Summary
En snabb metod för att modifiera genomet hos
Abstract
Flera metoder finns tillgängliga för att manipulera bakteriella kromosomer 1-3. De flesta av dessa protokoll förlitar sig på införandet av villkorligt replikativa plasmider (t.ex. hyser PIR-beroende eller temperaturkänsliga replikoner 1,2). Dessa plasmider integreras i bakteriella kromosomer baserat på homologi-medierad rekombination. Sådana insertionsmutationen mutanter ofta används direkt i experimentella inställningar. Alternativt kan välja för plasmid excision följt av dess förlust göras, vilket för gramnegativa bakterier ofta förlitar sig på mot-valbara levan sukras enzym som kodas av sacB-genen 4. Excision kan antingen återställa före infogning genotyp eller resultera i ett utbyte mellan kromosomen och plasmiden-kodad kopia av den modifierade genen. En nackdel med denna teknik är att det är tidskrävande. Plasmiden måste klonas först, det kräver horisontell överföring till V. cholerae (mest N otably genom parning med ett E. E. coli-stam donator) eller artificiell omvandling av den senare, och excision av plasmiden är slumpmässig och kan antingen återställa den ursprungliga genotypen eller skapa den önskade ändringen, om någon positiv selektion utövas. Här presenterar vi en metod för snabb hantering av V. cholerae-kromosomen (er) 5 (Figur 1). Denna TransFLP metod är baserad på den nyligen upptäckta kitin-medierad induktion av naturlig kompetens denna organism 6 och annan företrädare för släktet Vibrio som V. fischeri 7. Naturlig kompetens möjliggör upptaget av fritt DNA, inklusive PCR-genererade DNA-fragment. När tas upp, rekombinerar DNA med kromosomen eftersom närvaron av minst 250-500 bp flankerande homologa regionen 8. Inklusive en selektionsmarkör in mellan dessa flankerande regionerna gör det lätt att upptäcka vanligt förekommande transformanter.
t "> Denna metod kan användas för olika genetiska manipulationer av V. cholerae och eventuellt även andra naturligt kompetenta bakterier. Vi erbjuder tre nya exempel på vad som kan åstadkommas med denna metod utöver vår tidigare publicerad studie på enstaka gen strykningar och tillsättning av affinitet-tag sekvenser 5. Flera optimering steg om inledande protokollet av kitin-inducerad naturlig omvandling 6 ingår i denna TransFLP protokoll. inkluderar bland annat utbyte av fragment krabba skal av kommersiellt tillgänglig kitin flingor 8, donation av PCR Dessa -härledd DNA som transformerande materialet 9, och tillsatsen av FLP-rekombinationsställen målställen (FRT) 5. FRT-ställen kan sätesriktad excision av selektionsmarkören förmedlas av FLP-rekombinas 10.Protocol
Den TransFLP metoden (figur 1) exemplifieras av tre olika metoder: I) strykning av två intilliggande gener som kodar virulensdeterminanter av V. cholerae (t.ex. ΔctxAB), ii) avlägsnande av ett patogenitetstest ö (t.ex. ΔVPI-1), och iii) integrering av ett T7 RNA-polymeras-beroende promotorsekvens uppströms om en gen av intresse, som därefter gör sitt artificiell uttryck i respektive stammen bakgrund (t.ex., T7-tfoX) (Figur 2).
1. Framställning av kitin flingor
- Vikt 50-80 mg kitin flingor i en standard 1,5 ml plaströr. Detta kan framställas i bulk. Kitin flingor är kommersiellt tillgängliga från Sigma (kat. nr C9213).
- Autoklaven flingor hålla locken på rören öppna.
- Omedelbart stänga locken efter autoklaven har svalnat.
- Förvara autoklaverade kitin flingorvid rumstemperatur.
2. Tillval: Artificiell Transformation av V. cholerae med FLP-rekombinas-kodande plasmid
- Förbered elektrokompetenta V. cholerae celler med standardmetoder 11. Lagra alikvoter av kompetenta celler vid -80 ° C.
- Lägg 1-2 pl av en vanlig mini-preparat av plasmid pBR-FLP 5 till elektrokompetenta V. cholerae-celler och överför blandningen till en elektroporeringskyvett (0,2 cm spaltbredd).
- Applicera en puls på 1,6 kV.
- Lägg 0,9 ml SOC-medium, försiktigt överföra celler till en standard 14 ml rör. Inkubera icke-rörliga för 2,5 till 3 timmar vid 30 ° C.
- Plattan 100 | il och 300 pl på LB-plattor innehållande 100 pg / ml ampicillin och inkubera vid 30 ° C över natten.
- Rena enda klon och lagrar som glycerol lager för framtida TransFLP experiment.
3. Oligonukleotid Design och polymeraskedjereaktion
- Minst sex oligonukleotider krävs för att amplifiera DNA-region (er) av intresse samt FRT-flankerad antibiotikum kassetten genom PCR (figur 3). Det rekommenderas att även inkludera ett par av oligonukleotider priming utanför det insatta PCR-fragmentet. Detta gör kontroll för integration och korrekt excision av FRT-flankerad antibiotikaresistens kassett (t.ex. avbildas som "CHK-up" och "CHK-down 'primers i figurerna 3 till 5).
- Designa oligonukleotiderna # 2, # 3, # 4 och # 5 med omsorg. De bör kunna tillräckligt glödga (t.ex. ~ 28 bp) till mall-DNA. Mall-DNA är genomiskt DNA (gDNA) för primrar # 2 och # 5 och FRT-Kan-FRT-innehållande plasmid-DNA såsom pROD17 12 och pBR-FRT-KAN-FRT (denna studie) för primrar # 3 och # 4 ( Figur 3A).
- Designa primers # 2 till # 5 så omfattande basparning vid sin 5'-ände mellan # 2 / # 3 och # 4 / # 5 respektive (figur 3A
- Utför tre oberoende PCR-reaktioner som en 1: a omgång av PCR. Den första förstärker uppströmsregionen av genen / DNA-regionen av intresse med hjälp av oligonukleotider # 1 och # 2. PCR bör resultera i ett fragment av minst 500 bp i längd för att tillåta homolog rekombination inuti cellerna. Kortare fragment (~ 250 bp) kan vara tillräcklig 8 men rekommenderas inte.
- Parallellt utföra den andra PCR, vilket förstärker FRT-flankerad antibiotikum kassett. För de exempel som ges här använde vi främst APH (kan R). Använd oligonukleotider # 3 och # 4 för denna reaktion (figur 3A).
- Samtidigt, förstärka nedströms DNA-regionen med PCR (tredje prov). PCR-fragmentet bör också vara minst 500 bp i längd. Utför PCR med gDNA som templat och oligonukleotiderna # 5 och # 6 (figur 3A).
- Efter rening av alla tre PCRfragment, utför 2: a omgången av PCR. Använd en lika blandning av alla tre fragmenten från den första omgången som mall. Förstärkningen katalyseras av oligonukleotider # 1 och # 6. Den resulterande PCR-fragmentet (figur 3B) tjänar som transformerande DNA i den naturliga omvandlingen experimentet (figur 1).
4. Kitin-inducerad transformation Naturlig
- Väx V. cholerae celler aerobt i rikt medium vid 30 ° C tills de når en optisk densitet vid 600 nm av cirka 0,5.
- Skörda bakterierna genom centrifugering. Tvätta pelleten en gång i definierat artificiellt medium (DASW 6) innan återsuspendering av cellerna i 2 volymer DASW. Tillsätt 1 ml av kulturen till 50-80 mg steril kitin flingor (förklaras under punkt 1). Om bakterier hamn plasmiden pBR-FLP (tillval punkt 2), tillsätt ampicillin (50 ng / ml) till kulturen. Inkubera vid 30 ° C under 16-24 timmar utan rörelse.
- Lägg till & ge, 200 ng av 2: a-round PCR-härledda fragmentet (förklaras under punkt 3). Blanda försiktigt utan omfattande lossa bakterierna från kitin ytor. Inkubera vid 30 ° C under 24 timmar utan rörelse.
- Vortex kulturen utsträckning för ≥ 30 sek. Sprid 100-300 ul på selektiva LB medium (t.ex. kanamycin eller gentamicin-innehållande LB för exemplen här). Använd dubbla selektiva plattor om bakterierna hyser plasmiden pBR-FLP genom att lägga ampicillin samtidigt till de andra antibiotika. Inkubera plattorna vid 30 ° C under 16-24 timmar eller tills kolonier är synliga.
- Isolera enstaka transformanter från selektiva plattor. Sådana transformanter har ersatt det ursprungliga kromosomala lokus av PCR-fragmentet på grund av en dubbel crossover händelse. Dessa stammar kan användas direkt för ytterligare experiment i fall avlägsnandet av antibiotikumet kassetten är inte nödvändig.
5. Borttagning av selektiv Cassette (er) genom Flp-Rekombination
- Artificiellt förvandla dina transformanterna med plasmid pBR-FLP som beskrivs i punkt 2 om inte gjort innan den naturliga omvandlingen analysen.
- Odla bakterier på LB-agarplattor innehållande ampicillin vid 37 ° C under 16-24 timmar. Alternativ: ändra temperaturen i mellan för 2-3 timmar till 40 ° C som uttryck för FLP från plasmiden pBR-FLP är de-undertryckt vid högre temperaturer 5,10, bakterier överföring till färska plattor efter ca. 8 h av inkubation.
- Test för antibiotika-känslighet (visas här för kanamycin, figur 1) genom restreaking klonerna parallellt på antibiotika-innehållande och antibiotika-fria agarplattor. Isolera enstaka känsliga kolonier. Freeze ampicillinresistenta klonen som glycerol lager om du tänker ytterligare modifiera stam med andra radering / insättning med TransFLP.
6. Plasmid Härdning
- Odla kulturen över natten under aeroba betingelser ochvid 30 ° C. Använd rikt medium utan tillsats av något antibiotikum.
- Valfritt: Odla färsk kultur för 3-6 timmar genom att späda övernattskultur 1:100 i färsk antibiotika-fritt medium.
- Platta eller strimma utspädning (er) av kultur på vanligt LB-agarplatta (er) och inkubera vid 30 ° C under 8-16 timmar (tills kolonier är synliga).
- Test för ampicillin-känslighet av klonerna genom restreaking klonerna parallellt på antibiotika-innehållande och antibiotika-fria agarplattor (figur 1). Freeze ampicillin-känslig stam som glycerol lager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat av de tre exemplen visas i figurerna 4 till 6. Den första strategi som syftar till att ta bort de angränsande generna ctxA och CtxB. Tillsammans kodar den stora virulensfaktorn av V. cholerae, koleratoxin. Vi konstruerade oligonukleotider för TransFLP metod som beskrivits ovan och enligt figur 3. Ursprungsstammen, var den mellanliggande stammen härbärgerande FRT-flankerad antibiotikaresistens kassett vid den ursprungliga DNA-lokus ctxAB och den slutliga stammen raderas för ctxAB och befriades av resistansen kassetten testat alla för deras genotyp (figur 4). Den valda metoden var hel-cell PCR. Vi använde primrar som inte hybridiserar till den transformerande PCR-fragmentet utan endast till kromosomalt DNA (figur 3). Detta tillät oss att bekräfta den platsspecifika utbyte av PCR-fragmentet med den homologa regionen av kromosomen (Figure 4A). PCR-fragmenten separerades genom standard agarosgelelektrofores för att bestämma deras storlek (fig 4B). Denna strategi kan användas för att kontrollera stammen mellanprodukter och bekräfta den slutliga stammen konstruktionen (er).
För det andra exemplet, avlägsnande av en hel genomisk ö, valde vi Vibrio patogenicitet ön 1 (VPI-1) som mål 13. Standarden TransFLP som beskrivs ovan misslyckades i detta fall. Det var känt från tidigare studier att en så stor DNA-region kan bytas med ett liknande storlek DNA-region med kitin-inducerad naturlig omvandling 9. Vi hypotes därför att skillnaden i storlek mellan regionen till raderas, och det ganska kort omvandla PCR-fragment (<3,5 kb) kan vara den begränsande faktorn. Vi beslutade därför att använda den TransFLP metod i två steg: vi först integrerat APH-genen (kan R) föregås av en enda FRT-ställe vid början av VPI-1 (visas i fig 5A). Vi utförde därefter en andra omgång av naturlig omvandling, som tillät oss att infoga ytterligare en antibiotikaresistens kassett (g R, ger gentamicinresistens) följt av en andra FRT-ställe vid slutet av patogeniteten ön (figur 5A). Respektive dubbel-resistent stam elektroporerades att infoga plasmiden pBR-FLP och TransFLP metoden fortsattes såsom beskrivits ovan. Den resulterande stammen saknade hela VPI-1 såsom verifieras genom PCR av renat genomiskt DNA (figur 5B).
För det tredje exemplet vi integrerat en T7 RNA-polymeras-beroende promotorsekvens uppströms om en gen av intresse, i vårt fall den gen som kodar för stora regulatorn av naturliga omvandling tfoX 6. Detta gjordes med hjälp av TransFLP metod med en liten ändring från standard protokoll: vi inkluderat T7 RNA-beroende promoter konsensussekvens enligt Ref. 14 som överhäng i oligonukleotiderna # 4 och # 5. Med denna strategi T7 RNA-polymeras-beroende promotorsekvensen hölls på kromosomen även efter antibiotikaresistens kassetten skars (figur 6). Vi integrerat konstruktionen i V. cholerae-stam ADVCH-T7pol, vilken härbärgerar T7 RNA-polymerasgenen driven av lacUV5-promotorn (Blokesch, opublicerad). För att testa för funktionaliteten av konstruktionen, nämligen T7 RNA-polymeras-beroende uttryck av tfoX, utförde vi naturliga omvandling analyser i LB-medium. Ursprungsstammen är inte naturligt transformeras under dessa betingelser på grund av bristen på tfoX transkription i rikt medium och i frånvaro av den naturliga induceraren kitin (figur 6). Denna fenotyp var oberoende av om T7-RNA-polymeras artificiellt induceras av IPTG eller inte (fig 6, spår 1 och 2, respectively). Emellertid var TransFLP genererade stam ADVCH-T7pol-T7-tfoX :: FRT, som innehåller T7 RNA-polymeras-beroende promotorn uppströms den kompetens genen tfoX, ja naturligtvis transformerbara i rikt medium (Figur 6, spår 3 och 4) . På grund av läckage av lacUV5-promotorn i LB-medium 15 den producerade T7 RNA-polymeras redan transkriberad tfoX från T7 RNA-polymeras-beroende promotorn utan induktion. Detta initierade naturlig kompetens och omvandling bekräftar funktionaliteten hos den integrerade T7-RNA-polymeras-beroende promotorsekvens (Figur 6, spår 3). Denna fenotyp signifikant förbättras genom full induktion av T7-RNA-polymeras på grund av tillsats av induceraren av lacUV5-promotom, IPTG (figur 6, spår 4).
Figur 1.Flödesschema för TransFLP metoden. De sex punkter som beskrivs i detta protokoll utarbetas:.. 1) Beredning av kitin flingor, 2) Tillval: Artificiell omvandling av V. cholerae med Flp-rekombinas-kodande plasmid,. 3) Oligonukleotid konstruktion och polymeraskedjereaktion,. 4) Kitin-inducerad naturlig transformering, 5) Avlägsnande av selektiv kassett (er) genom FLP-rekombination,... 6) Plasmiden härdning Klicka här att visa större bild .
