Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem Published: October 8, 2012 doi: 10.3791/3761

Summary

Arasında genomunu değiştirmeye hızlı bir yöntem

Abstract

Çeşitli yöntemler bakteri kromozomu 1-3 işlemek için kullanılabilir. Bu protokollerin çoğu (örneğin, pir-bağımlı veya ısıya duyarlı Replikon 1,2 yataklık) şartlı replikatif plazmid ekleme güveniyor. Bu plazmid homoloji-aracılı rekombinasyon bazlı bakteri kromozomu içine entegre edilmiştir. Bu tür mutantlar insersiyonal çoğu kez direkt olarak deney ortamlarda kullanılır. Alternatif olarak, onun kaybı, ardından plazmid çıkarılması için seçim sık sık SACB gen tarafından kodlanan 4 karşı tarafından seçilebilir levan sukraz enzimi dayanır Gram-negatif bakteriler için, hangi gerçekleştirilebilir. Eksizyonu ya da ön-yerleştirme genotip ya da kromozom ve modifiye geninin plazmid ile kodlanmış kopya arasında bir değişim ile sonuçlanır geri olabilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, zaman alıcı olmasıdır. Plazmid ilk klonlanmış gerekmektedir; bunu V. içine yatay transferi gerektirir cholerae (en fazla n otably E ile çiftleştirilerek coli suşu verici) ya da ikinci bir yapay dönüştürülmesi; ve plazmid eksizyonu ve rasgele ya da ilk genotip geri ya da herhangi bir pozitif seçim sarf edilir ise, istenen değişikliği oluşturabilir. Burada, V. hızlı manipülasyon için bir yöntem mevcut cholerae kromozom (lar) 5 (Şekil 1). Bu TransFLP yöntem, V. gibi cins Vibrio bu organizmanın 6 ve diğer temsilci doğal yetkinlik yeni keşfedilen kitin-aracılı indüksiyon dayanmaktadır fischeri 7. Doğal yetkinlik PCR tarafından oluşturulan DNA parçaları dahil olmak üzere ücretsiz DNA alımını sağlar. Bir kez alınır, DNA homolog bölgenin 8 sınırdaş 250-500 bp asgari varlığını verilen kromozomu ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir. Bu komşu bölgeleri arasındaki bir seçim işaretleyici İçeren sık görülen transformantlar kolay algılanmasını sağlar.

T "> Bu yöntem, V. cholerae, farklı genetik manipülasyonu için kullanılabilir ve potansiyel olarak da diğer doğal olarak yeterli bakteri olabilir. bizim daha önce yayınlanmış bir gen silme üzerinde çalışma ve ek olarak, bu yöntem tarafından gerçekleştirilebilir ne üç yeni örnekler sağlamak benzerlik etiketlenmesi sekansları 5 ek. kitin kaynaklı doğal dönüşüm 6 başlangıç ​​protokolünü ilgili birçok iyileştirme adımlar bu TransFLP protokol içinde bu buluşa katılmıştır. Bunlar, diğerlerinin arasında ticari olarak mevcut kitin pul 8, PCR tarafından yardım yengeç kabuk parçalarından replasman, madde 9, ve FLP-rekombinasyon hedef sitesi (FRT) 5 transforme ilave olarak türetilmiş DNA. FRT sitesi FLP rekombinaz 10 tarafından aracılık seçim işaretleyicinin her bölge-yönlendirmeli eksizyon izin verir.

Protocol

TransFLP yöntem (Şekil 1) üç farklı yaklaşımlar ile örneklenmiştir: I), V nin ölümcüllüğünün belirleyicilerini kodlayan genin iki bitişik silme cholera (örneğin, ΔctxAB), II) bir patojenisite ada (örn., ΔVPI-1) çıkarılması ve III) T7 RNA polimeraz promotörü sekans bağlı olan entegre bir gen yukan-of-ilgi, daha sonra izin veren, ilgili gerginlik arka planda yapay ifadesi (örneğin, T7-tfoX) (Şekil 2).

