Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

טכניקה פשוטה עבור Published: June 12, 2012 doi: 10.3791/3765

Summary

העיתון מתאר שיטה פשוטה כדי הקרנית בלו וכדי להוציא את העקר רקמות רשתית העין מן העולם של תורמים גווייה אדם. הטכניקה המתוארת כאן יעזור ובלו רקמות באיכות טובה כדי לשמש להשתלה, למטרות מחקר או ניתוח מבלי לפגוע ברקמות אחרות של הגלובוס העין.

Protocol

1. כריתת באתרו של הקרנית מן גלובס העינים

  1. הפעל את ארון האוויר זרימה למינרית כ 15 דקות לפני השימוש. לנקות את מכסה המנוע באמצעות זרימה למינרית איזופרופיל אלכוהול 70%. ללבוש ביגוד מגן אישי, כגון שווי המסכה כירורגית. לשפשף את הידיים והאמות ומייבשים בעזרת מגבת סטרילית. ללבוש כפפות סטריליות ועל שמלת שרוולים או באמצעות טכניקה מזוהם.
  2. הגדר את השדה הסטרילי על ידי הצבת מכשיר מגש סטרילי בסביבה נקייה מחיידקים. לוודא כי המכשירים הם סטריליים. פתח את חבילת כלי סטרילי להפוך למגרש סטרילי להימנע מכל זיהום.
  3. מקם את כל החומרים והכלים סטריליים (טבלה 2) יחד עם בקבוקים צנצנות (עיניים) המכילים גלובס עיניים, כך שהם הסמוכים קצה השדה הסטרילי עבור קלות שימוש.
  4. תוויות הבקבוקים עם שימור שהוכן קודם לכן / בינוני אחסון כמצוין בטבלה 3 ואת המקוםמ 'על פני השטח של מכסה המנוע באוויר זרימה למינרית יחד עם I-PVP (יוד polyvinylpyrrolidone), thiosulphate נתרן תמיסת מלח סטרילית PBS (פוספט מלוחים למאגר).
  5. אפשר הרקמות עינית ופתרונות להגיע לטמפרטורת החדר הרגיל כפי שהם נשמרים במקררים ב 4 ° C. למנוע הופעה חוזרת של ההתחממות / קירור מחזורים. לשמור את המכסים של פתרון ואת צנצנות עין עם הצד הפנימי כלפי מעלה ליד צנצנות של כל אחד מהם.
  6. הסר gauzes וספוגים מצנצנת את העין באמצעות מלקחיים סטריליות. לטבול את כדור הארץ ב 0.5% סטרילי I-PVP 2 דקות כדי לטהר את גלובס עיניים. מניחים את שני מלקחיים על מכסה מגש סטרילי, מחוץ לשדה סטרילית. מעבירים את כדור הארץ thiosulphate% 0.1 סודיום דקה 1 באמצעות זוג נוסף של מלקחיים סטריליות. באמצעות מלקחיים אותם, להעביר את כדור הארץ כדי בקבוק המכיל תמיסת מלח סטרילית (PBS) ולהשאיר אותה עד שזה מופעל. חזור על אותו תהליך של העולם עיניים והשני לאהוא תורם אותו.
  7. עבודה מתחת למכסה המנוע אוויר למינרית זרימה, עוטפים את כדור הארץ בעזרת גזה סטרילית (תחבושות) עוזב את הקרנית וכ 5 בלובן העין מ"מ מהקרנית חשף. הנורה העין יכול להתקיים רק ביד שמירה על לחץ מספיק. רקמת צריך להישמר לחה במהלך הניתוח כולו.
  8. מלקחיים המשמשים יחד עם מספריים כדי להסיר את כל שרידי הסופי של הלחמית. לשמור את המכשירים המשמשים לניתוח מעל נפרד ממכשירים אחרים. השתמש בלהב סכין המנתחים לבצע חתך scleral של 3-4 מ"מ מאזור לימבוס, ואז להרחיב את החתך של ° 360, הימנעות לחדור אל הרקמה uveal הבסיסית או לגרום לכל עיוות של עקמומיות הרגיל של הקרנית. חותכים ארבעה חתכים גדולים עוזבים ארבעה פערים קטנים הימנעות הפרשת הגוף הזגוגי. כל ארבעת הפערים נחתכים להבטיח שום הסרה של רקמה אחרת.
