Summary
SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어 있습니다
Abstract
스핀들 조립 검사 점 (SAC) 메커니즘 염색체가 제대로 연결되어 때까지 anaphase 발병을 막기 위해 염색체 kinetochores 및 스핀들 microtubules 간의 상호 작용을 모니터링 활동적인 신호입니다. 세포는 aneuploidy 또는 게놈 불안정성, 그리고 따라서 암 및 출생 결함과 알츠하이머의 1과 같은 다른 인간의 질병을 방지하기 위해이 메커니즘을 사용합니다. 같은 Mad1 같은 SAC 구성 요소의 수, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10,로드 및 오로라 B 키나제는 식별 그리고 그들은이 모든 kinetochore 역동적인 단백질들은되었습니다. 증거 SAC 신호를 시작한 곳을 kinetochore는 것이 좋습니다. SAC 주요 단속 대상은 Cdc20입니다. Cdc20는 필수 APC / C (naphase P romoting C omplex 또는 C yclosome) activators 셋 중 하나이며 또한 kinetochore 역동적인 단백질 4-6입니다. 활성화되면 SAC가의 활동을 억제PC / C는이를 이행 7,8를 anaphase하기 metaphase 방지, 두 가지 핵심 기판, cyclin B와 securin의 파괴를 방지합니다. SAC 신호가 시작하고 조립 kinetochores와 그 기능이 여전히 애매 남아 억제하기 위해 APC / C에 중계되고 정확히 어떻게.
Drosophila는 매우 취급하기 쉬운 실험 시스템이다; 훨씬 간단하고 좀더 이해 유기체는 인간 하나와 비교하여 공통점 주 기본 프로세스니다. 초기 배아는 동기 13 급격한 핵분열주기 (8~10분 진행되는 동안 그것은 특히 공간과 시간에서 mitotic 이벤트의 시각화를 위해,, 아마도, 살아있는 세포에서 바이오 이미징 연구에 사용할 수있는 가장 좋은 생물 중 하나입니다 25 ° C)에서 각 사이클과 점차 단지 피질 구 밑에 하나의 단일층의 핵을 구성합니다.
여기에서 나는 유전자 변형 Drosophila expres를 사용하여 바이오 이미징 방법을 제시노래 GFP (녹색 형광 단백질) 또는 관심과 SAC 구성 요소의 일부 GFP 융합 단백질, Cdc20와 Mad2의 이미지를 보여줌으로써, 파리에서 SAC 기능을 공부 Leica TCS SP2 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 시스템의 변종 타겟 단백질 , 예를 들어 있습니다.
Protocol
1. 유전자 변형 파리 및 유지 관리
- 유전자 변형이 데모에서 사용되는 쳐냈습니다 : Ubq-GFP-Cdc20 (II), Ubq-RFP-His2B (X *); Ubq-GFP-Cdc20 (II *), Ubq-GFP-Cdc20 (II *); mad2 어이 ( III *) 및 Ubq-GFP-Cdc20 유전자 변형은 빠르다는 이전 표준 P-요소 매개 유전자 변형 접근법 10,11 및 Ubq-RFP-His2B가 UMR 144 CNRS / 연구소 퀴리의 Yohanns Belaïche에서 일종의 선물이다를 통해 실험실에서 생성된 프랑스 파리. 그들은 표준 Drosophila 유전자를 통해 Mad2 돌연변 배경으로 도입되었습니다. mad2 어이 원래 돌연변이 라인은 블루밍턴 주식 센터에서 구입했습니다. 우리는이 프로토콜에 transformants을 높이기 위해 사용되는 절차를 논의하지 않습니다.
참고 : * 염색체 수를 나타냅니다. - 유지 보수 : 트렌스 제닉 파리는 25 살에 유지되었다 플라스틱 튜브 containin에서 ° CG는 음식을 비행기 맨 위에 추가적인 건조 효모 분말로. 유리병은 일상적으로 성장 조건 (그림 1)에 따라 모든 3-4주 대체되었습니다.
2. (연구소 규모) 식품 준비 들아
- 파리 식품 혼합의 적절한 금액은 구성 요소를 분해하기 위해 끊임없이 저어로 가열되었다.
- 이 매체의 8-10 약 ML은 Jencons 과학 (주) 연동 펌프를 사용하여 각 플라스틱 약병 (2.5 cm 직경 X 8cm 길이)에 슬러리로 배포되었다.
- 식품 슬러리가 설정되었고 실온으로 냉각되면 유리병 그런 다음 면화 폼 플러그로 연결됩니다. 이러한 음식 튜브 그런 다음 비닐 봉투에 밀봉하고 ° C에서 나중에 사용하기 위해 4에서 유지됩니다 트레이에 배치됩니다.
3. 소규모 에그 모음
- 2~3일 오래된 파리 성충의 약 50 쌍은 레이에 대해 25 표면에 대한 추가적인 건조 효모 분말 함께 제공된 신선한 플라이 식품 유리병 ° C로 전송된배아를 접근한.
- 파리 그런 다음 신선한 유리병에 매 시간마다 양도 및 핵 점차 피질로 마이 그 레이션하는 경우 수집된 배아 중 일부는 핵 분열주기 8-10 주위에 세 있도록 30 분 동안 유리병에 배아를 떠나으로 구성되어 있습니다 단일 단일층. 그것이 종종 조건이 누워 적합하지 다닐 때 여성의 신체에 유지되었다 노인 배아가 들어 있으므로 첫 번째 시간 컬렉션은 정상적으로 삭제됩니다.
4. Coverslips 및 슬라이드 준비
- 50 X 22mm의 coverslip를 꺼내서 약간 촉촉한 고급 펜 브러쉬와 현미경 슬라이드상에 올려놓을 사용하여 물을 아주 작은 양의 한쪽에 미치는 네 모퉁이에 오줌 그래서 그걸로 coverslip 때문에 모세관 표면 장력으로 이동하지 않는 얇은 액체 필름에 의해 발생.
- coverslip의 중간에 걸쳐 헵탄 접착제의 얇은 스트립을 적용, 헵탄는 coverslip에 접착제를 떠나 초 단위로 증발한다.
- 작은 사각형 (~ 1.5 mm 2)에 다이아몬드 펜으로 다른 coverslip을 잘라 하나를 픽업하고 접착제 스트립의 한쪽 끝을 (이것은 microinjection이 필요한 경우 바늘 끝을 여는 데 사용되는)에 배치하고 미래를위한 다른 저장 사용합니다.
- 다른 현미경 슬라이드를 타고 커버 용지 오프 약 2 cm 거기에 길고 껍질 양면 스티커 테이프 조각을 꽂다. (그림 2A & B를 참조).
5. Dechorionate 태아
- 신선한 식품 유리병에 파리를 전송하고 계란이 밖으로 확산 수 있도록하는 액체의 적절한 금액으로 슬라이드에 양면 스티커 테이프에 50 알을 전송 moistened 고급 펜 브러시를 사용합니다. 액체가 증발되면 계란은 테이프에 집중됩니다.
- 해부 현미경 터치에서 그들의 긴 축을 따라 달걀을 여러 번 chorion 때까지 조심스럽게 핀셋 한 쌍의 절반의 바깥 면을 사용하면 골절 및 개방형이지만 쵸에서 배아를 떠나급속한 탈수를 예방하기 이온각. 계란의 10-20이 (단일 실험에 필요한 난자의 수에 따라) 처리되었습니다 때까지이 과정을 계속합니다.
- 배아 그런 다음 포착하고 chorion 쉘에서 제거하고 부드럽게 하나에 의해 접착제 스트립 하나에 배치될 수 있습니다. 계란은 배치와 배아 병렬 또는 그들이 microinjected 수 있는지에 따라 달라집니다 접착제 스트립의 긴쪽으로 반 평행의 긴 측면에 중 정렬 수 있습니다.
- 배아는 어느 즉각적인 영상을 위해 추가로 탈수를 예방하기 Voltalef의 10 초 오일 적당량 (Holocarbon 700 오일 27 기름 5시 1분 혼합, 시그마)로 즉시 적용하거나 3~8분 동안 건조 챔버에 삽입하실 수 있습니다 추가로 룸과 실험의 목적 습도에 따라 그들을 탈수. microinjection이 필요할 경우 지나친 탈수를 방지하기 위해 적절한 탈수 배아는 10 초 기름으로 덮여 있어야합니다. (그림을 참조하십시오. 2C, D는& E).
6. 이미징 태아
- 살아있는 배아의 시간 경과 또는 단일 이미지는 HCX PL APO CS 40X 1.25 기름 침지 목표 (60 또는 100X 목표를 너무 높이면, 실험 목적에 따라 사용할 수있는 Leica TCS SP2를 거꾸로 공촛점 현미경 시스템을 사용하여 수집됩니다 배율이 발생합니다 표백 더 많은 사진)가 사용됩니다.
- 이미징 여러 스펙트럼을 중복했습니다 fluorophores, 그리고이 같은 배아에서 공동으로 표현하면, 각각의 형광 단백질 방출 파장은 순차적으로 수집되었다. Leica TCS SP2 시스템에서 사용할 수 여기와 방출 파장은 다음과 같습니다 GFP, λ 예 : 488 nm의 및 λ 엠 : 500-600 nm의. RFP, λ 예 : 543 nm의 및 λ 엠 : 555-700 nm의.
- 하나의 이미지는 일반적으로 두 프레임 스캔의 평균이 scanlines의 평균으로 얻은 것입니다. 이것은 512x512 P를 검색하는 데 6.3 초 최소 걸립니다연속 스캔 모드의 동시 스캔 모드, 15.44 초 및 ixel 이미지는 좋은 신호 대 잡음 비율을 생산하고 있습니다. 이러한 시간은 촬영된 이미지 수집을위한 시간 프레임을 설정할 때 고려해야합니다.
- 핀홀은 보통 1-2 AU (통풍 장치)로 설정되고, 레이저의 파워가 어떤 중요한 photobleaching을 피하기 위해 가능한 가장 낮은 레벨로 조정되었습니다.
7. 적절한 시약으로 배아를 Microinjecting하여 SAC를 유도할
- 실험 전에 바늘을 준비합니다. 매개 변수 : 더위가 = 600, = 90, 벨 = 70를 당기면 : 우리는 불타는 / 갈색 micropipette 풀러 (P-97 셔터의 악기, 모델)을 사용 siliconised 유리 모세관 (GC-100-10, 하버드)에서 바늘을 뽑아 것을 선호 , 델 = 150.
- 사출 버퍼에 시약의 적절한 농도에서 한두 ML이 훌륭한 로딩 팁을 (W215818J 20 μl Eppendorf 로트)를 사용하여 바늘을 Backfill.
- 바늘 호에 바늘을 마운트Eppendorf 분사 제어 시스템에 연결된 압력 파이프 현미경에 lder.
- 40X 목표하에 배아를 찾아 볼 분야의 중심에 바늘을 이동하고 점차 오른쪽 초점 비행기로 낮추는 방법으로 초점 평면을 변경하지 않고 바늘 그림자를 찾으십시오.
- 깨진 coverslip 접착제 스트립의 한쪽 끝을에 미리 마운트의 작은 사각형을 찾기 위해 부드럽게 멀리 배아를 이동합니다. 그것이 작은 정사각형 coverslip의 가장자리를 조회하고 부드럽게 열 분해까지 아주 부드럽게 바늘 끝 이동합니다.
- 보기로 다시 배아를 이동 및 사출에 적합한 연령의 배아를 선택합니다. 핵은 대뇌 피질에 바깥쪽을 마이 그 레이션하기 전에 이것이이기 때문에 나는 보통 5-7에서 핵 분열주기에서 배아를 주입. 핵 분열주기 단계는 GFP-Cdc20 사전 주입 9 RFP-히스톤 2B의 핵 신호의 형광 신호의 빠른 스캔에 의해 결정됩니다.
- 조심스럽게 엠브리으로 이동O 바늘 가까이하고 배아와 바늘 모두에 초점 비행기를 정리하다. 바늘로 배아를 이동하고 원하는 위치로 시약의 방울 주입하고 멀리 배아를 이동 (또는 microinjection 시스템에 대한 지침을 따르십시오.) 배아는 그 후부이나 실험의 목적에 따라 측면에서 주입 수 있습니다.
- 일단 난자는 적절한 시간에 몇 군데 준비하고 있습니다 주입. (그림 2F & G 참조)
8. 대표 결과
1 그림. 필수 재료 :. 미세 펜 브러시, 나. 작은 정사각형 깨진-안경 컨테이너, 다. 22 X 50mm coverslip, D. 현미경 슬라이드, 전자. 양면 스티커 테이프, 6. 뚜껑, G에 구멍이있는 시험관에 건조 효모 분말. 누룩과립은 플라이 유지 보수, H를 위해 사용됩니다. 식품 유리병, 나는 비행을. dechorionate 배아에 사용되는 족집게의 반, J. 페어 핀셋, K. 헵탄 접착제 액체 용기 (용적 플라스크).
그림 2. 다이어그램은 4 단계, 5 단계와 7 단계에서 microinjection을위한 바늘 준비의 배아 dechorionation의 coverslips와 슬라이드의 준비를 보여줍니다. . 상단 그림의 중간에 걸쳐 헵탄 접착제의 스트립 한 끝에 붙어 깨진 coverslip의 작은 사각형으로 coverslip을 보여줍니다. 아래 그림은 coverslip를 개최하기위한 네 모퉁이에서 물의 얇은 층을 가진 현미경 슬라이드를 보여줍니다. coverslip을 보유하는 슬라이드를 사용하는 이유는 슬라이드에 양면 테이프를 가지고 있으며 따라서 현미경을 환기 시켰을 뿐일세 피하는 때 찾은으로 대략 동일한 초점 거리를 유지하는 것입니다 당신이 AR 동안전자 해부 및 테이프와 coverslip 사이의 배아를 전송. B는. 양면 스카치 테이프의 짧은 길이 슬라이드 배아. C를 dechorionating 사용의 표지 종이를 벗겨내는 전에 적용됩니다. 왼쪽 그림은 표시된 앞부분과 후부로 끝납니다 그대로 chorion 쉘과 배아를 보여줍니다, 그들은 접착제 스트립과 함께 coverslip에 전송하기 전에 오른쪽 그림 깨진 chorion 쉘에있는 태아를 보여줍 D & E 다이어그램 두 보여주고 있습니다.. , 양도 배치 및 아교 스트립에 dechorionated 배아를 정렬을위한 방법. 배아는 적절한 건조 기간 후에 10 초 오일이 적용되었습니다. 이렇게 같은 삽입할 바늘와 위치의 일각을 여는 방법을 보여주는 F & G. 다이어그램 있습니다.
위에서 설명한 실험에서 얻은 단일 또는 촬영된 이미지는 직접 Leica 소프트웨어를 사용하여 분석하거나 열려있는 구경이 있습니다. TIF 파일에 저장할 수이것을 설명하기와 같은 이미지 J, 포토샵 및 MetaMorph 등 두 가지 예로 같은 다른 일반적인 이미지 분석 프로그램을 사용하여 더욱 부량 또는 편집 분석에 사용할 수 rmat은 아래에 설명되어 있습니다 :
예제 1 : 시간 경과 영화는 (그림 3) GFP-Cdc20와 Drosophila syncytial 배아 생활의 염색체 운동의 동적 kinetochore 모집을 보여줍니다. 원래 촬영된 시퀀스 이미지에서 관심 지역으로 결정 / 편집 및 자동 - 일괄 포토샵 소프트웨어를 사용하여 변환했습니다. 영화는 퀵타임 소프트웨어를 사용하여 조립되었다.
그림 3. 시간 경과 영화는 GFP-Cdc20와 Drosophila syncytial 배아 생활의 염색체 운동의 동적 kinetochore 모집을 보여줍니다. () 촬영된 이미지는 GFP-Cdc20를 (녹색)을 공동 표현 형질 syncytial 배아에서 찍은및 RFP-히스톤는 2B (빨간색)을 융합 단백질하며 ° C 핵 분열주기 중 7-8 18 Leica TCS SP2 공촛점 시스템을 사용하여 기록되었다. 프레임은 매 10 초 촬영되었다. 이미 prophase의 세포와 프레임은 제로 시점 10으로 처리됩니다. 그림 3A에 대한 동영상을 보려면 여기를 누르십시오 . (B) GFP-Cdc20는 쉽게 prophase 및 prometaphase kinetochores (B3, 4, 흰색 화살표)을 준수하고 있습니다 metaphase과 anaphase의 kinetochores (B5 & 6, 흰색 화살표)를 지속. GFP-Cdc20는 초기 prophase으로 핵을 입력 계면 핵 (화이트 화살촉)에서 제외됩니다. 염색질의 morphologies는 마커 (B8-14)로 공동 표현 His2BmRFP을 사용하여 결정됩니다. 바는 5mm =.
예제 2 : SAC 기능 microinjecting 항체, fluorescently 라벨이 단백질이나 chemica에 의해 배아를 조작하여 공부하실 수 있습니다잠재적 SAC를 실행하는 관심 리터 화합물. 예를 주입 콜히친 들어 microtubules을 depolymerize하기 위해 그림 4 10에 표시된대로 SAC 도발 때문에.
4 그림. Mad2은 콜히친-호출할 SAC 기능 10 필수적입니다. GFP-cdc20; mad2 + / +, GFP-cdc20; mad2 어이 (mad2 - / - null이 돌연변이)과 GFP-mad2; mad2 어이의 배아는 microinjection에 의한 콜히친로 치료되었다. 시간 경과 공촛점 이미지는 (; 08-12, 중, 패널, 14-18, 바닥 판넬 02-06, 상단 패널) 전 (01, 07 및 13) 또는 주사 후에 찍은. GFP-Cdc20 (상단과 가운데 패널) 또는 GFP-Mad2 (하단 패널) kinetochore 신호는 세포주기의 진행 마커로 사용되었다. 톱 패널, 화살표는 02-06에서 체포 kinetochores를 나타냅니다. 01에서 화살표로 표시된 영역은 콜히친 처리, GFP-C 전에 그 의미dc20은 후반 계면 핵에서 제외됩니다. 가운데 패널 앞에서, 내생 Mad2의 부재에서 GFP-Cdc20 신호는 핵에서 퇴원 진동을 계속하고, cytokinesis 결함이있을 것 같습니다 비록 kinetochores에 갔다가, 같은가 microtubules 부족 배아에 예상되어지는 콜히친의 (07-12에서 화살표로 표시) 콜히친 치료에 대한 응답으로 세포를 체포에 실패 SAC 기능을 제안. 딸 핵의 분리는 그림 10에 실패했습니다. 하단 패널, 14-18의 화살촉은 Mad2 돌연변이 배아의 구조의 SAC 결함 표현형을에 기능성 GFP-Mad2을 제안하기 위해 축적된 GFP-Mad2 융합 단백질로 체포 kinetochores를 나타냅니다. 13 화살촉은 늦은 계면 핵에 GFP-Mad2 축적을 나타냅니다. = 5mm를 바. 배아는 1 X PBS에서 100mg/ml 콜히친 주식 솔루션의 ~ 1 %의 계란 량과 microinjected되었다.