1. Chitin Taneli hazırlanması

  1. Standart bir 1.5 ml plastik tüp içinde kitin gevreği ağırlığı 50-80 mg. Bu, toplu olarak hazırlanabilir. Chitin pul Sigma (kat. numarası C9213) dan ticari olarak temin edilebilir.
  2. Tüplerin kapaklarını açık tutarak gevreği otoklavlayınız.
  3. Otoklav soğuduktan hemen sonra kapaklarını kapatın.
  4. Mağaza otoklavlanmış kitin gevreğioda sıcaklığında.

2. Opsiyonel: V. Yapay Dönüşüm FLP Rekombinaz kodlama Plazmid ile cholerae

  1. Electrocompetent hazırlayın V. standart yöntemler kullanılarak 11 cholerae hücreleri. -80 Yetenekli hücrelerin alikotları saklayın ° C.
  2. Electrocompetent plazmid pBR-bdp 5 düzenli bir mini hazırlık 1-2 ul ekleyin V. cholera hücresi ve bir elektroporasyon küvetine (0.2 cm boşluk genişliği) karışımı içine aktarın.
  3. 1.6 kV bir darbe uygulayın.
  4. 0.9 mL SOC orta ekleyin, hafifçe bir standart 14 ml tüp hücre aktarın. 30 2,5-3 saat süreyle hareketsiz inkübe ° C.
  5. Levha 100 ul ve 30 ° C'da gece boyunca 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB ve inkübe plakalar üzerinde 300 ul.
  6. Gelecekte TransFLP deneyler için gliserol stok olarak tek bir klondan ve mağaza arındırın.

3. Oligonükleotid Tasarım ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu

  1. En az altı oligonükleotidler ilgilenilen DNA bölge (ler) de olduğu gibi PCR ile FRT yanlı antibiyotik kaseti (Şekil 3) yükseltmek için gereklidir. Aynı zamanda eklenen PCR parçası dış astar oligonükleotidler bir çift eklemek için tavsiye edilir. Bu entegrasyon ve FRT-sardığı antibiyotik direnç kasedi (örn. Şekil 3 ila 5 'chk-up' ve 'chk-down' primerleri olarak tasvir) doğru eksizyon için kontrol sağlar.
  2. Oligonükleotidler # 2, # 3, # 4 ve # 5 dikkatle tasarlayın. Onlar yeterince şablon DNA (örn. ~ 28 bp) tavlama gerekir. Şablon DNA primerleri için genomik DNA (gDNA) gibi pROD17 12 ve pBR-FRT-KAN-FRT (Bu çalışma) primerleri için # 3 ve # 4 (gibi # 2 ve # 5 ve FRT-Kan-FRT-içeren plazmid DNA Şekil 3A).
  3. Izin # 5 primerler # 2 tasarımı sırasıyla, # 2 / # 3 ve # 4 / # 5 arasındaki 5'-uç taban eşleştirme geniş (Şekil 3A
  4. PCR 1. yuvarlak olarak üç bağımsız PCR reaksiyonları gerçekleştirin. Ilk olarak bir oligonükleotidler # 1 ve # 2 yardımıyla gen / DNA bölge-of-ilgi yukan bölgesi yükseltecektir. PCR hücreleri içinde homolog rekombinasyon izin vermek için uzunluk olarak en az 500 bp'lik bir fragmanı ile sonuçlanmalıdır. Shorter parçaları (~ 250 bp) yeterli 8 olabilir ama tavsiye edilmez.
  5. Paralel olarak FRT-sardığı antibiyotik kaset yükselterek ikinci PCR gerçekleştirmek. Örnekler burada sağlanan için biz esas aph (kan R) kullanılmıştır. Kullanım oligonükleotidler bu reaksiyon (Şekil 3A) için # 3 ve # 4.
  6. Eş zamanlı PCR (üçüncü örnek) tarafından aşağı DNA bölgesinde yükseltmek. PCR parçası da uzunluğu en az 500 bp olması gerekir. Şablon ve oligonükleotidler # 5 ve # 6 (Şekil 3A) gibi gDNA ile PCR gerçekleştirin.
  7. Her üç PCR saflaştırma sonrasındafragmanlar, PCR 2. turda gerçekleştirmek. Şablon olarak ilk turda elde edilen her üç parçaları eşit karışımı kullanın. Amplifikasyon oligonükleotidler # 1 ve # 6 tarafından katalize edilir. Ortaya çıkan PCR parçası (Şekil 3B) doğal transformasyon deneyi (Şekil 1) DNA dönüşüm olarak hizmet vermektedir.