Figur 2. Schematisk representation av tre användningsmöjligheter för TransFLP metoden. I) En 1458 bp DNA-fragment, innehållande koleratoxin som kodar generna ctxA och ctxB, ströks såsom indikeras av Δ. II) ~ 40 kb Vibrio patogenicitet ö 1 (VPI-1 13)togs bort från den vilda stammen. III) En T7 RNA-polymeras-beroende promotor-sekvensen (28 bp) integrerades uppströms tfoX genen. Den röda rektangeln visar den vänstra bakom korta nukleotidsekvensen av en enda FRT webbplats 10. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Förklaring till primer design och prestanda av PCR baserat på strykningen av ctxAB. Panel A: För 1: a omgången av PCR genomiskt DNA (gDNA) och plasmider pROD17 12 och pBR-FRT-Kan-FRT respektive tjänade som mallar. De nödvändiga oligonukleotiderna är # 1 till # 6. Primern # 2 / # 3 och # 4 / # 5 (t.ex. i infälld) bör även ha betydande överlappning med varandra vid sina 5'ends. Panel B: Efter 2: a omgången avPCR, som baseras på de 1 st omgångens PCR-fragment som templat, bör en lång fragment erhållna med användning primerpar # 1 + # 6. Klicka här för att visa större siffra .
Figur 4. Förväntat resultat exemplifieras för ctxAB radering strategi. Den ursprungliga stammen (vildtyp), insertionen mutanten Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, och den slutliga stammen Δ ctxAB :: FRT testades för deras genotyper. Fält A: Schematisk representation av differentiering kraft primerparet ctx-CHK-och ctx-CHK-ner, framför allt med avseende på excision av antibiotikumet kassetten. Panel B: Hela bakterieceller användes som mall i PCR-reaktioner. För att kontrollera den ändrade DNA locus primers CHK-och CHK-ner utnyttjades. De amplifierade PCR-fragmenten separerades genom agarosgelelektrofores och visualiserades med användning av SYBR säker DNA fläck. Spår 1: vildtyp V. cholerae stam, spår 2: stam Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, bana 3: Δ ctxAB :: FRT. Förväntade PCR fragmentstorlekar enligt panel A indikeras till höger. L, 1KB stege (Invitrogen). Klicka här för att se större bild .
Figur 5. Strategi för att verifiera strykningen av genomiska ön. Panel A: Schema av Vibrio patogenicitet ö 1 (VPI-1) (fritt anpassad från Ref 16, ej skalenlig.). För vildtypsstammen regionen av intresse är icke-amplifierbar genom standardmässig PCR och VPI-1-specifika primrarna CHK-och CHK-ner (~ 40 kb). Därför ytterligareoligonukleotid glödgning inom regionen till-vara-deleted applicerades (VC0817-back) tillsammans med VPI-CHK-up. Panel B: Representativ resultat med genomiskt DNA från respektive stammar som mall och paren primer som anges ovanför varje bild. Stammar testas: vildtyp V. cholerae-stam (spår 1), stam VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (spår 2), och ΔVPI-1 :: FRT (spår 3). Storlekar av PCR-fragmenten såsom förutsagts i panel A visas till höger. L, 1KB stege (Invitrogen). Klicka här för att se större bild .
Figur 6. Representativa fenotyp efter insättning av ett artificiellt promotorsekvens. T7 RNA-polymeras-beroende promotorsekvensen integrerades uppströms den kompetens reglerande genen tfoX med TransFLP metod (skiss diagrammet ovan). Föräldrahemmet V. cholerae-stam (ADVCH-T7pol) innehåller en T7-RNA-polymeras-gen driven av lacUV5-promotorn. Diagram: Den moderstam ADVCH-T7pol (spår 1 och 2) och stammen manipuleras av TransFLP (ADVCH-T7pol-T7-tfoX :: FRT, spår 3 och 4) testades för naturlig transformativ i frånvaro (spår 1 och 3 ) eller närvaro av 1 mM IPTG (spår 2 och 4). Omvandla genomiskt DNA härlett från stam A1552-LacZ-Kan 8. Transformation frekvenser ges på Y-axeln. <Dl, under detektionsgränsen av ~ 5 x 10 -8. ** P <0,01 (bestämt genom studentens t-test av log-transformerade data). Svart pil med texten "T7":. T7 RNA-polymeras-beroende promotorsekvens Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den TransFLP metod som beskrivits ovan och på andra ställen 5 utsträckning har använts i vårt laboratorium. Den typ av genetiska manipulationer som är genomförbara inkluderar bland annat: deletion av enskilda gener och kluster genprodukter, deletion av genomiska öar (t.ex. VPI-1), insättning av sekvenser uppströms om en gen av intresse (t.ex., promotorsekvenser) och insättning av sekvenser vid slutet av en specifik gen (t.ex. kodar affinitetsmarkörer).
En import förutsättning för TransFLP är att respektive V. cholerae-stam är naturligt transformerbara. Detta är ibland inte är fallet, särskilt i isolat härledda från kolerapatienter. Sådana stammar är ofta muterade i kvorumet avkänningskretsen t.ex. inom den gen som kodar den stora regulatorn av quorum sensing, HapR 17. Att ge tillbaka en kopia av hapR återställer naturlig transformativ i dessa stammar 6 som exemplierad för HapR-defekta stam N16961 18.
Möjliga modifieringar kan införlivas, såsom anrikning av bakterier efter naturlig omvandling 8 i det fall frekvensen är för låg. Observera att omvandlingen frekvensen är i allmänhet lägre i de fall pBR-FLP plasmiden redan finns samtidigt gör kitin-inducerade naturliga transformationstest. Detta orsakas förmodligen genom partiell läckage av temperaturkänsliga expression av FLP-genen från pBR-FLP, vilket skulle resultera i för tidig excision av antibiotikaresistens kassetten och oförmåga att välja för dessa transformanter. Vi rekommenderar därför kritiska fall att infoga pBR-FLP plasmiden efter den naturliga omvandlingen steget.
En annan avgörande steg är den 2: a omgången av PCR, som kombinerar de tre 1 st runt PCR-fragmenten. Det kan inträffa att partiella fragment är närvarande efter PCR reaInsatser (t.ex. en partiell montering av endast fragment "upp" och "FRT-Kan-FRT 'enligt figur 1). Detta är försumbar, kan som dubbel homolog rekombination med den målsökta kromosomala regionen förekommer inte i denna situation. Eftersom endast transformanter härbärgerande antibiotikaresistens kassetten väljs för, alla andra transformanter med icke-önskade DNA utbyten uteslutna.
En annan punkt att tänka på är med avseende på upprepning av förfarandet för flera omgångar. Vi har redan framgångsrikt kombinerat strykningen av ctxAB genklustret med strykningen av patogenicitet ön (VPI-1) och en annan virulensgencluster (Blokesch, opublicerad). Dessutom har vi integrerat effektivt T7 RNA-polymeras-beroende promotorn inom dessa stammar (uppströms tfoX och på andra håll). Dock bör tänkt genotyp konstant testas för alla stam intermediärer (t.ex. genom koloni-PCR som demonstrated i fig 4). Detta kommer att bidra till att utesluta oönskade Flp-medierad rekombination av vänster bakom FRT ärr (visas som rött rektangulära i alla siffror) med varandra medan pBR-FLP plasmiden kvar i bakterierna. Detta kan sannolikt bortses avlägset belägna gener, som sannolikheten att excision av i-mellan regionen skulle vara dödlig på grund av radering av viktiga gener är mycket hög.
Slutligen vill vi diskutera raderingen av gener inom operon. Vi kan inte utesluta att strykningen av en uppströms gen, vilket lämnar en FRT ärr bakom, kan ändra uttrycket av nedströms gen (er). För att säkerställa att denna effekt inte orsakar observerbara fenotypen, men att detta verkligen beror på borttagningen är en komplettering analys rekommenderas. Annan kontroll som vi redan framgångsrikt har använts i laboratoriet är att integrera de FRT ärr nedströms genen av intresse without bort senare. Vi har inte observera sådana problem i vårt laboratorium ännu men kan inte utesluta deras existens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Jag skulle vilja erkänna Olga de Souza Silva för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (SNSF) Grant 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