Discussion
여기에서 설명한 프로토콜은 영상은 Leica TCS SP2 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 syncytial 배아를 조종 및 기타 현미경 시스템에 맞게 수정할 수 있으며 Drosophila syncytial 배아를 사용하는 다른 유전자 기능을 연구하는 데 적용할 수 있습니다위한 일반적인 방법입니다. 우리는 스핀들 조립 검사점, 단백질 역학 및 생활 또는 고정 표본 4,6,12-14의 단백질 지방화를 시각화하는 유전자 변형 파리 또는 polyclonal 항체를 사용하여 단백질의 proteolysis의 여러 측면을 연구하기 위해이 프로토콜을 사용 하였다.
달걀 - 작은 숫자 (100 ~ 10)를 수집하면 신선한 플라이 음식 튜브 안에 파리를 유지하는 간단한 방법입니다. 이것은 만들기 및 기타 출판물 15,16에 설명된대로 추가적인 사과 쥬스 한천 플레이트 계란 수집 챔버를 준비의 번거로움을 줄여줍니다. coverslip에 접착제 스트립의 한쪽 끝을에서 깨진 유리 coverslip 작은 광장 이외는 훨씬 쉽게바늘을 열고 바늘이 10 초 기름에 immersing되는 동안 microinjection 시스템 설정을 조정하여 사출 볼륨을 결정합니다. 태아의 탈수의 정도는 leakages을 피하고 특히 장시간을 필요로하거나 주사 후 transformants을 높이는 경우 해당 실험에 대한 태아의 생존을 유지 분사의 성공을 위해 중요합니다. 그러나 탈수가 필요한 정확히 얼마를위한 황금률은 없습니다. 이 실험에서 실험으로 다르며 주입 솔루션 및 작업 환경의 습도의 양에 따라 달라집니다.
관심있는 특정 단백질의 기능은 모노 또는 폴리-clonal 항체 야생 형식이나 유전자 변이 배경 아래에서 특정 단백질, 메신저 RNA 또는 fluorescently 분류 펩티드에 대해 특정 단백질 억제제를 microinjecting으로 조작 할 수 있습니다. 이러한 돌연변이 선 또는 GFP-태그를 형질 전환 라인의 대부분은 공개 AV있다Drosophila 주식 센터와 대부분의 ailable은 Flybase (에 나열되어 있습니다 http://flybase.org/~~V ) 및 온라인으로 검색할 수 있습니다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 프로토콜은 Wellcome 신탁 기금하에 개발되었습니다. 우리는 플라이 주식을 유지하고 년간 플라이 음식을 준비를 위해 양 모린은 싱클레어 감사드립니다. 우리는 또한이 프로토콜의 개발에 그의 도움 및 기술 지원을위한 씨 마이클 Aitchison 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Essential equipment and reagents: |
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Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems. |
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Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens. |
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Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97). |
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Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used. |
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Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump. |
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Reagents: |
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| Maize meal | SUMA, UK | 100.0g | |
| Brown sugar | Billington’s, UK | 50.0g | |
| Dry yeast | DCL YEAST Ltd. UK | 25.0g | |
| Agar | Fisher Scientific | 106556 | 12.5g |
| Sorbic acid | BDH, VWR International Ltd. UK | 8829310 | 0.4g |
| Benzoic acid | Fisher Scientific | 1019599 | 2.9g |
| Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) | BDH, VWR International Ltd. UK | K35969015 | 0.9g |
| H2O up to 1L | |||
Table 1. Fly food ingredients. |
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Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma. |
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Dry yeast: Thomas Allison, UK. |
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Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope. |
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References
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