  9. נוכחות של פלאק scleral קטנים עשויים לעכב את החיתוך, כדי לוודא complete כריתה scleral במספריים microsurgery. פעולה זו יש לבצע מבלי לפגוע בגוף, דמית העין הרשתית הזגוגית.
  10. בדוק את החתך, כדי להבטיח שהיא תושלם. אם החתך שבוצעה כהלכה corneo-scleral שומרת השפה אל הגופים ריסי רק בשלב בתכתובת עם הקרנית.
  11. הגדר את העולם עיניים עטופה ליד מרכז שדה סטרילי. להשלים את הסרת הקרנית באמצעות מלקחיים להחזיק את שפת scleral נייח יד המשמש כריתה למשוך את ריסי הגוף דמית העין כלפי מטה, הרחק כפתור corneo-scleral.
  12. להפריד בעדינות את כל הידבקויות הנותרים מלחצן corneo-scleral. לא למשוך את שפת corneo-scleral בצורה שעלולה לגרום בין הקרנית המתח ולא לאפשר לו לרדת חזרה למטה, אל החדר הקדמי.
  13. צפיפות תא האנדותל של הקרנית נבדק באמצעות פתרון hypotonic ואת התמותה התא נבדק באמצעות Trypכתמים כחולים דקות סביב 1 והתאים נספרים מכן תחת מיקרוסקופ אופטי כפי שהיא נמדדת על תאים / מ"מ 2. החדר הקדמי צריך להתמודד עם המכסה האחורי תוך צריך להתמודד עם החלק התחתון של צלחת פטרי. צפיפות תא האנדותל אפשר לסמוך באופן ידני באמצעות רשת ב המטרה בהגדלה 100x. מספר מינימלי התא קיבל להשתלה באיטליה הוא 2200 לתאי אנדותל / 2 מ"מ.
  14. מעבירים את שפת corneo-scleral באמצעות טופר הקרנית עד בינוני מוכן בעבר אחסון הקרנית נשמר ב RT (בטמפרטורת החדר) כפי שניתן לראות בלוח 3.
  15. בדוק את החדר האחורי של העדשה גבישי טבעי. אם בלובן העין מוכן, להסיר את כל שאריות של ענביה והומור הזגוגית מן העולם. לגולל בזהירות ולחזור קטע האחורי שנותר כדי צנצנת העין שלו בהתאמה, תוך שימוש בטכניקה האספטי. לחזור על התהליך עבור העולם השנייה באמצעות מכשירים חדשים. תקן שנינות הקרניתH טופר הקרנית ולשמר תחת אמצעי אחסון (תרבות איבר) בשעה 31 ° C. הקרנית נכרת, כפי שמוצג באיור 1 א ', לאחר מכן ניתן להשתמש עבור keratoplasty או מחקר.
  16. השליכו חומרים מיותרים ביו מסוכנים פסולת לתוך פחי אשפה המתאימים. לנקות את שטח עבודה אחת את העבודה הושלמה באמצעות 70% ספריי אלכוהול איזופרופיל.
  17. אם לאחר 28 יום הקרנית שומרת על כל הפרמטרים ההערכה [כגון מורפולוגיה, ספירת תאים, שקיפות, עובי בדיקות מיקרוביולוגיה - חיידקים פטריות באמצעות מכשיר Bactec 9240 (בקטון דיקינסון, מילאנו, איטליה)], הוא יכול להיות מועבר אל בתי החולים באמצעות המדיום התחבורה מוצגים בלוח 4. הקרנית יש להסיר והניח מ אחסון להובלת בינוני מתחת לארון זרימה למינרית האוויר.
  18. כתוצאה, במהלך האחסון, הקרנית מקבלת עבה יותר בגודל הרגיל הנדרש להשתלה, הבנקים עיניים להשתמש דה נפיחות סוכני להפחית עובי. אנו6% משתמשים dextran T500 כדי לקבל את הקרנית חזרה לגודל הרגיל שלו במדיום התחבורה. אם כי 4-8% dextran T500 יכול לשמש, 6% שימש הטוב ביותר עבורנו. זה מקל על המנתחים להשתיל קרנית ברגע שהם מקבלים את זה.