4. Chitin indüklenen Doğal Dönüşüm

  1. Büyümek V. 30 zengin besiyerinde aerobik cholerae hücreleri ° C de yaklaşık 0.5 600 nm'de absorbansı ulaşana kadar.
  2. Santrifüjleme ile hasat bakteri. DASW 2 cilt hücreleri resuspending önce tanımlanan yapay ortam (DASW 6) kez pelet yıkayın. Steril kitin gevreği (nokta 1 altında açıklanan) 50-80 mg kültürü 1 ml ekleyin. Kültür ise bakteriler liman plazmid pBR-bdp (opsiyonel noktası 2), eklenti ampisilin (50 mg / ml). Hareket olmadan 16-24 saat süre ile 30 ° C'de inkübe edin.
  3. G & Eklee; 2. boyunca PCR-türetilmiş fragmanı (Madde 3 altında açıklanmıştır) 200 ng. Yoğun kitin yüzeylerinden bakteri sökmeden dikkatlice karıştırın. Hareket olmadan 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
  4. ≥ 30 sn için yoğun Vorteks kültür. Seçici LB besiyeri yaprakları (burada sağlanan örnekler örneğin kanamisin veya gentamisin içeren LB plakalar) üzerine 100-300 ul yayılır. Bakteri diğer antibiyotiklere beraber ampisilin ekleyerek pBR-bdp plazmid liman eğer çift seçici tabak kullanın. 16-24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe plakaları veya koloniler görünür oluncaya kadar.
  5. Seçici plakaları tek transformantlar ayırın. Böyle transformantlar çift çapraz olay nedeniyle PCR parçası tarafından özgün kromozomal lokus yerini almıştır. Antibiyotik kaset kaldırılması gerekli değildir, ve dolayısıyla bu suşlar direkt olarak başka deneyler için de kullanılabilir.

5. FLP tarafından Seçici Kaset giderimi (ler)-Rekombinasyon

  1. Doğal dönüşümü tahlilinden önce yapmadıysanız 2. maddede açıklandığı gibi yapay pBR-bdp plazmid ile transformantlar dönüşümü.
  2. 16-24 saat boyunca 37 ° C'de ampisilin içeren LB agar plaklarına bakteriler büyümek. Seçenekler: 40 2-3 saat süreyle arasındaki sıcaklık değiştirmek ° C plazmid pBR-bdp den bdp ifadesi olarak yüksek sıcaklıklarda 5,10 de-de bastırılanlardır; yakl taze plakaları transfer bakteri. Inkübasyon 8 sa.
  3. Antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plaklarına paralel klonlar restreaking tarafından; antibiyotik duyarlılık (Şekil 1 kanamisin için buraya gösterdi) için test. Tek duyarlı koloniler izole edin. Eğer daha başka silme / TransFLP kullanarak ekleme ile gerginlik değiştirmek istiyorsanız, gliserol stok olarak ampisiline dirençli klon dondurun.

6. Plazmid Kür

  1. Aerobik koşullar altında gecede kültür büyütün ve30 ° C'de Herhangi bir antibiyotik ilave olmadan zengin ortamı kullanın.
  2. Opsiyonel: Taze antibiyotik içermeyen ortamda gecede kültürü 1:100 sulandırarak 3-6 saat süreyle taze kültür büyütün.
  3. Levha veya çizgi düz LB agar plaka (lar) kültür seyreltme (lar) ve 30 inkübe ° 8-16 saat süreyle C (koloniler görebilir kadar).
  4. Antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plakaları (Şekil 1) üzerinde paralel olarak klonlar restreaking ile klon ampisilin-duyarlılık için test edin. Gliserol stok olarak ampisilin duyarlı suşu dondurun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Üç örnek Örnek 6 için sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir. İlk yaklaşım komşu genlerin CTxA ve ctxB silinmesi hedeflenmiştir. Birlikte V. önemli virulans faktörü kodlayan cholerae kolera toksin. Yukarıda tarif edilen ve Şekil 3'e uygun olarak biz TransFLP yöntem için oligonükleotidler tasarlanmıştır. Ebeveyn zorlanma, ctxAB orijinal DNA lokusu ve ctxAB için silinir ve direnç kasedi kurtulmuş nihai gerilimlerde FRT-sardığı antibiyotik direnç kasedi barındıran ara suşu tüm (Şekil 4) kendi genotipi açısından test edilmiştir. Tercih edilen yöntem, tüm-hücre PCR yapıldı. Biz, ancak sadece kromozomal DNA ile transforme PCR parçası (Şekil 3) ile tavlama yok primerler kullanılır. Bu bizi kromozom homolog bölge (F ile PCR fragmanının site-spesifik alışverişi doğrulamak için izinŞEKIL 4A). PCR parçaları (Şekil 4B) kendi büyüklüğünü belirlemek için standart agaroz jel elektroforezi ile ayrıldı. Bu strateji, gerilme ara kontrol etmek ve nihai gerilme yapı (lar) teyit etmek için de kullanılabilir.

İkinci örnekte, bir bütün genomik adanın kaldırılması, hedef 13 olarak Vibrio patojenite ada 1 (VPI-1) seçti. Yukarıda tarif edilen standart TransFLP işlem, bu durumda başarısız oldu. Böyle büyük bir DNA bölgesinde kitin kaynaklı doğal dönüşümü 9 kullanarak benzer bir büyüklükte DNA bölgeye göre takas edilebilir önceki çalışmalardan biliniyordu. Bu nedenle hipotezi bölge-silinecek ve oldukça kısa dönüşüm PCR parçası (<3,5 kb) sınırlayıcı faktör olabilir arasındaki boyut farkı. Bu nedenle iki adımda TransFLP yöntemini kullanmaya karar verdi: ilk tek FR önünde aph gen (kan R) entegreVPI-1 başlangıcında (Şekil 5A'da gösterildiği gibi) T sitesi. Biz sonra bize patojenite adası (Şekil 5A) sonunda ikinci FRT site tarafından izlenen bir ilave antibiyotik direnç kasedi (g R, gentamisin direnci görüşmekte) eklemek için izin doğal bir dönüşüm ikinci tur gerçekleştirildi. Sırasıyla çift-dirençli suş plazmid pBR-FLP ve yukarıda tarif edildiği gibi devam edildi TransFLP yöntem eklemek için electroporated edildi. Genomik DNA (Şekil 5B) saflaştırılmış PCR ile doğrulanması olarak çıkan gerginlik tüm VPI-1 yoktu.

Üçüncü Örneğin biz yukarı bir gen-of-ilgi, bizim durumumuzda gen doğal dönüşümü tfoX 6 ana regülatörü kodlayan bir T7 RNA polimeraz bağımlı promoter sekansı entegre. Bu standart protokol hafif bir değişiklik ile TransFLP yöntemi kullanılarak yapıldı: biz T7 RNA bağımlı p dahildirRef göre romoter uzlaşma dizisi. 14. oligonükleotidler # 4 ve # 5 içine çıkıntılar gibi. Bu strateji ile T7 RNA polimeraz bağımlı promoter sekansı antibiyotik direnci kaseti (Şekil 6) eksize edildikten sonra dahi kromozomu üzerinde tutuldu. Biz V. içine yapı entegre lacUV5 organizatörü (Blokesch, yayınlanmamış) tarafından yönlendirilen T7 RNA polimeraz geni barındıran cholerae zorlanma ADVCH-T7POL. TfoX of T7 RNA polimeraz ifade bağlı, yani bir yapının özelliği için test etmek için, LB ortamı içinde doğal transformasyon deneyleri yapıldı. Ebeveyn gerilme zengin bir ortam içinde ve onun doğal indükleyici kitin (Şekil 6) yokluğunda tfoX transkripsiyon olmaması nedeniyle, bu koşullar altında, doğal dönüştürülebilir değildir. Bu, fenotipik olarak T7 RNA polimeraz yapay olarak (Şekil 6, şeritleri 1 ve 2, respe IPTG tarafından uyarılan verilip bağımsız olduğuctively). Bununla birlikte, akış yukarı yetki gen tfoX arasında T7 RNA polimeraz promot.örünü içerir, bağlı TransFLP oluşturulan gerilme ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT, zengin ortam (Şekil 6, şerit 3 ve 4) gerçekten de doğal olarak dönüştürülebilir idi . LB ortamı 15 indüksiyon olmadan T7 RNA polimeraz promotörü,-bağımlı üretilmiş T7 RNA polimeraz önceden transkripsiyonu tfoX içinde lacUV5 arttırıcının sızıntı nedeniyle. Entegre T7 RNA polimeraz-bağımlı promoter sekansı (Şekil 6, yol 3) işlevselliğini teyit eden bu başlatılan doğal yetki ve dönüşümü. Bu, fenotipik sayesinde önemli ölçüde lacUV5 promotör, IPTG (Şekil 6, şerit 4) indükleyici ilave için T7 RNA polimeraz ının tam indüksiyon ile geliştirilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1.TransFLP yöntemi akış şeması. Bu protokolü açıklanan altı puan hazırlanmaktadır:.. 1) kitin gevreği hazırlanması; 2) İsteğe bağlı: V. Yapay dönüşümü FLP Rekombinaz kodlama plazmid ile cholerae,. 3) Oligonükleotid tasarım ve polimeraz zincir reaksiyonu;. 4) Chitin kaynaklı doğal dönüşümü; 5) bdp-rekombinasyon tarafından seçici kaset (ler) Uzaklaştırılması;... 6) Plazmid kür buraya tıklayın büyük bir rakam görmek için .

Şekil 2,
Şekil 2. TransFLP yöntemi için üç uygulama olanakları şematik gösterimi. Δ ile gösterildiği gibi I), kolera toksini kodlayan genler CTxA ve ctxB ihtiva eden bir 1458 bp DNA fragmanı, silindi. II) ~ 40 kb Vibrio patojenisite ada 1 (VPI-1 13)yabani tip soyla silindi. Iii) T7 RNA polimeraz promotörü sekans-bağımlı (28 bp) tfoX genin yukarı akış yönünde entegre edilmiştir. Kırmızı dikdörtgen tek bir FRT sitesi 10 kısa nükleotid dizisi arkasındaki sol gösterir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3
Şekil 3. CtxAB çıkartılması dayalı primer dizaynı ve PCR performansı için açıklama. Panel A: şablon olarak görev sırasıyla PCR genomik DNA (gDNA) ve plazmid pROD17 12 ve pBR-FRT-Kan-FRT, ve 1. turunda. Gerekli oligonükleotidler # 1 # 6 vardır. Primer # 2 / # 3 ve # 4 / # 5 (ilave olarak örnek) da onların 5'ends birbirlerine önemli örtüşen sahip olmalıdır. Panel B: 2. turdan sonraŞablonlar, uzun bir parçası primer çifti # 1 + # 6 kullanılarak elde edilmelidir 1. turda PCR parçaları dayanmaktadır PCR,. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Beklenen sonuç ctxAB silme stratejisi için örneklendirilmiştir. Orijinal suşu (yabani tip), insersiyonal mutant Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, ve nihai gerilme Δ ctxAB :: FRT onların genotipleri açısından test edilmiştir. Panel A: en önemlisi antibiyotik kaset eksizyonu ile ilgili ctx-chk-aşağı primer çifti ctx-chk-up ve, farklılaşma gücü şematik gösterimi. Panel B: Bütün hücre bakteri PCR reaksiyonu içinde şablon olarak kullanılmıştır. Değişti DNA denetlemek için lokus primerler chk-up ve chk aşağı yararlanılmıştır. Amplifiye PCR parçaları agaroz jel elektroforezi ile ayrılmış ve leke SYBR güvenli DNA kullanılarak görüntülendi edildi. Lane 1: Yabani tip V. cholerae zorlanma; lane 2: gerilme Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT; şeritli 3: Δ ctxAB :: FRT. Beklenen PCR parçası boyutlarda panel göre bir sağ tarafta gösterilmiştir. L, 1kb merdiveni (Invitrogen). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5. Genomik adanın silinmesini doğrulamak için Strateji. Panel A: Vibrio patojenisite ada 1 (VPI-1) (Ref serbestçe uyarlanan 16; ölçeksiz.) Şeması. Yabani tip soyla için ilgi bölgesi standart PCR ve VPI-1 spesifik primerler chk-yukarı-aşağı ve chk (~ 40 kb) vasıtasıyla olmayan amplifiable olup. Bu nedenle ek biroligonükleotid bölge içinde tavlama için-silinebilir VPI-chk-up ile birlikte (VC0817-back) uygulandı. Panel B: Örnek sonucu şablon ve primer çiftleri olarak sırasıyla suş genomik DNA kullanılarak her bir görüntü üzerinde gösterilmiştir. Suşlar Test: Yabani tip V. cholerae suşu (kulvar 1), şekil VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (kulvar 2) ve ΔVPI-1 :: FRT (yol 3). Olarak panelinde tahmin PCR parçalarının Ebatları A sağda gösterilir. L, 1kb merdiveni (Invitrogen). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6
Şekil 6.. Örnek fenotipi yapay promoter sekansı sokulmasından sonra. T7 RNA polimeraz promotörü sekans bağlı TransFLP metodoloji kullanılarak yetki düzenleyici gen tfoX yukarı akış yönünde birleştirilmiştird (Grafiğin üstündeki kroki). Ebeveyn V. cholerae suşu (ADVCH-T7POL) lacUV5 promotör tarafından sürülen bir T7 RNA polimeraz geni içerir. Grafik: Ebeveyn suşu ADVCH-T7POL (yollar 1 ve 2) ve TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT, şerit 3 ve 4) tarafından manipüle suşu (yollar 1 ve 3 yokluğunda doğal Dönüştürülebilirlik için test edilmiştir ) ve 1 mM IPTG (şerit 2 ve 4) varlığı. Transforme genomik DNA suşu A1552-lacZ-Kan 8 elde edildi. Dönüşüm frekansları Y-ekseni üzerinde yer almaktadır. <Dl ~ 5 x 10 -8 tespit sınırının altında. ** P <0.01 (olarak log-dönüştürülmüş verileri student t testi ile belirlenir). Metin 'T7' Siyah ok:. T7 RNA polimeraz bağımlı promoter sekansı büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TransFLP yöntemi 5 yoğun laboratuarımızda kullanılmıştır yukarıda ve yerde anlatılmıştır. Mümkün olan genetik manipülasyon tür diğerlerinin yanı sıra şunları içerir: tek genler ve gen kümelerinin silinmesi, genomik adalar silme (örn., VPI-1), ilgilenilen bir gen (örneğin, promoter dizileri) yukarı akış yönünde dizilerin yerleştirilmesi ve ekleme , belirli bir gen (örneğin, kodlama afinite etiketleri) sonunda dizileri.

TransFLP için önemli bir önkoşul ve söz konusu V'dir cholerae zorlanma doğal transformable. Bu özellikle kolera hastalardan elde edilen izolatların, bazen böyle değildir. Bu tür suşlar sıklıkla çoğunluğu algılama, HapR 17 ana regülatörü kodlayan gen içinde, çoğunluğu algılama devresi örneğin içinde mutasyona uğramış vardır. HapR bir kopyasını geri verilmesi exempli bu suşların 6 doğal Dönüştürülebilirlik geriHapR kusurlu suşu N16961 18 tanımladı.

Muhtemel değişiklikler, doğal transformasyon 8 durumda ise oldukça düşük olan sonra bakteri zenginleştirme olarak, dahil edilebilir. Chitin kaynaklı doğal transformasyon testi yaparken pBR-bdp plazmid zaten mevcut olması durumunda değişim sıklığı genel olarak düşük olduğunu unutmayın. Bu, büyük ihtimalle antibiyotik direnç kasedi ve bu transformantlar için seçmek için olmamaları nedeniyle erken eksizyonu neden olur pBR-FLP dan FLP gen, bir sıcaklığa duyarlı ifade kısmi sızıntı neden olur. Bu nedenle doğal dönüşümü adımdan sonra pBR-bdp plazmid eklemek için kritik durumlar için önerilir.

Başka kritik adım üç 1. boyunca PCR parçaları birleştirir PCR 2. yuvarlak olduğunu. Bu kısmi parçaları PCR rea sonra mevcut olduğunu ortaya çıkabilirction (örneğin, sadece parçalarının kısmi derleme 'yukarı' ve 'FRT-Kan-FRT' Şekil 1'e göre). Bu önemsiz, hedeflenen kromozomal bölgede olduğu gibi çift homolog rekombinasyon Bu durumda ortaya olamaz. Antibiyotik direnci kaset yataklık sadece transformantlar için seçilir gibi, sigara içmek istenilen DNA değişimleri ile diğer tüm transformantlar hariçtir.

Akılda tutulması gereken bir diğer nokta da birkaç tur için prosedürün tekrarına saygı ile. Biz zaten başarıyla patojenite adası (VPI-1) ve başka bir virulans gen kümesi (Blokesch, yayınlanmamış) delesyonu ile ctxAB gen küme silinmesini birleştirdik. Ayrıca, biz etkili bu suşların (upstream tfoX ve başka yerlerde) içinde T7 RNA polimeraz-bağımlı promotor entegre etmiş. Ancak, öngörülen genotip sürekli d gibi koloni PCR ile (örneğin, tüm gerginlik ara maddeler için test edilmelidir) Şekil 4 de emonstrated. Bu pBR-bdp plazmid hala bakteri varken birbirleriyle FRT izleri arkasında sol istenmeyen FLP-aracılı rekombinasyon (bütün rakamlar kırmızı dikdörtgen olarak gösterilen) dışlamak için yardımcı olacaktır. Bu muhtemelen, uzaktan bulunan genler için ihmal arasındaki bölgenin eksizyonu elzem genlerin silinmesi nedeniyle ölümcül olacağı olasılığı çok yüksek olan olabilir.

Nihayet, biz operonlar içindeki genlerin silinmesi tartışmak istiyorum. Biz arkasında bir FRT iz bırakır bir upstream geninin silinmesi aşağı gen (ler) ifade değişebilir olduğunu göz ardı edemeyiz. Bu etki gözlemlenebilir ortaya çıkmasına neden olmadığı, fakat bu gerçekten silme neden olduğunu temin etmek için, bir tümleme tahlil tavsiye edilir. Biz zaten başarıyla laboratuvarda kullanılan olmasının bir diğer kontrol geni-faiz ezelî ve FRT skar mansap entegrasyonut ikincisi silme. Biz henüz Laboratuvarımızda tür sorunları gözlemlemek vermedi ama onların varlığını göz ardı edemeyiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Ben teknik yardım için Olga de Souza Silva kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) Hibe 31003A_127029 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitin flakes Sigma C9213 Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) Biorad 165-2100 Or comparable electroporators

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
  3. Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
  4. Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
  5. De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
  6. Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
  7. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
  8. Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
  9. Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
  10. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  12. Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
  13. Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
  14. Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
  15. Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
  16. Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
  17. Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
  18. Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).

Tags

İmmünoloji Sayı 68 Mikrobiyoloji Genetik doğal dönüşümü DNA alımı FLP rekombinasyon kitin,
TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blokesch, M. TransFLP — AMore

Blokesch, M. TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination. J. Vis. Exp. (68), e3761, doi:10.3791/3761 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter