提供されるために私達は主にAPH(館 R)を使用しました。この反応( 図3A)のためのオリゴヌクレオチド#3と#4を使用します。
  6. 付随して、PCR法(第三のサンプル)によって下流のDNA領域を増幅する。 PCR断片はまた、長さが少なくとも500bpである必要があります。テンプレートおよびオリゴヌクレオチド#5と#6( 図3A)にgDNAを用いてPCRを行う。
  7. すべての3つのPCR産物の精製後断片は、PCRの第2ラウンド行う。テンプレートとして、最初のラウンドで得られたすべての3つの断片の等量混合物を使用しています。増幅は、オリゴヌクレオチド#1と#6によって触媒される。得られたPCR断片( 図3B)は、自然形質転換実験( 図1)でDNAを変換として機能します。

4。キチン誘起自然形質転換

  1. 成長V. 30℃における富栄養培地で好気的にコレラ菌は、細胞は、約0.5の600nmでの光学密度に達するまで。
  2. 遠心分離により菌体を回収します。 DASW 2容量の中に細胞を再懸濁する前に、一度定義する人工培地(DASW 6)でペレットを洗浄します。無菌キチンフレーク(ポイント1で説明)の50〜80 mgの培養液1 mlを加える。文化への細菌港プラスミドpBR-FLP(オプション2点)、ADDアンピシリン(50μg/ ml)の場合。運動せずに16から24時間30℃でインキュベートする。
  3. G&追加eであり、第2回目のPCR由来断片(ポイント3で説明)は200 ng。広くキチン表面から細菌を切り離さずに慎重に混ぜる。運動なしで24時間30℃でインキュベートする。
  4. 渦≥30秒広く文化。選択LB培地プレート(ここで提供される例については、 例えばカナマイシン、ゲンタマイシン含有LBプレート)上に100から300μlを広げた。細菌は他の抗生物質に付随してアンピシリンを追加することにより、PBR-FLPプラスミドを抱いている場合、ダブル選択プレートを使用しています。 16から24時間30℃でプレートをインキュベートするか、コロニーが見えるようになるまで。
  5. 選択プレートから単一の形質転換体を単離する。このような形質転換体は、ダブルクロスオーバーイベントによるPCR断片によってオリジナルの染色体座を交換しました。抗生物質カセットを取り外す必要はありません場合にはこれらの株は直接さらなる実験のために使用することができます。

5。 FLPによる選択カセットの除去(複数可)組換え

  1. 自然形質転換試験の前に行われていない場合、ポイント2で説明したように人為的にPBR-FLPプラスミドを使って形質転換体を変換する。
  2. 16から24時間37℃でアンピシリンを含むLB寒天プレート上で細菌を培養。オプション:40に2〜3時間の間に温度を変更℃のプラスミドpBR-FLPからFLPの表現として、より高い温度での5,10 -デ抑制され、約後に新鮮なプレートへの転送細菌。インキュベーションの8時間。
  3. 抗生物質含有および抗生物質を含まない寒天プレート上で並行してクローンをrestreakingによって、抗生物質感受性( 図1カナマイシンにはここを実証)のテスト。シングル感受性コロニーを分離します。あなたはさらにTransFLPを使用して他の削除/挿入した株を変更する場合はグリセロールストックとしてアンピシリン耐性クローンをフリーズします。

6。プラスミドキュア

  1. 好気的条件下で一晩培養すると30℃どんな抗生物質を添加することなくリッチな培地を使用しています。
  2. オプション:新鮮な抗生物質を含まない培地で一晩培養した培養液の1:100希釈することにより、3から6時間、新鮮な培養する。
  3. 板やスジ平野LB寒天プレート(S)で文化の希釈(s)および30℃にて8月16日時間のためのC(コロニーが見えるようになるまで)。
  4. 抗生物質含有および抗生物質を含まない寒天プレート( 図1)上で並行してクローンをrestreakingによるクローンのアンピシリン感受性をテストします。グリセロールストックとしてアンピシリン感受性株をフリーズします。

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Representative Results

3例の代表的な結果を6〜図4に示されている。隣接する遺伝子ctxActxBを削除することを目的と最初のアプローチ。彼らは一緒にVの主要な病原因子をエンコードするコレラ菌 、コレラ毒素。我々は、上記のようにTransFLPメソッドのオリゴヌクレオチドを設計し、 図3を参照に記載の方法。親株は、ctxABの元のDNA遺伝子座のFRT-挟まれた抗生物質耐性カセット及び最終ひずみctxABために削除され、耐性カセットの解放を宿す中間株はすべての彼らの遺伝子型( 図4)について試験した。選択の方法は、全セルPCRだった。我々は、しかし唯一の染色体DNAに変換したPCR断片( 図3)にアニールしないプライマーを使用していました。これは、私たちは染色体の相同領域(FでPCR断片の部位特異的な交換性を確認することができigure 4A)。 PCR断片( 図4B)、その大きさを決定するために、標準的なアガロースゲル電気泳動により分離した。この戦略は、ひずみ中間体を確認するために、最終的なひずみ構築物を確認するために使用することができます。

2番目の例では、全ゲノムアイランドの除去は、我々は、ターゲット13としてビブリオ病原性島1 VPI(A-1)を採用しました。前述の標準TransFLP手順は、このケースでは成功しませんでした。それは、このような大規模なDNA領域がキチン誘起自然形質転換9を使用して同様大きさのDNA領域によって交換することができるという以前の研究から知られていました。そこで我々は、サイズの差地域になる予定 - 削除されたとかなり短い変換PCR断片(<3.5キロバイト)が制限要因となるかもしれないという仮説を立てた。したがって、私たちは二つのステップでTransFLP方法を使用することを決めた:我々は最初のシングルFRで先行APH遺伝子( R)を統合VPI-1の開始時に、Tサイト( 図5Aに示すように)。次に、私たちは病原性島( 図5A)の端部に第2のFRT部位に続く追加の抗生物質耐性カセット(GM R、ゲンタマイシン耐性を付与)を挿入するために許可された天然の変換の第2ラウンドを行った。それぞれの二重耐性株は、PBR-FLPプラスミド挿入するエレクトロポレートした、上記のようTransFLP法を継続した。ゲノムDNA( 図5B)を精製したPCRによって実証されて得られた株は、全体のVPI-1を欠いていた。

我々は我々の場合には遺伝子が自然形質転換tfoX 6の主要な調節因子をコードし、目的遺伝子の上流にT7 RNAポリメラーゼ依存プロモーター配列を統合されているサード例えば。これは、標準のプロトコルからのわずかな修正でTransFLP法を用いて行われていた:私たちは、T7 RNA依存性pを含める文献によるとromoterコンセンサス配列の14ヌクレオチド#4、#5に張り出している。この戦略では、T7 RNAポリメラーゼ依存プロモーター配列は、抗生物質耐性カセットが( 図6)を摘出した後でも、染色体上に保持した。我々はVの中にコンストラクトを統合lacUV5プロモーター(Blokesch、未発表)によって駆動されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を有するコレラ菌株ADVCH-T7POL、。 tfoXのT7 RNAポリメラーゼ依存性の発現、すなわち、構造物の機能をテストするために、我々はLB培地で自然形質転換アッセイを行った。親株は、富栄養培地中で、その自然な誘導キチン( 図6)の非存在下でのtfoX転写が不足しているため、これらの条件下で自然に変形可能ではありません。この表現型は、T7 RNAポリメラーゼを人為的に( 図6、レーン1および2、respe IPTGにより誘導されたか否かとは無関係であったctively)。しかし、TransFLP生成された菌株ADVCH-T7POL-T7-tfoX ::能力tfoX遺伝子の上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーターを含んでFRTは、富栄養培地( 図6、レーン3および4)で確かに自然に変形可能であった。 LB培地15誘導せず、T7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーターから生成T7 RNAポリメラーゼすでに転写tfoXでlacUV5プロモーターの漏洩に起因する。これは、統合されたT7 RNAポリメラーゼ依存プロモーター配列( 図6、レーン3)の機能を確認する天然の能力と変換を開始しました。この表現型は大幅lacUV5プロモーターの誘導物質IPTG( 図6、レーン4)の添加によるT7 RNAポリメラーゼの完全な誘導により増強された。

図1
図1。TransFLP方法のフローチャート。このプロトコルで説明する6つのポイントが起草されている:1)キチンフレークの調製; 2)オプション:V.の人工変換。 FLPリコンビナーゼをコードするプラスミドを持つ ; 3)オリゴヌクレオチドの設計およびポリメラーゼ連鎖反応; 4)はキチン誘起自然形質転換、5)FLP-換えによる選択的なカセット(複数可)の除去;。6)プラスミド硬化はここをクリック拡大図を表示する

図2
図2 TransFLPメソッドの3つのアプリケーションの可能性の模式図。 Δによって示されるようにコレラ毒素をコードする遺伝子ctxActxBを含むI)1458 bpのDNA断片は、削除されました。 Ⅱ)〜40キロバイトビブリオ病原性島1(VPI-1 13)野生型株から削除されました。 III)は、T7 RNAポリメラーゼ依存プロモーター配列(28 bp)をtfoX遺伝子上流統合されました。赤い四角形は、単一のFRT部位10の短い塩基配列の後ろに左を示しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

図3
3。ctxABの削除に基づいてプライマー設計、PCRの性能のために説明。パネル:PCRのゲノムDNA(gDNA)及びプラスミドpROD17 12とPBR-FRT-カンイFRT、テンプレートを務めたの1回目ラウンドのために。必要なオリゴヌクレオチドは、#1〜#6です。プライマー#2 /#3、#4 /#5(挿入図の例では)また、5 '末端で互いにかなりのオーバーラップを有するべきである。パネルB:2 回目のラウンドの後テンプレートとして、長い断片はプライマー対#1 +#6を使用して取得する必要があります第1ラウンドのPCR断片を元にしてPCRは、。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

図4
図4 ctxAB削除戦略について例示期待される結果。元株(野生型)、挿入変異ΔctxAB :: FRT-カンイFRT、最終ひずみΔctxAB :: FRTは、その遺伝子型について試験した。パネルA:特に抗生物質カセットの切除に関して、CTX-CHKダウンプライマー対は、ctx-CHKアップとの差別化電源の模式図。パネルB:細菌細胞全体をPCR反応における鋳型として使用した。変更されたDNAの遺伝子座のプライマーCHK CHKアップとダウンが利用されたかどうかを確認するには。 PCR増幅断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、染色SYBR安全なDNAを用いて可視化した。レーン1:野生型V。コレラ株 、レーン2:ひずみΔctxAB :: FRT-カンイFRT、レーン3:ΔctxAB :: FRT。予想PCR断片のサイズがパネルによれば、右に表示されています。 L、1キロバイトラダー(Invitrogen)に。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

図5
図5ゲノム島の削除を確認するための戦略。パネル: ビブリオ病原性島1(VPI-1)(自在文献から適応16;正確な縮尺ではない。)のスキーム。野生型株の関心領域は、標準的なPCRおよびVPI-1特異的プライマーCHK CHKアップとダウン(〜40キロバイト)により非増幅可能である。したがって、追加のオリゴヌクレオチドは、領域内でアニーリングに削除される予定のVPI-CHKアップと一緒に(VC0817バック)に適用した。パネルB:代表結果テンプレートとプライマーペアとして、各菌株のゲノムDNAを用いて、各画像上に示す。株はテスト:野生型V.コレラ株(レーン1)、ひずみのVPI :: FRT-Kan/Gm-FRT(レーン2)、およびΔVPI-1 :: FRT(レーン3)。 PCR断片のサイズは、右のように示されているパネルに予測した。 L、1キロバイトラダー(Invitrogen)に。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

図6
図6人工プロモーター配列を挿入した後の代表的な表現型。 T7 RNAポリメラーゼ依存プロモーター配列はTransFLPメトキシを使用して能力調節遺伝子tfoXの上流に統合されましたD(グラフの上にスケッチ)。親のV.コレラ菌株(ADVCH-T7POL)はlacUV5プロモーターによって駆動されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含んでいます。グラフ:親株ADVCH-T7POL(レーン1および2)とTransFLP(ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT、レーン3および4)によって操作株(レーン1と3がない場合に自然形質転換能を試験した場合)または1mMのIPTGの存在下(レーン2および4)。形質転換ゲノムDNAは、歪みA1552-LacZを館8から派生したものです。変換周波数はY軸上に与えられている。 <DL、〜5×10 -8の検出限界以下。 ** P <0.01(対数変換されたデータのスチューデント t検定によって決定されるように)。テキスト'T7'が付いている黒い矢印:T7 RNAポリメラーゼ依存プロモーター配列は、 より大きな図を表示するには、ここをクリックしてください

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Discussion

TransFLP方法は、上述の他の場所と5は広く、我々の研究室で使われてきました。実現可能である遺伝子操作の種類は、とりわけ以下のとおり、単一の遺伝子や遺伝子群の欠失、ゲノムの島々の欠失( 例えば 、VPI-1)は、目的の遺伝子の上流配列の挿入( 例えば 、プロモーター配列)と挿入を特定の遺伝子( 例えば 、符号化アフィニティータグ)の末尾のシーケンス。

TransFLPのインポート前提条件は、そのそれぞれのV ですコレラ自然に変形可能である。これは、特にコレラ患者由来の分離株で、時々そうではありません。このような株は頻繁にクオラムセンシング、HapR 17の主要な調節因子をコードする遺伝子の中に、クオラムセンシング回路内変異している。 hapRのコピーバックを提供することがexempliとしてこれらの菌株6に自然形質転換能を復元HapR欠損株N16961 18について検証してください。

周波数が低すぎる場合には実行可能な変更は、このような自然形質転換後の8細菌の濃縮として、組み込むことができます。キチン誘起自然形質転換試験を行いながら、PBR-FLPプラスミドがすでに存在する場合には形質転換頻度は一般的に低くなることに注意してください。これは、最も可能性の高い抗生物質耐性カセット、これら形質転換体を選択することができないのは時期尚早切除をもたらすPBR-FLPからFLP遺伝子温度感受性表現の部分漏れによって引き起こされる。したがって、私たちは重大なケースのために自然形質転換工程の後にプラスミドpBR-FLPを挿入することをお勧めします。

もう一つの重要なステップは、3つの第1回目のPCRフラグメントを結合し、PCRの第2ラウンドです。それは部分的な断片がPCRレア後に存在していることを発生することがありますction( 例えば 、断片のみの部分的なアセンブリ'アップ'と'FRT-カンイFRT' 図1による)。標的染色体領域を持つ二重相同組換えは、このような状況で発生することはできませんので、これは無視できる程度である。抗生物質耐性カセットを保有する唯一の形質転換体のために選択されるように、非所望のDNAの交流を持つ他のすべての形質転換体が除外されます。

心に留めておくべきもう一つのポイントは、何回かの手順の繰り返しに対してである。我々はすでに正常に病原性島(VPI-1)と、別の病原性遺伝子クラスター(Blokesch、未発表)の欠失を伴うctxAB遺伝子群の欠失を組み合わせている。さらに、我々は効果的にこれらの菌株(上流tfoXおよび他の場所)内に、T7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーターを統合している。しかし、想定される遺伝子型は常にdとしてコロニーPCRにより、すべての系統の中間体( 例えば 、のためにテストされるべきである)を図4にemonstrated。これは、PBR-FLPプラスミドはまだ細菌に存在している間にお互いにFRTの傷跡の後ろに左の望ましくないFLP-媒介組換え(すべての図に赤い長方形で示される)を除外するのに役立ちます。これはおそらく、遠くに位置する遺伝子のために無視インの間の領域の切除が必須遺伝子の欠失に起因する致命的であろう確率として非常に高くすることができます。

最後に、我々はオペロン内の遺伝子の欠失を議論したいと思います。我々は、FRTの傷跡が残さ上流遺伝子の欠失が下流遺伝子の発現が変化する可能性があること。除外することはできませんこの効果は、観察可能な表現型を引き起こしていないことが、これは確かに失によって引き起こされることを確保するために、相補アッセイを推奨します。我々は既に正常に実験室で使用されていることを別のコントロールには、目的遺伝子のwithouのFRT瘢痕下流の統合ですtは後者を削除します。我々はまだ我々の研究室でこのような問題を観察しなかったが、彼らの存在を除外することはできません。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

私は、技術支援のためのオルガ·デ·ソウザ·シルバを承認したいと思います。この作品は、スイス国立科学財団(SNSF)グラント31003A_127029によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitin flakes Sigma C9213 Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) Biorad 165-2100 Or comparable electroporators

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References

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