2. הוצאת הקרביים של הרשתית מן גלוב Ocular לאחר מבתקת הקרנית

  1. לאחר כריתה, הקרנית נבחרה להשתלה או מחקר מבוסס על המורפולוגיה שלה צפיפות התאים האנדותל ממוקם אחסון או בינוני שימור על 31 ° C. הנותרים של כדור העין מעובד מכן לשימוש נוסף כגון בידוד בלובן העין לצורך ניתוח, הרשתית למחקר וכו '
  2. לפני כריתה ברשתית, לוודא כי העולם עינית שלם ורק הקרנית עם החלק של בלובן העין מוסר. אם הגוף הזגוגי דביקות הוא מפריש החוצה הוא הופך להיות קשה להסיר רקמת הרשתית.
  3. אם התורם הוא מתחת גיל 65, בלובן העין הואנשמר תחת PBS סטרילי לצורך ניתוח לאחר בדיקה סרולוגית. במקרה זה, בלובן העין לא לחתוך, רק את הגוף הזגוגי יוסר בלובן העין כולה נשמר.
  4. עבור כריתה ברשתית, להתחיל לחתוך חתך קטן או מהצד של הקרנית בלובן העין נעה לכיוון עצב הראייה באמצעות מלקחיים סטריליות ומספריים. להחזיק חלק בלובן העין באמצעות מלקחיים ולחתוך עם מספריים ישר כלפי עצב הראייה חיתוך בין השאר על ידי הימנעות חלק נזק הגוף הזגוגי.
  5. לוחות כורוידאלית יש להפריד בלובן העין כפי שהם תקועים יחד. חותכים את בלובן העין כולה לחשוף את הרקמה דמית העין. לאחר בלובן העין נחתך לגמרי, להפריד בלובן העין עם הנותרים של הגוף הזגוגי על ידי חיתוך זה ליד עצב הראייה. כדור שלם של הגוף הזגוגי מכוסה דמית העין יהיה גלוי כפי שמוצג באיור 2 א.
  6. באמצעות שני מלקחיים סטריליות להסיר את השכבה דמית העין בעדינות על ידי מרים אותו עם 1זוג מלקחיים והסרה אותו עם האחר. לחלופין, שכבה דמית העין ניתן להסיר באמצעות מספריים אך רצוי להימנע מכיוון שהוא עלול לגרום נזקים ברשתית. להסיר את השכבה דמית העין באופן חלקי ופצע אותו כדי להקל על ההסרה.
  7. ברגע שכבה דמית העין מוסר, שכבה שקופה של הרשתית שנראה בבירור כפי שמוצג באיור 2 ב. שכבה דמית העין יש קרום ברוך הפנים אשר יכול גם להסיר אך קשה לזהות אותה בעין בלתי מזוינת.
  8. כמו כן, משתמשים בשני מלקחיים כדי להסיר את שכבת הרשתית כפי שמוצג באיור 2 ג. קל לבודד כמות גבוהה של הרשתית אם נכרת ליד עצב הראייה. כל השכבות של העין ניתן לראות כעת כפי שמוצג באיור 2.
  9. לאחר רקמת הרשתית הוסר, הוא יכול לשמש למטרות שונות, ולכן הצעדים הבאים ותנאים המשמשים לשימור עשויה להיות שונה בהתאם. למשל,רקמת הרשתית ניתן להציב צינורות המכילים RNA ייצוב חומרים כימיים (כמו RNAlater) או בולם תמוגה (להפקת RNA או DNA), dispase / טריפסין (עבור בידוד של תאים), פתרונות תיקון (לפני להטביע הרקמות פרפין או אוקטובר על אימונוהיסטוכימיה).
  10. לנקות את כל שטח עבודה ולנקות את האזור באמצעות ספריי 70% אלכוהול איזופרופיל.

3. נציג תוצאות

שפת corneo-scleral כפי שניתן לראות באיור 1 א הוא הקרנית נכרת כראוי עם הסכום הנדרש של שפת scleral ומורפולוגיה האנדותל, זה סוג של הקרנית משמש בדרך כלל עבור keratoplasty חודר. אם stroma הקדמי של הקרנית נכרת פגום עם נוכחות של אטימות, הקרנית יכול לשמש keratoplasty האנדותל / keratoplasty lamellar האחורי (האנדותל עם חלק stroma). לעומת זאת, אם שכבת האנדותל ניזוק או אם צפיפות תא האנדותל הוא <2200 תאים / מ"מ 2 (הואעליאן רגילה), הקרנית יכול לשמש keratoplasty lamellar הקדמי (אפיתל עם החלק הקדמי של stroma). אם ספירת תא האנדותל הוא פחות הנדרש, הקרנית יכול לשמש keratoplasty lamellar מחקר הקדמי או בעוד, אם הקרנית ניזוקה לחלוטין, יכול לשמש למחקר, כפי שמוצג באיור 1 ב, 3 ב ו 3 ג או מושלך. הנזק יכול להיות הגורם טיפולו הכושל רקמות, ניתוחי קטרקט לפני המובילים צלקות אנדותל סטרומה או descemet, פיתוח של פגיעה פיזית וכו 'במהלך חייו של החולה לכן, יהיה צורך לבדוק כל רקמה עם מנורת סדק ולאחר מכן תחת מיקרוסקופ אופטי צלקות עדינים / קפלים / ופלוגות. הקרנית נשמרת בדרך כלל תחת שני תנאים שונים כגון תרבות איבר (כ -31 ° C) משמש בדרך כלל במדינות אירופה או תנאים היפותרמיה (כ 4 ° C) משמש בדרך כלל בארצות הברית. אנו משתמשים בתרבות איבר כמו זה עוזר לחדש את הסכרבתאי אפיתל בגיל, כדי לבדוק מחדש להחיות תא האנדותל עם הזמן שלאחר מות, תקופת אחסון של 4 שבועות אשר נותן חלון מספיק לתכנון ניתוח, נותן מספיק זמן לבדיקות מיקרוביולוגיות (חיידקים פטריות) ו סרולוגית וכו הקרנית ניתן לשמר גם במדיום התחבורה למשך 7 ימים.

בלובן העין אפשר לחתוך חלק אחר חלק להבטיח הסרה עדינה של כל לוחות כורוידאלית. נוזל זגוגי יכול להפריש כאשר עצב הראייה, דמית העין או ברשתית נחתך בחדות כפי שמוצג באיור 4. הרשתיות אם הכרותות לניתוח RNA צריך להישמר RNAlater ברגע רקמות נכרת. בדרך כלל 1x1 ס"מ דמית העין שכבת הרשתית הוא נכרת ואחרי שמירה על אותה ב RNAlater במשך 24 שעות ב 4 ° C נשמר תחת -80 עד ° C ב טריים צינורות Eppendorf (בטוח נעילת צינורות, 2 מ"ל), או להשתמש המצורף יבש קרח. רקמת הרשתית יש נכרת באמצעות שני מלקחיים ליד עצב הראייה מן איריסאו שולי ריסי כדי למנוע זיהום פיגמנט עם מבנים אחרים יש להעביר למיכל שמירה מיד RNA נעשה לא יציב בעת אחזור הרשתית.

איור 1
תרשים 1 השוואה בין טוב הקרנית באיכות ירודה.) הקרנית נכרת כראוי. כך הקרנית נשמרת בדרך כלל למשך 4 שבועות תחת התרבות איברים. מיקרוביולוגית (באמצעות מכשיר Bactec 9240) ו מורפולוגי (מכתים את התאים עם trypan כחול לקביעת המוות התא התבוננות תאים תחת מיקרוסקופ אופטי עם הגדלה 100x) בדיקה מתבצעת לפני העברת אותו לבית החולים (איור 3 א) ב) הקרנית מכופף , אשר מוביל בסופו של דבר דחיית השתל בשל קפלי descemet העליון של התא גבוהה נזק האנדותל לבחון באמצעות מיקרוסקופ מנורת סדק. כך הקרנית משמש בדרך כלל מילearch או נמחק.

