En forenklet Teknikk for Published: June 12, 2012 doi: 10.3791/3765

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Mohit Parekh¹, Stefano Ferrari¹, Enzo Di Iorio¹, Vanessa Barbaro¹, Davide Camposampiero¹, Marianthi Karali², Diego Ponzin¹, Gianni Salvalaio¹

¹Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S., ²Telethon Institute for Genetics & Medicine (T.I.G.E.M.)

Summary

Notatet beskriver en forenklet metode for å skjære hornhinnen og eviscerate retinal vev fra okulær verden av menneskelige avdød givere. Teknikken er beskrevet her, vil bidra til å avgiftsetaten gode vev som skal brukes til transplantasjon, kirurgisk eller forskningsformål uten å skade andre vev av okulær kloden.

Abstract

Enucleation er prosessen å hente i øyet kloden fra en avdød donor la resten av verden uforstyrret. Excision refererer til henting av okulære vev, spesielt hornhinne, ved å kutte den atskilt fra okulær verden. Evisceration er prosessen med å fjerne de indre organene nevnt her som netthinnen. Den okulær verden består av hornhinnen, sklera, den glasslegeme, linsen, iris, netthinnen, den årehinnen, muskler etc (Suppl. figur 1). Når en pasient lider av hornhinneskader, må hornhinnen fjernes og et sunt må transplanteres med keratoplastic surgeries. Genetiske sykdommer eller mangler i retina-funksjonen kan kompromittere visjon. Menneskelige okulære globuser kan brukes til ulike kirurgiske prosedyrer som øye bank, transplantasjon av menneskets hornhinnen eller sclera og forskning på øyevevet. Men det er lite informasjon tilgjengelig på menneskelig hornhinnen og retinal excision, sannsynligvis på grunn av limited tilgjengelighet til menneskelig vev. De fleste studier som beskriver liknende prosedyrer er utført på dyremodeller. Forskere avhengige av tilgjengeligheten av skikkelig dissekert og godt bevart øyevevet for å utvide kunnskapen om menneskets øye utvikling, homeostase og funksjon. Som vi får høy mengde av okulære globuser ut som ca 40% (Tabell 1) av dem brukes til forskningsformål, er vi i stand til å utføre store mengder eksperimenter på disse vev, definere teknikker for å skjære og bevare dem regelmessig.

Hornhinnen er en avaskulær vev som muliggjør overføring av lys på netthinnen og for dette formålet bør alltid opprettholde en god grad av åpenhet. Innenfor hornhinnen, hjelper Limbus regionen, som er et reservoar av stamceller, gjenoppbygging av epitelceller og begrenser overvekst av conjunctiva opprettholde hornhinnen åpenhet og klarhet. Størrelsen og th ickness av hornhinnen er kritiske for klar visjon, som endringer i noen av dem kan føre til forstyrret, uklart syn. Hornhinnen består av 5 lag, a) epitel, b) Bowman er lag, c) stroma, d) Descemet membran og e) endotelet. Alle lag skal fungere skikkelig for å sikre klar visjon ^4,5,6. Det choroid er mellomvert tunika mellom sclera og netthinnen, grenser i interiøret av Bruch membran og er ansvarlig for blodstrøm i øyet. Den choroid bidrar også til å regulere temperaturen og rekvisita næring til de ytre lagene av netthinnen ^5,6. Netthinnen er et lag av nervevev som dekker baksiden av okulær kloden (Suppl. figur 1) og består av to deler: en photoreceptive del og en ikke-mottagelig del. Netthinnen bidrar til å motta lys fra hornhinnen og linsen og konverterer den til den kjemiske energien til slutt overført til hjernen ved hjelp av synsnerven ^5,6.

ove_content "> Målet med denne artikkelen er å gi en protokoll for disseksjon av hornhinnen og retinal vev fra mennesker okulære globuser. unngå krysskontaminering med tilstøtende vev og bevare RNA integritet er av fundamental betydning som slike vev er uunnværlig for forskningsformål rettet ved (i) karakteriserer transkriptom av okulære vev, (ii) å isolere stamceller for regenerativ medisin prosjekter, og (iii) evaluere histologiske forskjeller mellom vev fra normale / berørte personer. I denne artikkelen beskriver vi teknikken vi bruker til å fjerne hornhinnen, årehinnen og retinal vev fra en okulær verden. Her gir vi en detaljert protokoll for disseksjon av menneskekroppen okulær kloden og eksisjon av hornhinnen og retinal vev. Den medfølgende videoen vil hjelpe forskere til å lære en passende teknikk for henting av edle menneskelige vev som er vanskelig å finne regelmessig.

Protocol

1. I situ Excision av hornhinnen fra Okulære Globes

1. Slå på laminær luftstrøm skapet omtrent 15 minutter før bruk. Rengjør laminær hetten med 70% isopropyl alkohol. Ta på personlig beskyttelsesutstyr som kirurgiske lue og maske. Skrubb hender og underarmer og tørk med en steril håndkle. Bruk sterile hansker og kappe eller ermene aseptisk teknikk.
2. Sett opp det sterile feltet ved å plassere en steril instrument skuff aseptisk. Kontroller at instrumentene er sterile. Åpne den sterile instrumenter pakningen og vipp på det sterile feltet unngå kontaminasjon.
3. Plasser alle sterile materialer og instrumenter (tabell 2) sammen med flasker (eye glass) som inneholder øye globuser slik at de er like ved kanten av sterile feltet for enkel bruk.
4. Merk flaskene med tidligere utarbeidet bevaring / lagringsmedium som angitt i tabell 3 og plasserm på overflaten av laminær luftstrøm hette sammen med I-PVP (jod-Polyvinylpyrrolidone), natrium thiosulphate og en steril saltoppløsning PBS (fosfat buffer saltvann).
5. La okulære vev og løsninger for å oppnå normal romtemperatur slik de er bevart i kjøleskap ved 4 ° C. Unngå gjentatte oppvarming / kjøling sykluser. Hold lokkene av løsningen og øyet krukker med innvendig vendt oppover siden deres respektive krukker.
6. Fjern gauzes og svamper fra øyet glasset med steril tang. Fordyp kloden i sterile I-PVP 0,5% i 2 minutter til dekontaminere okulære globuser. Plasser de to tang på lokket av den sterile skuffen, utenfor sterile feltet. Overfør kloden i natrium thiosulphate 0,1% for ett minutt med et annet par steril tang. Bruke de samme tang, overføre kloden til flasken inneholder steril saltoppløsning (PBS) og la den till den drives. Gjenta samme prosedyre for den andre okulære kloden fra than samme donor.
7. Arbeid under laminær luftstrøm hette, pakk hele verden ved hjelp av steril kompress (bandasjer) forlater hornhinnen og ca 5 mm sclera fra hornhinnen avdekket. Øyet pære kan bare holdes i hånden opprettholde tilstrekkelig press. Vevet bør holdes fuktig under hele operasjonen.
8. Tang brukes sammen med saks for å fjerne alle eventuelle rester av conjunctiva. Hold instrumentene som brukes for operasjonen over atskilt fra andre instrumenter. Bruk en skalpell blad å utføre en skleral snitt på 3-4 mm fra Limbus region, og utvide snittet ved 360 °, unngå å perforere den underliggende uveal vev eller forårsake deformasjon av hornhinnen normale krumning. Skjær fire store snitt etterlater fire små hull unngå utskillelsen av glasslegeme. Alle fire hull er skåret sikrer ikke fjerning av andre vev.
9. Tilstedeværelse av små skleral plakk kan hemme skjæring, så sørg for å compLete den skleral eksisjon med mikrokirurgi saks. Denne operasjonen skal utføres uten å skade årehinnen, netthinnen og glasslegeme.
10. Inspiser snitt for å sikre at det er fullført. Hvis snittet er utført korrekt corneo-skleral rim fester seg til ciliary organer bare på det punktet i korrespondanse med hornhinnen.
11. Sett innpakket okulær kloden ned nær sentrum av den sterile feltet. Fullfør hornhinnen fjernes ved hjelp av pinsett for å holde skleral felgen stasjonære og hånden som brukes for excision å trekke ciliarkropp-choroid nedover og vekk fra corneo-skleral knapp.
12. Forsiktig skille eventuelle gjenværende sammenvoksninger fra corneo-skleral knapp. Verken trekke corneo-skleral rim på en måte som kunne føre til cross-hornhinnen spenning og heller la den slippe ned igjen på fremre kammer.
13. Den endotelcelle tetthet av hornhinnen kontrolleres ved hjelp av en hypoton løsning, og cellen dødelighet kontrolleres ved hjelp av en Trypen blå flekker for rundt 1 min, og cellene blir deretter telles under en optisk mikroskop og målt som antall celler / mm ^2. Den fremre kammer skal vende lokket mens bakre skal vende bunnen av Petri plate. Den endotelcelle tetthet kunne telles manuelt med et rutenett i målet etter 100X forstørrelse. Minste aksepterte celletall for transplantasjon i Italia er 2200 endotelceller / mm ^2.
14. Overfør corneo-skleral rim med en hornhinnetransplantasjon klo til tidligere utarbeidet hornhinnen lagringsmedium bevart på RT (romtemperatur) som vist i Tabell 3.
15. Undersøk bakre kammer for en naturlig krystallinske linsen. Hvis sklera er forberedt, fjerne alle rester av Uvea og glasslegemet fra hele kloden. Nøye pakke og returnere den gjenværende bakre segment til sin respektive øye krukke, ved bruk av aseptisk teknikk. Gjenta fremgangsmåten for den andre verden ved hjelp av nye instrumenter. Fest hornhinnen viddh hornhinnen klo og bevare under lagringsmedium (orgel kultur) ved 31 ° C. Den excised hornhinnen, som vist i Figur 1a, kan deretter brukes til keratoplasty eller forskning.
16. Kast de unødvendige materialer og bio-farlig avfall i hensiktsmessige søppelbøtter. Rengjør arbeidsområdet når arbeidet er ferdig med 70% isopropylalkohol spray.
17. Hvis det etter 28 dager hornhinnen beholder alle vurderingskriteriene parametere [for eksempel morfologi, celletall, gjennomsiktighet, tykkelse og mikrobiologi tester - bakterier og sopp hjelp Bactec 9240 instrument (Becton Dickinson, Milan, Italia)], kan det da bli transportert til sykehusene ved hjelp av transportmedium vist i Tabell 4. Hornhinnen bør fjernes og plasseres fra lageret til transportmedium henhold laminær luftstrøm skap.
18. Som under lagring, får hornhinnen tykkere enn den vanlige størrelsen som kreves for transplantasjon, øye banker bruker de-hevelse agenter for å redusere tykkelsen. Vibruker 6% dekstran T500 å få hornhinnen tilbake til sin normale størrelse i transportmedium. Selv 4-8% dekstran T500 kunne brukes, har 6% tjent best for oss. Dette gjør det lettere for kirurger å transplantere hornhinnen så snart de mottar den.

2. Evisceration av netthinnen fra Ocular Globe etter excising hornhinnen

1. Etter excision, er hornhinnen valgt for transplantasjon eller forskning basert på morfologi og endotelial celle tetthet og er plassert i lagringsplass eller bevaring medium ved 31 ° C. De resterende av okulær kloden blir så behandlet for videre bruk, for eksempel sclera isolasjon for kirurgiske formål, netthinnen for forskning etc.
2. Før retinal eksisjon, sørg for at okulær kloden er intakt og bare hornhinnen med en del av sclera fjernes. Hvis den geléaktige glasslegeme er secreting ute blir det vanskelig å fjerne en retinal vev.
3. Dersom donor er under 65 år, er det sclerabevart under sterile PBS for kirurgiske formål etter serologisk testing. I dette tilfellet er sclera ikke kuttes, bare glasslegeme fjernes og hele sclera er bevart.
4. For retinal eksisjon, starte med et lite kutt eller innsnitt fra hornhinnen siden av sclera beveger seg mot synsnerven ved hjelp av sterile tenger og sakser. Hold den delen av sclera med pinsett og klipp med saksen rett mot synsnerven kutte del for del unngå skade på glasslegeme.
5. Koroidal plaques bør skilles fra sclera som de henger sammen. Skjær hele sclera å avdekke choroid vev. Når sclera er helt kuttet, skille sclera med resten av glasslegeme ved å kutte den nær synsnerven. En hel ball av glasslegeme dekket med choroid vil være synlig som vist i figur 2a.
6. Bruk to steril tang fjerne choroid lag forsiktig ved å plukke den opp med enpinsett og fjerne den med andre. Alternativt kan choroid laget fjernes med saks, men dette bør ideelt sett unngås da det kan føre til skader på netthinnen. Fjern choroid laget delvis og kutt det å lette fjerningen.
7. Når choroid laget er fjernet, vil en gjennomsiktig lag av netthinnen sees tydelig som vist i Figur 2b. Den choroid laget har en indre Bruch membran som også kan fjernes, men det er vanskelig å identifisere den med en blotte øye.
8. Tilsvarende bruke to pinsett til å fjerne retinal lag som vist i Figur 2c. Det er lett å isolere høy mengde av netthinnen hvis excised nær synsnerven. Alle lagene i øyet kunne nå sett på som vist i figur 2d.
9. Når retinal vev er fjernet, kan det brukes til ulike formål og derfor etterfølgende trinn og betingelser brukes til bevaring kan variere tilsvarende. For eksempel,retinal vev kan plasseres i rør som inneholder RNA stabilisering reagenser (som RNAlater) eller lysis buffer (for RNA eller DNA-ekstraksjon), dispase / trypsin (for isolering av celler), fikse løsninger (før å legge vev i parafin eller oktober for immunhistokjemi).
10. Fjern alle arbeidsområdet og rengjør området med 70% isopropylalkohol spray.

3. Representative Resultater

Den corneo-skleral felg sett i Figur 1a er en skikkelig excised hornhinne med nødvendige mengden skleral felg og endotelial morfologi, denne typen hornhinnen er vanligvis brukt for gjennomtrengende keratoplasty. Hvis den fremre stroma av excised hornhinnen er skadet med tilstedeværelse av dekkevne, kan hornhinnen bli brukt for endotelial keratoplasty / posterior lamellær keratoplasty (endotelet med en del av stroma). Mens hvis endotelial laget er skadet eller hvis endotelcelle tetthet er <2200 celler / mm ² (DetAljan standard), kan hornhinnen bli brukt for anterior lamellær keratoplasty (epitel med en del av fremre stroma). Dersom antall endotelceller er mindre enn ønsket, kan hornhinnen bli brukt for anterior lamellær keratoplasty eller forskning mens hvis hornhinnen er skadet fullstendig, kan det brukes til forskning som vist i Figur 1b, 3b og 3c eller kasseres. Skaden kan være en årsak til feilhåndtering vevet, før operasjoner av grå stær som fører til stromale eller descemet endotelceller arr, utvikling av fysiske skader under pasientens liv osv. Derfor blir det nødvendig å sjekke alle vev med spaltelampe og deretter under optisk mikroskop for fin arr / folder / avdelinger. Hornhinnen er vanligvis bevart under to ulike forhold, for eksempel orgelkultur (ca 31 ° C) vanligvis brukes i europeiske land eller hypoterme betingelser (ca 4 ° C) vanligvis brukes i USA. Vi bruker organ kultur som det bidrar til å regenerere dammenalderen epitelceller, å re-vitalisere endotelcelle sjekk med en høy post mortem tid, gir en lagringsplass periode på 4 uker som gir tilstrekkelig vindu for å planlegge en operasjon, tilstrekkelig tid til mikrobiologisk (bakterier og sopp) og serologisk testing etc. Hornhinnen kan være godt bevart i transport medium for 7 dager.

Den sclera kunne kuttes del for del å sikre skånsom fjerning av alle koroidal plakk. Glasslegemet væske kan skille når synsnerven, årehinnen eller netthinne er kuttet kraftig som vist i Figur 4. Netthinne hvis excised for RNA-analyse bør bevares i RNAlater så snart vev er fjernet. Vanligvis 1X1 cm av årehinnen og retinal laget er fjernet og etter å holde den i RNAlater i 24 timer ved 4 ° C er bevart under -80 ° C i friske Eppendorf-rør (safe-lås rør, 2 ml) inntil brukt eller levert med tørr is. Den retinal vev bør excised hjelp av to tang nær synsnerven bort fra iriseller ciliary margin for å unngå kontaminering med andre pigmenterte strukturer og bør overføres til å bevare beholder umiddelbart som RNA blir ustabil ved henting av netthinnen.

Figur 1 Sammenligning mellom en god og en dårlig kvalitet hornhinne:. A) En skikkelig excised hornhinne. En slik hornhinne er vanligvis bevart under orgelkultur i 4 uker. Mikrobiologisk (bruker Bactec 9240 instrument) og morfologiske (flekker cellene med trypan blå for celle dødelighet besluttsomhet og observere celler under en optisk mikroskop med 100X forstørrelse) undersøkelse foretas før transportere den til sykehuset (figur 3a), b) en bøyd hornhinne fører som til slutt å pode avvisning på grunn av høy descemet sine folder og høy endotelcelle skade undersøkt ved hjelp av en spaltelampe mikroskop. En slik hornhinne brukes vanligvis for resøk eller forkastes.

Figur 2. Metode brukt for å sikre en nøyaktig excision av retinal vev. A) Dissecting den sclera fra okulær verden bruker 24mm blad med 95 mm buet eller butte enden steril saks og 100 mm 11X2 styrt av 0,70 mm tenner steril tang. Den sclera skal kuttes ved å holde en side med tang å klippe den rett mot synsnerven ved hjelp av saks. Den choroid lag vil nå være lett å se, b) Ved bruk av to 100 mm 11X2 styrt av 0,70 mm tenner sterile pinsetter, er choroid fjernes ved å rive den fra hverandre, noe som avslører den underliggende gjennomsiktig retinal lag; c) Transparent retinal lag er excised svært nøye nærheten synsnerven uten utskillelse av glasslegemet væske med de samme tang. Både tang bør ha hver side av netthinnen og vevet bør forsiktig fjernes Starting nær synsnerven beveger seg mot hornhinnen, for å få en god mengde retinal vev. Vevet kan bli kuttet i ulike størrelser og brukes for analyse eksperimenter; d) Ulike lag av øyet etter hornhinnen fjerning kan sees i denne figuren. Den choroid kroppen fjernes først, etterfulgt av netthinnen uten å skade de andre delene av øyet.

Figur 3. Sammenligning av de forskjellige typer celle tetthet og morfologi sett under 100X forstørrelse av en optisk mikroskop. En) God endotelcelle tetthet (> 2200 celler / mm ²⁾ og morfologi (mindre polymorfisme, lav degenerasjon, ingen dystrofi og 0% dødelighet) i en hornhinne som er egnet for transplantasjon, b) Dårlig endotelcelle tetthet (ca. 1200 - 1400 celler / mm ²⁾ og morfologi (meget høy polymorphism og Degeneration av celler) sammen med ca 30-40% total dødelighet er observert etter trypan blå flekker; c) En del av endotelceller er skadet på grunn av avløsning av en endotelial ark ved henting av hornhinnen fra okulær verden. Dette bekreftes ved å observere dødelighet av cellene i regionen beiset med trypan blå; d) descemet sin folder er dannet på grunn av mishandling av hornhinnen ved å bøye, lage kors hornhinnen spenning, bruke instrumentene intenst etc ved excision. Figuren viser de tykke utviklede iatrogenisk folder funnet mellom periferi og optikken sone av hornhinnen.

Figur 4. Skader til årehinnen og retinal vev mens excising hornhinnen til slutt fører til utskillelse av glasslegemet væske. Netthinnen blir innblandet i glasslegeme gjør det vanskelig å skjære en god kvalitet vev without forurensning.

Tabell 1 Sammendrag av omfanget av aktiviteter som utføres ved hjelp av humane okulære globuser løpet av 2009 og 2010 på Fondazione Banca Degli Occhi (Venezia, Italia). Omtrent 60% av vev ble brukt for transplantasjon, og dermed forlate et høyt antall okulære globuser (rundt 40%) for vitenskapelig og medisinsk forskning.

Utfyllende Figur 1. Anatomy av det menneskelige øyet ^fem. Ulike deler av menneskelige øye er angitt i denne figuren, brukes for å følge den nøyaktige posisjonen til vev.

Discussion

Både korrekt excision og forsvarlig bevaring av hornhinnen og retinal vev er kritiske som småfeil som endotelial skader eller høyt antall descemet sin folder kan føre til pode svikt i hornhinnen mens temperatur forandringer eller feilbehandling kan kompromittere integriteten av netthinnens vev. Målet med denne artikkelen er å vise hvordan hornhinnen og netthinnen vev kan isoleres optimalt, uten å indusere skader eller endringer som kan svekke deres bruk for transplantasjon eller forskningsformål. Det kreves minimum celle tetthet (> 2200 celler / mm ^2), god morfologi som celle størrelse, struktur, lav degenerasjon av intercellulær grenser og fravær av dystrofi sammen med god gjennomsiktighet og riktig tykkelse av hornhinnen er kjennetegn som gjør en vev egnet for transplantasjon. Hvis skalpell bladet brukes omtrent eller andre instrumenter brukes intenst, betyr det ikke bare skade på hornhinnen, men også den glasslegeme som gjør furthennes eksisjon av andre vev vanskeligere (figur 4). Retina er en gjennomsiktig vev og derfor vanskelig å identifisere dersom glasslegemet væske slippes med det, dette normalt gjør excision av retinal vev mer komplisert. Hvis excised med glasslegeme, vil kvaliteten på retinal vev eller RNA ekstrahert være svært dårlig på grunn av forurensning med andre okulære deler. Dermed er en passende teknikk for å skjære en hornhinne eller netthinnen svært viktig å hente en overlegen kvalitet vev.

Våre tidligere data fra de siste to årene (Tabell 1) indikerer at ca 60% av hornhinner som vi innhenter fra øyet globuser er egnet for ulike typer transplantasjon. Dette er en ytterligere demonstrasjon at hornhinnen eksisjon teknikken beskrevet i denne artikkelen er en god metode for å samle høy kvalitet corneal vev fra okulære globuser. De hornhinner kan selvfølgelig være uegnet for transplantasjon skyldes andre parametere sUCH som stromale unormalt, forurensning, endotelial tetthet / morfologi, donor egnethet og mekanisk / fysiske traumer forårsaket samtidig opprettholde hornhinnen. Men hvis de ovennevnte parametrene er fine, lar teknikken vi har beskrevet her gjenfinning av god kvalitet vev som skal brukes til transplantasjon hos pasienter med okulære overflaten sykdommer.

Mens informasjon om evisceration av netthinnens vev fra dyremodeller er allment tilgjengelig ^11,12 til vår kunnskap dette er første gang at en slik teknikk er beskrevet for isolering av netthinnens vev fra menneskelige øyet globuser. Faktisk forskning på litteraturen, ikke gi noe resultat på papirer diskuterer dette temaet. Vi tror at hvis human okulær kloden disseksjon gjennomføres som beskrevet, ville forskere kunne ha vev av god kvalitet som skal brukes for sine forskningsprosjekter. Mange øye banker rundt om i verden er sannsynlig å få øye pærer (men også hornhinner) som ikke eruitable for transplantasjon. I vårt tilfelle, kan nesten 40% av hornhinner (og øye pærer) at vi samle inn og behandle ikke bli transplantert (på grunn av et bredt spekter av årsaker), men kunne fortsatt brukes til forskningsformål. Teknikken er beskrevet i dette notatet ikke tillater innsamling av høy kvalitet vev. Dette ble nylig demonstrert av vår gruppe når analysere RNA med T <24 timer hentet fra netthinnens vev som ble høstet ved hjelp av teknikken beskrevet i denne artikkelen ^10. Vi tror den samme teknikken kan brukes til å isolere de retinale vev for mange andre ulike formål, for eksempel (i) for netthinnens transkriptom studier, (ii) å studere og fremme bruken av menneskelige induserte pluripotent stamceller i personlig medisin ^8, (iii ) for å utvikle RNA uttrykk atlas av retinitis pigmentosa gener i menneskekroppen ⁹ netthinne, (iv) for å optimalisere RNA ekstraksjon metoden, (v) stamcelleforskningen studier for å regenerere retinal vev, etc.

Denne teknikken will være gunstig for dem som ønsker å utføre slike excisions eller eksperimenter, men har begrenset informasjon om metoden å bruke menneskelige hornhinner eller netthinne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials for excision of cornea and retina.
Guarded disposable scalpel	Blade size 15	Swann-Morton
Sterile bandages	5 cm X 5 cm, 8 layered, 5 pcs	Artsana
Sterile disposable medical towel	35 X 50 cm	U.Jet
Sterile scissors	Blades 24 mm / overall length. 95 mm curved, blunt	e.janach
Sterile forceps	Stainless steel -100 mm 11 X 2 ruled by 0.70 mm teeth	e.janach
Corneal claw – Disposable medical device		NIIOS (Hippocratech)
PBS	100 ml PBS [10x] in 900 ml d/w (distilled water)	Sigma-Aldrich
Na-thiosulphate	1 gm Na-thiosulphate in 1 litre of PBS [1x]	Sigma-Aldrich
I-PVP	5 gm I-PVP in 1 litre d/w	Sigma-Aldrich
Table 2. The table describes the materials used for excision of cornea and retina and the company they are received from.
Materials for storage medium (2000 ml).
MEM (1X) liquid	Invitrogen	32360-034
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-039	1mM (10ml/l)
L-glutamine	Invitrogen	25030-032	2mM (10ml/l)
Antibiotic/antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955-20ML	10ml/l
Newborn calf serum	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)
Table 3. Materials for storage medium.
Preparation of storage medium
Add all the ingredients using the specific concentrations as given above in a jar and mix well. Filter them using pore size of 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) with help of a peristaltic pump. Preserve the medium in the bottles at RT.
Materials for transport medium (2000 ml).
MEM (1X) liquid	Invitrogen	32360-034
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-039	1mM (10 ml/l)
L-glutamine	Invitrogen	25030-032	2mM (10 ml/l)
Newborn calf serum	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)
Dextran t500	Pharmacosmos	551005004007	6% (60 gm/litre)
Table 4. Material for transport medium.
Preparation of transport medium
Add Dextran 6% in ~ 1.5 litre of MEM and leave it overnight. Add the rest of ingredients in the media and filter using 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) using a vacuum pump. Preserve the medium in the bottles at RT.