Summary
De paper beschrijft een vereenvoudigde techniek om accijnzen hoornvlies en het netvlies weefsels uithalen van de oculaire bol van de menselijke postmortale donoren. De techniek die hier beschreven zal helpen om accijnzen goede kwaliteit weefsels worden gebruikt voor transplantatie, chirurgisch of wetenschappelijke doeleinden zonder deze te beschadigen andere weefsels van het oculair wereld.
Abstract
Enucleatie is het proces van het ophalen van de oculaire hele wereld van een overleden donor en de rest van de wereld ongestoord. Excisie verwijst naar het ophalen van oculaire weefsels, in het bijzonder hoornvlies, door een vermindering van het los van het oculair wereld. Ingewanden is het verwijderen van de ingewanden hier aangeduid als retina. De oculaire wereld bestaat uit het hoornvlies, de sclera, het glasachtig lichaam, de lens, de iris, het netvlies, het vaatvlies, spieren enz. (Suppl. figuur 1). Wanneer een patiënt lijdt aan beschadiging van het hoornvlies, de cornea verwijderd moet worden en een gezonde men moet worden getransplanteerd door keratoplastische operaties. Genetische aandoeningen of gebreken in functie van de retina in gevaar kunnen brengen visie. Menselijke oculaire bollen kan worden gebruikt voor verschillende chirurgische procedures, zoals de ogen bankieren, transplantatie van menselijke cornea of sclera en onderzoek op het oculaire weefsels. Er is echter weinig informatie beschikbaar over het menselijk hoornvlies en het netvlies excisie, waarschijnlijk te wijten aan de limited toegankelijkheid van menselijke weefsels. De meeste studies beschrijven van soortgelijke procedures worden uitgevoerd op diermodellen. Onderzoek wetenschappers rekenen op de beschikbaarheid van goed ontleed en goed geconserveerde oculaire weefsels in om de kennis uit te breiden op de menselijke ogen ontwikkeling, homeostase en functie. Zoals we ontvangen hoog bedrag van oculaire bollen, waarvan ongeveer 40% (tabel 1) van hen worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden zijn wij in staat om grote hoeveelheid experimenten uit te voeren op deze weefsels, het definiëren van technieken om de accijnzen en regelmatig te bewaren hen.
Het hoornvlies is een avasculaire weefsel dat de transmissie van licht in staat stelt op het netvlies en voor dit doel moet altijd handhaven van een goede mate van transparantie. Binnen het hoornvlies, de limbus regio, die is een reservoir van de stamcellen, helpt de reconstructie van epitheliale cellen en beperkt de begroeiing van het bindvlies behoud van het hoornvlies transparantie en duidelijkheid. De grootte en e ickness van het hoornvlies zijn van cruciaal belang voor de duidelijke visie, zoals veranderingen in een van beide zou kunnen leiden tot afgeleid, onduidelijke visie. Het hoornvlies bestaat uit 5 lagen; a) epitheel, b) Bowman's laag, c) stroma, d), Descemet membraan en e), endotheel. Alle lagen moeten goed functioneren om te zorgen voor duidelijke visie 4,5,6. Het vaatvlies is de intermediair tuniek tussen de sclera en de retina, begrensd aan de binnenkant van de membraan van Bruch en is verantwoordelijk voor de bloedstroom in het oog. De choroid helpt om de temperatuur en levert voeding regelen op de buitenste lagen van het netvlies 5,6. Het netvlies is een laag van zenuwweefsel dat de achterkant van het oculair wereld (Suppl. figuur 1) omvat en bestaat uit twee delen: een photoreceptive deel en een niet-ontvankelijke deel. Het netvlies zorgt voor het ontvangen van het licht van het hoornvlies en de lens en zet het om in de chemische energie uiteindelijk doorgegeven aan de hersenen met behulp van de optische zenuw 5,6.
ove_content "> Het doel van dit artikel is om een protocol voor het ontleden van het hoornvlies en het netvlies weefsels van menselijke oculaire bollen. Het vermijden van kruisbesmetting met aangrenzende weefsels en het behoud van RNA integriteit is van fundamenteel belang als dergelijke weefsels onmisbaar zijn voor gericht onderzoeksdoeleinden op (i) het karakteriseren van het transcriptoom van de oculaire weefsels, (ii) het isoleren van stamcellen voor regeneratieve geneeskunde projecten, en (iii) de evaluatie van histologische verschillen tussen de weefsels van de normale / getroffen personen. In dit artikel beschrijven we de techniek die we nu gebruiken voor het verwijderen het hoornvlies, het vaatvlies en het netvlies weefsels van een oculaire hele wereld. Hier bieden wij u een gedetailleerd protocol voor de ontleding van het menselijk oculaire hele wereld en de excisie van het hoornvlies en het netvlies weefsels. De bijbehorende video zal onderzoekers helpen om een geschikte techniek voor het ophalen te leren kostbare weefsels die moeilijk regelmatig vinden.Protocol
1. In situ Excisie van het hoornvlies van Ocular Globes
- Schakel de laminaire flow-kast 15 minuten vóór gebruik. Maak de laminaire stroming kap met behulp van 70% isopropylalcohol. Zet op persoonlijke beschermende kleding, zoals chirurgische pet en masker. Scrub handen en onderarmen en afdrogen met een steriele doek. Draag steriele handschoenen en een schort of bussen met een aseptische techniek.
- Stel de steriele veld door het plaatsen van een steriel instrument lade aseptisch. Controleer of de instrumenten steriel zijn. Open de steriele instrumenten verpakking en klap op het steriele veld het vermijden van elke vorm van verontreiniging.
- Plaats alle steriele materialen en instrumenten (tabel 2) met flessen (oog potten) met het oog bollen zodat ze naast de rand van de steriele veld gebruiksgemak.
- Label de flessen met vooraf bereide behoud / opslagmedium, zoals aangegeven in tabel 3 en plaats dem op het oppervlak van de laminaire stroming kap met I-PVP (jodium-polyvinylpyrrolidon), natriumthiosulfaat en een steriele zoutoplossing PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing).
- Laat de oculaire weefsels en oplossingen voor normale kamertemperatuur te bereiken als ze worden bewaard in een koelkast bij 4 ° C. Vermijd herhaaldelijk verwarming / koeling cycli. Houd de deksels van de oplossing en het oog potten met binnenzijde naar boven naast hun potten.
- Verwijder de gaasjes en sponzen uit het oog pot met behulp van een steriel pincet. Dompel de hele wereld in steriele I-PVP 0,5% voor 2 minuten naar het oculair bollen te ontsmetten. Plaats de twee tang op het deksel van de steriele bak, buiten het steriele veld. Breng de hele wereld in natriumthiosulfaat 0,1% voor 1 minuut met een andere paar steriel pincet. Met dezelfde tang, overdracht van de wereld naar de fles met steriele zoutoplossing (PBS) en laat deze tot aan het in gebruik. Herhaal dezelfde procedure voor de andere oculaire wereld van thij dezelfde donor.
- Werken onder de laminaire luchtstroom kap, wikkel de hele wereld met behulp van een steriel gaasje (verbanden) het verlaten van het hoornvlies en ongeveer 5 mm sclera van onbedekt het hoornvlies. Het oog lamp kan eenvoudig worden gehouden in de hand het handhaven van de voldoende druk. Het weefsel moet vochtig gedurende de gehele operatie.
- Pincetten worden gebruikt samen met een schaar om alle eventuele resten van het bindvlies te verwijderen. Houd de instrumenten die worden gebruikt voor de bovenstaande bewerking gescheiden van andere instrumenten. Gebruik een scalpel een incisie sclerale van 3-4 mm van de limbus regio uit te voeren, dan is uitbreiding van de incisie van 360 °, het vermijden van de onderliggende druifvlies weefsel doorboren en veroorzaak geen vervorming van het hoornvlies van de normale kromming. Snijd vier grote incisies het verlaten van vier kleine gaten het vermijden van de afscheiding van het glasachtig lichaam. Alle vier de gaten worden gesneden zodat er geen ontslagrecht van een andere weefsel.
- Aanwezigheid van kleine sclerale plaques kan het snijden de weg staan, dus zorg dat compLete de sclerale excisie met microchirurgie schaar. Deze operatie moet worden uitgevoerd zonder beschadiging van het vaatvlies, netvlies en glasachtig lichaam.
- Inspecteer de incisie om te zorgen dat compleet is. Als de incisie is uitgevoerd juist de corneo-sclerale rand houdt zich aan de ciliaire lichaam alleen op het punt in correspondentie met het hoornvlies.
- Zet de verpakte oculaire hele wereld naar beneden nabij het centrum van het steriele veld. Vul het hoornvlies verwijderen met behulp van een tang om de sclerale rand stationaire en de hand wordt gebruikt voor excisie om het corpus ciliare-choroidea te trekken naar beneden en weg van de corneo-sclerale knop vast te houden.
- Voorzichtig scheiden resterende vergroeiingen van de corneo-sclerale knop. Noch trek de corneo-sclerale rand op een manier die cross-hoornvlies spanning zou kunnen veroorzaken, noch laat het naar beneden vallen terug op de voorste kamer.
- De endotheelcel dichtheid van het hoornvlies wordt gecontroleerd met behulp van een hypotone oplossing en de cel sterfte wordt gecontroleerd met behulp van een Trypeen blauw kleuring ongeveer 1 min en de cellen worden geteld onder een optische microscoop en gemeten cellen / mm2. De voorkamer moet naar het deksel, terwijl de achterste moet de onderzijde van de Petri plaat te gaan. De endotheelcel dichtheid kan handmatig worden geteld met behulp van een raster in de doelstelling van 100X vergroting. De minimale geaccepteerd cellen voor transplantatie in Italië is 2200 endotheliale cellen / mm 2.
- Breng de corneo-scleral rand met een corneale klauw eerder bereide cornea opslagmedium bewaard bij kamertemperatuur (kamertemperatuur) zoals weergegeven in tabel 3.
- Onderzoek de achterste kamer voor een natuurlijke ooglens. Als de sclera bereid is, verwijdert u alle resten van uvea en glasvocht uit de hele wereld. Voorzichtig uitpakken en terug te keren de overige achterste segment om het betreffende oog pot, met gebruikmaking van aseptische techniek. Herhaal de procedure voor de andere wereld met behulp van nieuwe instrumenten. Bevestig het hoornvlies with hoornvlies klauw en het behoud van onder de opslagmedia (orgel cultuur) bij 31 ° C. De uitgesneden cornea, zie figuur 1a, kunnen vervolgens worden gebruikt voor keratoplastie of onderzoek.
- Gooi de onnodige materialen en bio-gevaarlijk afval in de juiste afvalbakken. Maak de werkplek na het werk is voltooid met 70% isopropylalcohol spray.
- Indien na 28 dagen het hoornvlies behoudt alle de evaluatie parameters [zoals morfologie, het aantal cellen, transparantie, dikte en microbiologische testen - met behulp van bacteriën en schimmels Bactec 9240 instrument (Becton Dickinson, Milaan, Italië)], kan het vervolgens worden vervoerd naar ziekenhuizen met het transportmedium in tabel 4. Het hoornvlies moet worden verwijderd en geplaatst van de opslag tot middelgrote transport onder laminaire flow-kast.
- Als, tijdens de opslag, het hoornvlies dikker is dan de gebruikelijke maat die nodig is voor transplantatie, oog banken gebruik maken van de-zwelling agenten om de dikte te verminderen. Wijgebruik maken van 6% dextran T500 aan het hoornvlies terug te keren naar de normale grootte in transportmedium. Hoewel 4-8% dextran T500 kunnen worden gebruikt, heeft 6% best gediend voor ons. Dit maakt het makkelijker voor de chirurgen aan het hoornvlies transplantatie zodra ze ontvangen.
2. Verwijderen van de ingewanden van Retina van de oculaire bol na wegsnijden van de Cornea
- Na excisie wordt het hoornvlies geselecteerd voor transplantatie of onderzoek op de morfologie en endotheelcellen dichtheid en is geplaatst in de opslag of bewaring medium bij 31 ° C. De rest van de oculaire hele wereld wordt vervolgens verwerkt voor verder gebruik, zoals sclera isolatie voor chirurgische doeleinden, retina voor onderzoek, enz.
- Voorafgaand aan het netvlies excisie, zorg ervoor dat het oculair wereld is geraakt en dat alleen het hoornvlies met een deel van de sclera wordt verwijderd. Als de gelatineuze glasachtig lichaam is afscheidende uit wordt het moeilijk om verwijderen van een retinale weefsel.
- Als de donor is dan 65 jaar, de sclera isbewaard onder steriele PBS voor chirurgische doeleinden na serologisch onderzoek. In dit geval wordt de sclera gesneden, alleen het glasachtig lichaam wordt verwijderd en de gehele sclera behouden.
- Voor het netvlies excisie, beginnen met een klein gesneden of incisie van het hoornvlies kant van de sclera de richting van de oogzenuw met steriele pincet en een schaar. Houd het gedeelte van de sclera behulp van een tang en knip met de schaar recht naar de oogzenuw snijden deel voor deel het vermijden van schade aan het glasachtig lichaam.
- Choroïdale plaques moet worden gescheiden van de sclera als ze aan elkaar plakken. Snijd de hele sclera om de vaatvlies weefsel bloot te leggen. Als de sclera is volledig afgesloten, scheid de sclera met de rest van het glasachtig lichaam door te knippen in de buurt van de oogzenuw. Een volledige bol glasachtig lichaam bedekt met choroid wordt weergegeven als in figuur 2a.
- Met behulp van twee steriele pincet verwijder voorzichtig het vaatvlies laag voor picking it up met eentang en verwijderen van de andere. Alternatief kan de choroïde laag worden verwijderd met schaar maar zoveel mogelijk te vermijden aangezien kan beschadiging van de retina. Gedeeltelijk Verwijder het vaatvlies laag en snijd het om het verwijderen te vergemakkelijken.
- Nadat de choroid laag wordt verwijderd, een doorzichtige laag retina duidelijk zien zoals in figuur 2b. De choroid laag heeft een inwendige Bruch membraan die ook kan worden verwijderd, maar het is moeilijk te identificeren met het blote oog.
- Ook gebruik twee tang het netvlies laag te verwijderen, zoals in figuur 2c. Het is gemakkelijk te isoleren grote hoeveelheid van het netvlies, indien weggesneden in de buurt van de oogzenuw. Alle lagen van het oog kan nu als in figuur 2d.
- Zodra de retinale weefsel is verwijderd, kan het worden gebruikt voor verschillende doeleinden en derhalve de volgende stappen en voorwaarden voor conservering kan dienovereenkomstig verschillen. Zode retinale weefsel kan worden geplaatst in tubes met RNA stabilisatie reagentia (zoals RNAlater) of lysis buffer (voor RNA of DNA extractie) Dispase / trypsine (voor isolatie van cellen), vastzetten (voor weefsels paraffine of oktober insluiten immunohistochemie).
- Verwijder alle werkgebied en reinig het gebied met 70% isopropylalcohol spray.
3. Representatieve resultaten
De corneo-sclerale rand zoals te zien in figuur 1a is een goed weggesneden hoornvlies met de vereiste hoeveelheid sclerale velg en endotheel morfologie, deze vorm van het hoornvlies wordt meestal gebruikt voor het binnendringen van keratoplastie. Indien de voorste stroma van de uitgesneden hoornvlies wordt beschadigd door de aanwezigheid van opaciteit kan het hoornvlies worden gebruikt voor endothelial keratoplasty / posterieure lamellaire keratoplastiek (endothelium met een deel van stroma). Overwegende dat, indien de endotheliale laag beschadigd is of als de endotheelcellen dichtheid <2200 cellen / mm 2 (HetAljan standaard), kan het hoornvlies worden gebruikt voor anterieure lamellaire hoornvliestransplantatie (epitheel met een deel van de anterior stroma). Indien de endotheliale cellen kleiner is dan de gewenste, kan het hoornvlies worden gebruikt voor anterieure lamellaire keratoplastiek of onderzoek dat, indien het hoornvlies volledig beschadigd, kan het worden gebruikt voor onderzoek zoals in figuur 1b, 3b en 3c of weggegooid. De schade kan een oorzaak zijn van verkeerd gebruik van het weefsel, voorafgaand cataract operaties die leiden tot stroma of Descemet endotheliale littekens, de ontwikkeling van lichamelijk letsel tijdens het leven van de patiënt enz. Daarom wordt het noodzakelijk om alle weefsels contact op met spleetlamp en dan onder een optische microscoop voor fijne littekens / plooien / detachementen. Het hoornvlies is meestal bewaard onder twee verschillende omstandigheden, zoals orgelcultuur (ongeveer 31 ° C) gewoonlijk in Europa of hypothermie (ongeveer 4 ° C) gewoonlijk in de USA. We maken gebruik van orgelcultuur als het helpt om te regenereren de damleeftijd epitheliale cellen, opnieuw te vitaliseren van endotheelcellen controle met een hoge post mortem tijd, een opslag periode van 4 weken die voldoende venster geeft voor het plannen van een operatie, geeft voldoende tijd voor microbiologische (bacteriën en schimmels) en serologisch onderzoek, etc. Het hoornvlies kan goed worden bewaard in het transportmedium voor 7 dagen.
De sclera kunnen worden verlaagd deel voor deel zorgen voor zachte verwijdering van alle choroïdale plaques. Het glasvocht vloeistof kan uitscheiden als de oogzenuw, choroidea of netvlies wordt scherp gesneden zoals weergegeven in figuur 4. Netvlies als uitgesneden voor RNA-analyse moet worden bewaard in RNAlater zodra de weefsels worden weggesneden. Gewoonlijk 1x1 cm van de choroïde en retinale laag uitgesneden en na hem in RNAlater gedurende 24 uur bij 4 ° C bewaard onder -80 ° C in vers Eppendorf buizen (veilige vergrendeling buizen, 2 ml) tot het gebruik of geleverd met droge ijs. De retinale weefsel moet worden weggesneden met behulp van twee tangen in de buurt van de oogzenuw uit de buurt van irisof ciliaire marge om besmetting met andere gepigmenteerde structuren te vermijden en moet worden overgedragen aan het behoud van container onmiddellijk als RNA wordt onstabiel bij het ophalen van het netvlies.
Figuur 1 Vergelijking tussen een goede en een slechte kwaliteit hoornvlies:. A) Een goed weggesneden hoornvlies. Zo'n hoornvlies wordt meestal bewaard onder orgelcultuur gedurende 4 weken. Microbiologische (met behulp van Bactec 9240 instrument) en morfologische (kleuren van de cellen met trypanblauw voor cel-sterfte bepaling en het observeren van cellen onder een optische microscoop met 100X vergroting) onderzoek wordt uitgevoerd voorafgaand aan het transport naar het ziekenhuis (figuur 3a), b) een gebogen hoornvlies Dit leidt uiteindelijk tot afstoting van het transplantaat als gevolg van hoge Descemet plooien en de hoge endotheliale beschadiging van cellen onderzocht met een spleetlamp microscoop. Zo'n hoornvlies wordt meestal gebruikt voor research of wordt weggegooid.
Figuur 2. Methode gebruikt voor een accurate excisie van de retinale weefsel te garanderen. A) Ontrafeling van de sclera van het oculair hele wereld met behulp van 24 mm zaagblad met 95 mm gebogen of stompe einde steriele schaar en 100 mm 11x2 geregeerd door 0,70 mm tanden steriel pincet. De sclera moet worden gesneden door houden de ene kant met de tang te knippen rechtdoor naar de optische zenuw met behulp van de schaar. De choroidea laag zal nu gemakkelijk te zien, b) gebruik van twee 100 mm 11x2 geregeerd door 0,70 mm tanden steriel pincet, choroidea wordt verwijderd door het uit elkaar scheuren, die onthult de onderliggende transparante retinale laag; c) Transparante retinale laag is zeer zorgvuldig in de buurt van gezuiverde de oogzenuw, zonder de uitscheiding van glasvocht vloeistof met dezelfde tang. Zowel de tang moet in het bezit elke kant van het netvlies en het weefsel moet voorzichtig worden verwijderd Starting de buurt van de oogzenuw richting van het hoornvlies, om een goede hoeveelheid van retinale weefsel te verkrijgen. Het weefsel kan worden gesneden in verschillende maten en worden gebruikt voor analyse experimenten; d) Er zijn verschillende lagen van het oog door het hoornvlies verwijderd kunnen worden bekeken in deze figuur. De choroid lichaam verwijderen en vervolgens retina zonder de andere delen van het oog.
Figuur 3. Vergelijking van de verschillende celdichtheid morfologie bekeken onder vergroting 100X een optische microscoop. A) goede endotheelcel dichtheid (> 2200 cellen / mm 2) en morfologie (minder polymorfisme lage degeneratie geen spierdystrofie en 0% sterfte) in een hoornvlies die geschikt is voor transplantatie, b) Matig endotheelcel dichtheid (ongeveer 1200-1400 cellen / mm 2) en morfologie (hoge polymorfisme en Degenwerking van de cellen), samen met ongeveer 30-40% totale sterfte in acht worden genomen na trypanblauw kleuring, c) Een deel van endotheelcellen beschadigd zijn als gevolg van detachering van een endotheel-sheet bij het ophalen van het hoornvlies van oculaire wereld. Dit wordt bevestigd door de mortaliteit van de cellen in het gebied van trypan blauw gekleurde, d) van Descemet plooien worden gevormd door verkeerd hoornvlies door buigen, waardoor kruis cornea spanning met de instrumenten intens etc bij de uitsnijding. De figuur toont de dikke ontwikkelde iatrogene plooien gevonden tussen de periferie en optische zone van het hoornvlies.
Figuur 4. Schade aan het vaatvlies en het netvlies weefsels, terwijl wegsnijden van het hoornvlies uiteindelijk leidt tot de uitscheiding van glasvocht vloeistof. Het netvlies wordt betrokken bij het glasachtig lichaam waardoor het moeilijk is accijns een goede kwaliteit tissue without verontreiniging.
Tabel 1. Samenvatting van de verschillende activiteiten uitgevoerd met behulp van menselijke oculaire globes in 2009 en 2010 op Fondazione Banca Degli Occhi (Venezia, Italië). Ongeveer 60% van de weefsels werden gebruikt voor transplantatie, waardoor een groot aantal oculaire bollen (ongeveer 40%) voor wetenschappelijk en medisch onderzoek.
Aanvullende Figuur 1. Anatomie van het menselijk oog 5. Verschillende delen van het menselijk oog is in deze figuur aangegeven, gebruikt om de exacte positie van het weefsel te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zowel de juiste excisie en een goede bewaring van het hoornvlies en het netvlies weefsels zijn van cruciaal belang als kleine gebreken, zoals endotheliale schade of hoog aantal van Descemet plooien kan leiden tot transplantaatfalen van het hoornvlies terwijl de temperatuur wijzigingen of verkeerd gebruik kan de integriteit van het netvlies weefsels in gevaar brengen. Het doel van dit artikel is te laten zien hoe het hoornvlies en het netvlies weefsels optimaal worden geïsoleerd, zonder het induceren van schade of wijzigingen dat het gebruik ervan in gevaar kunnen brengen voor transplantatie of onderzoeksdoeleinden. De vereiste minimale cel dichtheid (> 2200 cellen / mm 2), goede morfologie zoals mobiele grootte, structuur, lage degeneratie van intercellulaire grenzen en de afwezigheid van dystrofie samen met een goede transparantie en de juiste dikte van het hoornvlies zijn de kenmerken waardoor een weefsel geschikt is voor transplantatie. Indien de scalpel wordt ongeveer gebruikt of instrumenten intensief gebruikt, is het niet alleen het hoornvlies beschadigen, maar het glasachtig lichaam dat is Furthaar excisie van andere weefsels moeilijker (figuur 4). Retina is een transparante weefsel en dus moeilijk te identificeren wanneer het glasvocht vloeistof wordt vrijgegeven met het, normaal gesproken dit excisie van de retinale weefsel ingewikkelder maakt. Als weggesneden met een glasachtig lichaam, zal de kwaliteit van de retinale weefsel of geëxtraheerde RNA zeer slecht als gevolg van besmetting met andere oculaire onderdelen. Zo is een geschikte techniek om accijnzen een hoornvlies of netvlies is erg belangrijk om op te halen een superieure kwaliteit weefsel.
Onze vorige gegevens van de laatste twee jaar (tabel 1) geven aan dat ongeveer 60% van het hoornvlies die we verzamelen uit het oog van bollen zijn geschikt voor verschillende soorten transplantatie. Dit is een verder bewijs dat de cornea-excisie techniek beschreven in dit artikel is een goede methode voor het verzamelen van hoogwaardige weefsels van het hoornvlies oculaire bollen. De hoornvlies kan uiteraard niet geschikt voor transplantatie door andere parameters such als stromale afwijkingen, verontreiniging, endotheliale dichtheid / morfologie, geschiktheid van de donor en mechanische / fysische trauma veroorzaakt met behoud van het hoornvlies. Indien de bovengenoemde parameters zijn goed de techniek we hier beschreven kan ophalen van goede kwaliteit weefsels worden gebruikt voor transplantatie patiënten met oogoppervlak ziekten.
Terwijl informatie over verwijderen van de ingewanden van retinale weefsel uit dierlijke modellen is op grote schaal beschikbaar 11,12, bij ons weten is dit de eerste keer dat een dergelijke techniek wordt beschreven voor isolatie van het netvlies weefsels van het menselijk oog bollen. Sterker nog, onderzoek naar de literatuur, leverde geen resultaat op papier de bespreking van dit onderwerp. Wij geloven dat als humaan oculair wereld dissectie wordt uitgevoerd zoals beschreven, onderzoekers in staat zou zijn om weefsels van goede kwaliteit moeten worden gebruikt voor hun onderzoeksprojecten. Veel oog banken over de hele wereld waarschijnlijk in oog te bollen (maar ook hoornvliezen) die niet is ontvangeneschikt voor transplantatie. In ons geval, kan bijna 40% van de cornea (en ogen bollen) die we verzamelen en verwerken niet worden getransplanteerd (als gevolg van een breed scala aan oorzaken), maar kan nog steeds worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden. De techniek wordt beschreven in dit artikel toch mogelijk om de collectie van hoge kwaliteit weefsels. Dit werd onlangs aangetoond door onze groep als analyse RNA met T <24 uur uit het netvlies weefsels die geoogst volgens de techniek beschreven in dit document 10. Wij geloven dat het dezelfde techniek kan worden gebruikt om de retinale weefsel voor vele andere verschillende doeleinden, zoals (i) voor het netvlies transcriptoom studies, (ii) te bestuderen en bevorderen het gebruik van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen in personalized medicine 8 isoleren, (iii ) om RNA expressie atlas van retinitis pigmentosa genen in het menselijk netvlies 9, (iv) te ontwikkelen om de RNA-extractie methode, (v) te optimaliseren stamcellen studies om retinale weefsel te regenereren, enz.
Deze techniek wziek nuttig zijn voor degenen die willen die wegsnijden of experimenten uit te voeren, maar hebben beperkte informatie over de methode om menselijk hoornvlies of het netvlies te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Regione Veneto (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 en Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). De auteurs danken dr. C. Griffoni voor de 2009/2010 beknopte gegevens over het gebruik van menselijke oculaire bollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for excision of cornea and retina. | |||
| Guarded disposable scalpel | Blade size 15 | Swann-Morton | |
| Sterile bandages | 5 cm X 5 cm, 8 layered, 5 pcs | Artsana | |
| Sterile disposable medical towel | 35 X 50 cm | U.Jet | |
| Sterile scissors | Blades 24 mm / overall length. 95 mm curved, blunt | e.janach | |
| Sterile forceps | Stainless steel -100 mm 11 X 2 ruled by 0.70 mm teeth | e.janach | |
| Corneal claw – Disposable medical device | NIIOS (Hippocratech) | ||
| PBS | 100 ml PBS [10x] in 900 ml d/w (distilled water) | Sigma-Aldrich | |
| Na-thiosulphate | 1 gm Na-thiosulphate in 1 litre of PBS [1x] | Sigma-Aldrich | |
| I-PVP | 5 gm I-PVP in 1 litre d/w | Sigma-Aldrich | |
| Table 2. The table describes the materials used for excision of cornea and retina and the company they are received from. | |||
| Materials for storage medium (2000 ml). | |||
| MEM (1X) liquid | Invitrogen | 32360-034 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | 1mM (10ml/l) |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | 2mM (10ml/l) |
| Antibiotic/antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955-20ML | 10ml/l |
| Newborn calf serum | Invitrogen | 26010-74 | 2% (20 ml/l) |
| Table 3. Materials for storage medium. | |||
| Preparation of storage medium | |||
| Add all the ingredients using the specific concentrations as given above in a jar and mix well. Filter them using pore size of 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) with help of a peristaltic pump. Preserve the medium in the bottles at RT. | |||
| Materials for transport medium (2000 ml). | |||
| MEM (1X) liquid | Invitrogen | 32360-034 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | 1mM (10 ml/l) |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | 2mM (10 ml/l) |
| Newborn calf serum | Invitrogen | 26010-74 | 2% (20 ml/l) |
| Dextran t500 | Pharmacosmos | 551005004007 | 6% (60 gm/litre) |
| Table 4. Material for transport medium. | |||
| Preparation of transport medium | |||
| Add Dextran 6% in ~ 1.5 litre of MEM and leave it overnight. Add the rest of ingredients in the media and filter using 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) using a vacuum pump. Preserve the medium in the bottles at RT. | |||
References
- Fay, A. Diseases of the visual system. Cecil Medicine. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).
- Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. Patents in Limbal Stem Cell Biology. Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).
- Pharm, U. S. The Eye: The physiology of human perception. Britannica educational publishing. 36, 19-27 (2011).
- Lang, G. Ophthalmology: A pocket textbook atlas. , 2nd Edition, 115-117 Forthcoming.
- Liesbeth, P. els Organ Culture: The method of choice for preservation of human donor corneas. Br. J. Ophthalmol. 81, 523-525 (1997).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., Wallace, K. A., Verhoeven, A. D., Wright, L. S., Capowski, E. E., Pinilla, I., Martin, J. M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J., Gamm, D. M. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. , (2011).
- Trifunovic, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2330-2336 (2008).
- Mora, P., Montanini, L., Ferrari, S. Retina. 30, 1555 (2010).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (48), e2563 (2011).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses. J. Vis. Exp. (50), e2795 (2011).