איור 2
איור 2. שיטת להבטיח כריתה מדויקת של רקמת הרשתית.) הביתור בלובן העין מן העולם עיניים באמצעות להב 24 מ"מ עם 95 מ"מ מעוגלת או מספריים הקצה הקהה ​​סטריליים ו 100 11X2 מ"מ הנשלט על ידי מלקחיים שיניים 0.70 מ"מ סטריליים. בלובן העין יש לצמצם על ידי החזקת צד אחד עם מלקחיים את חיתוך ישר לכיוון עצב הראייה באמצעות מספריים. שכבה דמית העין עכשיו יהיה לראות בקלות, ב) באמצעות שני 100 11X2 מ"מ הנשלט על ידי השיניים 0.70 מ"מ מלקחיים סטריליות, דמית העין מוסר, והרסנו אותו לגזרים, אשר חושף את השכבה הבסיסית רשתית שקוף, ג) ברשתית שכבת שקוף הוא נכרת בזהירות ליד עצב הראייה ללא הפרשת נוזל הזגוגית באמצעות מלקחיים אותם. שני מלקחיים את צריכה להחזיק בכל צד של הרשתית רקמה יש להסיר בעדינות ומתחילהגר ליד עצב הראייה נע לכיוון הקרנית, כדי לקבל כמות טובה של רקמת הרשתית. רקמת ניתן לחתוך בגדלים שונים המשמשים בניסויים ניתוח, ד) שכבות שונות של העין לאחר הסרת הקרנית ניתן לראות בנתון זה. הגוף דמית העין יוסר בעקבות לראשונה על ידי הרשתית מבלי לפגוע בחלקים אחרים של העין.

איור 3
איור 3. השוואה בין סוגים שונים של צפיפות התאים ומורפולוגיה הנצפים בהגדלה 100x של מיקרוסקופ אופטי.) תא טוב צפיפות האנדותל (> 2200 תאים / מ"מ 2) ומורפולוגיה (פולימורפיזם פחות, ניוון נמוכה, ללא ניוון ו 0% תמותה) ב הקרנית אשר מתאים להשתלה, ב) התא המסכן צפיפות האנדותל (כ 1200 - 1400 תאים / מ"מ 2) ומורפולוגיה (פולימורפיזם גבוהה מאוד degeneration של תאים) עם 30-40% בתמותה הכוללת כ נצפות לאחר צביעה בכחול trypan, ג) חלק לתאי אנדותל ניזוקו עקב ניתוק של גיליון אנדותל תוך אחזור הקרנית מן העולם עינית. זה אושר על ידי התבוננות התמותה של התאים צבעונית באזור על ידי trypan כחול; ד) קפלים של descemet נוצרות בשל טיפולו הכושל של הקרנית על ידי כיפוף, יצירת מתח הקרנית צלב, תוך שימוש בכלים מאוד וכו 'בזמן של כריתה. האיור מציג את קפלי עבים רפואיות המפותחות שנמצאו בין הפריפריה לאזור הראייה של הקרנית.

איור 4
באיור 4. נזקי דמית העין ורקמות רשתית תוך מבתקת הקרנית מוביל בסופו של דבר הפרשה של נוזל זגוגי. הרשתית מקבלת מעורב הגוף הזגוגי ולכן קשה בלו רקמה באיכות טובה Without זיהום.

טבלה מס '1
טבלה 1. סיכום של מגוון של פעילויות המבוצעות באמצעות גלובס עינית אדם במהלך 2009 ו -2010 ב Fondazione Bancà דגלי Occhi (ונציה, איטליה). כ -60% רקמות שימשו להשתלה, ובכך להשאיר מספר גבוה של גלובס עינית (סביב 40%) למחקר המדעי והרפואי.

משלים איור 1
משלים באיור 1. אנטומיה של העין האנושית 5. בחלקים שונים של העין האנושית מצוינים בנתון זה, נהג לעקוב אחר המיקום המדויק של הרקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שניהם, כריתה נכונה ושמירה נכונה של רקמות הקרנית הרשתית הם קריטיים כמו פגמים קלים כגון נזק האנדותל או מספר גבוה של קפלים של descemet יכול להוביל לכישלון השתל של הקרנית ואילו שינויים בטמפרטורה או טיפולו הכושל יכול להתפשר על שלמות רקמות הרשתית. מטרת מאמר זה היא להראות כיצד רקמות הקרנית ברשתית יכול להיות מבודד באופן אופטימלי, ללא גרימת נזקים או שינויים, אשר עלול לסכן את השימוש בהם להשתלה או למטרות מחקר. המינימום הנדרש תא צפיפות (<2200 תאים / מ"מ 2), מורפולוגיה טובה כגון גודל התאים, מבנה ניוון נמוכה של גבולות אינטר והעדר של ניוון יחד עם שקיפות טובה ועובי נכון של הקרנית סימני ההיכר ההופכים רקמות מתאים ההשתלה. אם הלהב אזמל משמש בערך או מכשירים אחרים נמצאים בשימוש אינטנסיבי, זה לא רק לפגוע בקרנית, אלא גם את הגוף הזגוגי מה שהופך furtכריתה שלה של רקמות אחרות קשה יותר (איור 4). הרשתית היא רקמה שקופה ולכן קשה לזהות אם הנוזל הזגוגי הוא שוחרר עם זה, זה בדרך כלל עושה כריתה של רקמת הרשתית מורכבת יותר. אם נכרת עם הגוף הזגוגי, איכות רקמת הרשתית או RNA שחולצו יהיה רע מאוד בשל זיהום עיניים עם חלקים אחרים. לכן, השיטה מתאימה הקרנית או הרשתית בלו חשוב מאוד לקחת רקמה באיכות מעולה.

הנתונים הקודמים של השנתיים האחרונות (טבלה 1) עולה כי כ 60% קרניות שאנו אוספים מן גלובס עיניים מתאימים סוגים שונים של השתלה. זוהי הפגנה נוספת לכך את הטכניקה כריתה הקרנית המתואר במאמר זה היא שיטה טובה לאיסוף גבוהות ברקמות הקרנית איכות מן גלובס עיניים. הקרניות עשוי, כמובן, להיות מתאימים להשתלה בשל פרמטרים אחרים שלuch כמו הפרעות סטרומה, זיהום, צפיפות מורפולוגיה האנדותל / התאמה, התורם וטראומה מכני / פיזי שנגרם תוך שמירה על הקרנית. עם זאת, אם את הפרמטרים הנ"ל הם בסדר גמור, את טכניקת שתיארנו כאן מאפשר שליפה של רקמות באיכות טובה לשמש להשתלה בחולים עם מחלות עיניים על פני השטח.

בעוד שמידע על הוצאת הקרביים של רקמות רשתית מ במודלים של בעלי חיים היא הנפוצה 11,12, למיטב ידיעתנו זו הפעם הראשונה שבה כל כך טכניקה מתואר על בידוד של רקמות הרשתית של העין האנושית גלובס. ואכן, מחקר על ספרות, לא הניב כל תוצאה על ניירות דנים בנושא זה. אנו מאמינים כי אם העולם האנושי לנתיחה העין מתבצעת כמתואר, מדענים מחקר יוכל לקבל רקמות באיכות טובה לשמש עבודות מחקר שלהם. הבנקים עיניים רבות ברחבי העולם צפויים לקבל נורות העין (אבל גם קרניות) שאינם שלuitable להשתלה. במקרה שלנו, כמעט 40% של קרניות (ואת נורות עיניים) שיש לנו לאסוף ולעבד לא ניתן להשתיל (עקב מגוון רחב של סיבות), אבל עדיין יכול לשמש למטרות מחקר. השיטה המתוארת במאמר זה עושה לאפשר אוסף של רקמות באיכות גבוהה. זה הודגם לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו בעת ניתוח RNA עם T <24hrs המופק רקמות הרשתית אשר נקצרו באמצעות טכניקה המתואר במאמר זה 10. אנו מאמינים באותה טכניקה יכול לשמש כדי לבודד את רקמות הרשתית עבור רבים למטרות שונות אחרות, כגון (א) ללימודים transcriptome רשתית, (ii) ללמוד לקדם את השימוש בתאי גזע המושרה גזע pluripotent ברפואה אישית 8, (iii ) לפתח RNA ביטוי של גנים אטלס רטיניטיס פיגמנטוזה של הרשתית האנושית 9, (ד) כדי לייעל את שיטת הפקת RNA, (v) תא גזע מחקרים לחדש רקמות רשתית ועוד

טכניקה זו wחולה להיות מועיל עבור אלה שרוצים לבצע את החתכים או ניסויים כאלה אבל יש מידע מוגבל על שיטה להשתמש קרניות אדם או הרשתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות מענקים של ונטו Regione (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 ו Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). המחברים מודים לד"ר ג Griffoni עבור הנתונים 2009/2010 סיכום על השימוש גלובס עיניים אנושיות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for excision of cornea and retina.
Guarded disposable scalpel Blade size 15 Swann-Morton
Sterile bandages 5 cm X 5 cm, 8 layered, 5 pcs Artsana
Sterile disposable medical towel 35 X 50 cm U.Jet
Sterile scissors Blades 24 mm / overall length. 95 mm curved, blunt e.janach
Sterile forceps Stainless steel -100 mm 11 X 2 ruled by 0.70 mm teeth e.janach
Corneal claw – Disposable medical device NIIOS (Hippocratech)
PBS 100 ml PBS [10x] in 900 ml d/w (distilled water) Sigma-Aldrich
Na-thiosulphate 1 gm Na-thiosulphate in 1 litre of PBS [1x] Sigma-Aldrich
I-PVP 5 gm I-PVP in 1 litre d/w Sigma-Aldrich
Table 2. The table describes the materials used for excision of cornea and retina and the company they are received from.
Materials for storage medium (2000 ml).
MEM (1X) liquid Invitrogen 32360-034
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-039 1mM (10ml/l)
L-glutamine Invitrogen 25030-032 2mM (10ml/l)
Antibiotic/antimycotic Sigma-Aldrich A5955-20ML 10ml/l
Newborn calf serum Invitrogen 26010-74 2% (20 ml/l)
Table 3. Materials for storage medium.
Preparation of storage medium
Add all the ingredients using the specific concentrations as given above in a jar and mix well. Filter them using pore size of 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) with help of a peristaltic pump. Preserve the medium in the bottles at RT.
Materials for transport medium (2000 ml).
MEM (1X) liquid Invitrogen 32360-034
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-039 1mM (10 ml/l)
L-glutamine Invitrogen 25030-032 2mM (10 ml/l)
Newborn calf serum Invitrogen 26010-74 2% (20 ml/l)
Dextran t500 Pharmacosmos 551005004007 6% (60 gm/litre)
Table 4. Material for transport medium.
Preparation of transport medium
Add Dextran 6% in ~ 1.5 litre of MEM and leave it overnight. Add the rest of ingredients in the media and filter using 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) using a vacuum pump. Preserve the medium in the bottles at RT.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fay, A. Diseases of the visual system. Cecil Medicine. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).
  2. Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. Patents in Limbal Stem Cell Biology. Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).
  3. Pharm, U. S. The Eye: The physiology of human perception. Britannica educational publishing. 36, 19-27 (2011).
  4. Lang, G. Ophthalmology: A pocket textbook atlas. , 2nd Edition, 115-117 Forthcoming.
  5. Liesbeth, P. els Organ Culture: The method of choice for preservation of human donor corneas. Br. J. Ophthalmol. 81, 523-525 (1997).
  6. Meyer, J. S., Howden, S. E., Wallace, K. A., Verhoeven, A. D., Wright, L. S., Capowski, E. E., Pinilla, I., Martin, J. M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J., Gamm, D. M. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. , (2011).
  7. Trifunovic, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2330-2336 (2008).
  8. Mora, P., Montanini, L., Ferrari, S. Retina. 30, 1555 (2010).
  9. Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (48), e2563 (2011).
  10. Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses. J. Vis. Exp. (50), e2795 (2011).

Tags

הרפואה גיליון 64 פיזיולוגיה האדם העולם פגר העין, רקמת הקרנית, הוצאת הקרביים רקמת הרשתית
טכניקה פשוטה עבור<em&gt; באתרו</em&gt; כריתת של הקרנית ואת הוצאת הקרביים של רקמת רשתית מ גלוב Ocular האדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parekh, M., Ferrari, S., Iorio, E.More

Parekh, M., Ferrari, S., Iorio, E. D., Barbaro, V., Camposampiero, D., Karali, M., Ponzin, D., Salvalaio, G. A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe. J. Vis. Exp. (64), e3765, doi:10.3791/3765 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter