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Biology

Thiol redox आइसोटोप टैगिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री proteome रूपरेखा

Published: March 24, 2012 doi: 10.3791/3766

Summary

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों स्तर जब कोशिकाओं को तनाव की स्थिति का सामना करने के लिए उठाया है. यहाँ हम '3'-3 diaminobenzidine धुंधला के उदाहरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cysTMT लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री में redox proteome प्रोफ़ाइल के दिखा

Protocol

1. Seedlings और बढ़ रहा है और तैयारी जीवाणु

  1. Seedlings MetroMix एक विकास कक्ष (22 8 घंटे प्रकाश की एक photoperiod के साथ 160 μmol फोटॉनों -2 मीटर -1 में 500 मिट्टी मिश्रण BWI कंपनियों में अंकुरित होते हैं डिग्री सेल्सियस और 16 घंटे अंधेरे में 20 डिग्री सेल्सियस 1 सप्ताह के लिए सापेक्ष. आर्द्रता 70% करने के लिए स्थापित किया गया था Seedlings और पानी के नल से पानी पिलाया गया के रूप में सूखी बनने से मिट्टी रखने की जरूरत है.
  2. इसी तरह के आकार की दो seedlings है तो 4 "व्यास युक्त MetroMix 500 मिट्टी के बर्तन में प्रतिरोपित कर रहे हैं और 1.1 के रूप में एक ही परिस्थितियों में एक अतिरिक्त 3 सप्ताह के लिए हो.
  3. स्यूडोमोनास syringae (पीएसटी) शुरू टी रेखादार किंग्स बी (KBM) मध्यम प्लेट (लीटर प्रति 20 ग्राम Proteose peptone, ०.१,९७५ जी 4 MgSO, 1% ग्लिसरॉल, 1.5 छ कश्मीर 2 4 HPO, 18 ग्राम अगर) पर और के लिए बड़े हो 28 में दो दिन डिग्री सेल्सियस एक एकल कॉलोनी एकत्र 300μl तरल किंग्स में मिश्रित B मध्यम (20 ग्राम Proteose peptone, ०.१९७५ जी 4 MgSO, 2 HPO 4 स्टॉक के 10 एमएल (एच 2 हे के 10 एमएल में 1.5 कश्मीर दो HPO की 4 जी), और एक बी मध्यम थाली किंग्स पर फैल गया. इस रात से अधिक 28 डिग्री सेल्सियस पर सभ्य है
  4. बैक्टीरिया inoculum KBM थाली से 20 एमएल एच 2 ओ में सुसंस्कृत बैक्टीरिया scraping द्वारा तैयार किया जाता है 0.03 का एक 600 आयुध डिपो (~ 10/6 CFU मिलीलीटर) टीका बफर का 1 एल में तैयार किया जाता है (10 मिमी MgCl 2 400 μL Silwett-70). टीका बफर ऋण बैक्टीरिया नियंत्रण समाधान के लिए तैयार किया गया था.

2. पीएसटी और 2 एच 2 हे के साथ टमाटर का टीका दाग Histochemical

  1. चार सप्ताह पुराने पौधों 30 सेकंड के ऊपर टीका समाधान के लिए में सूई द्वारा टीका थे. स्पष्ट प्लास्टिक बैग पौधों पर टीका के बाद तुरंत डाल रहे थे.
  2. दाग '3'-3 diaminobenzidine (थपका) 11 (1 मिलीग्राम / एच 2 हे में मिलीलीटर थपका, 3.8 पीएच (एचसीएल)) तीन घ तैयार किया गया थाays से पहले पूरा solubilization को प्राप्त करने का उपयोग करें. समाधान के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण हिल गया था.
  3. इलाज के बाद चौबीस घंटे, पूरी तरह से विस्तार पत्ता निकाल, थपका में रखा गया था epidermal पक्ष दाग ऊपर, और 15 मिनट के लिए घुसपैठ निर्वात. पत्ते तो कमरे के तापमान पर थे अंधेरे में धुंधला के लिए रात के ऊपर रखा.
  4. पत्तियां 10 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में उबला हुआ, और फिर 75% इथेनॉल में रखा.

3. प्रोटीन निष्कर्षण

  1. कटाई के बाद, टमाटर पत्तियों तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हुए मोर्टार और मूसल के साथ ठीक पाउडर के लिए जमीन गया.
  2. ऊतक के 0.5 ग्राम के लिए, जोड़ने 1.25 एमएल Tris पीएच 8.8 phenol और बफर 1.25 एमएल / 0.5 निष्कर्षण बफर के छ (0.1 एम Tris - एचसीएल 8.8 पीएच, 10 मिमी EDTA, 0.9 एम sucrose) तो में कुछ मिनट के लिए पीस जारी धूआं डाकू.
  3. इस Oakridge अपकेंद्रित्र ट्यूब (थर्मो फिशर साइंटिफिक Nalgene कंपनी) को निकालने हस्तांतरण और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए आंदोलन.
  4. +५००० XG पर अपकेंद्रित्रऔर 15 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट. एक नई स्वच्छ ट्यूब स्थानांतरण शीर्ष phenol के चरण.
  5. वापस निकालने के बराबर मात्रा के साथ जलीय चरण phenol के बफर निकाले, 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर उत्तेजित करना. अपकेंद्रित्र और एक नए फाल्कन ट्यूब निकालने हस्तांतरण.
  6. ऊपर कदम एक बार और दोहराएँ और नई Oakridge ट्यूब निकालने हस्तांतरण.
  7. मेथनॉल 100% (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) में 0.1 एम अमोनियम एसीटेट की 5 संस्करणों जोड़कर फिनोल निकाले प्रोटीन वेग. भंवर और रात भर के लिए सेते हैं -20 डिग्री सेल्सियस पर.
  8. Centrifugation द्वारा प्रोटीन गोली 20,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ले लीजिए.
  9. 80% ठंड एसीटोन के साथ ठंड 0.1M मेथनॉल और 2 बार में अमोनियम एसीटेट के साथ गोली 2 बार धो लें. गोली के लिए 1.5 एमएल ठंड 70% इथेनॉल जोड़ें और निलंबित. 20 मिनट के लिए एक 2 एमएल microcentrifuge (संयुक्त राज्य अमेरिका वैज्ञानिक) ट्यूब और rpm के १४००० अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरण. इथेनॉल निकालें.
  10. एक SpeedVac सांद्रक में गोली संक्षिप्त सूखी और एक प्रोटीन extr में भंगकार्रवाई बफर, जैसे प्रोटीन ReadyPrep निकालना किट 3 अभिकर्मक (8 एम यूरिया के 4% लोग, 40 मिमी Tris आधार, 2 एम Thiourea) (जैव रेड). Rpm के 14,000 और 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक गोली फार्म के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
  11. प्रोटीन एकाग्रता को मापने के निर्माता की पुस्तिका (Geno प्रौद्योगिकी) के अनुसार एक प्रोटीन लिए सीबी एक्स परख का उपयोग कर.

4. नमूना और cysTMTs के साथ पेप्टाइड लेबल तैयार

  1. 2-5 μg / μL की एकाग्रता में प्रोटीन नमूना तैयार. यहाँ हम एक बड़े पैमाने पर टैग के लिए प्रोटीन का 100 μg उपयोग है, 20 μl-50 μL नमूने. इस प्रयोग के लिए सभी 6 टैग प्रयोग किया गया.
  2. मुक्त thiol समूह ब्लॉक प्रोटीन नमूना alkylation बफर के बराबर मात्रा (100 मिमी pH7.5 Tris - एचसीएल, 200 मिमी iodoacetamide) जोड़ें. बफर नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. Alkylation 37 ° C पर 1 घंटे के लिए किया जाता है.
  3. रात भर के लिए ठंडा -20 डिग्री सेल्सियस पर 80% एसीटोन के 1 एमएल जोड़कर प्रोटीन वेग. गोली 14,000 पर centrifuging प्रोटीनrpm, 4 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए. 80% एसीटोन प्रत्येक समय vortexing के साथ गोली 3 बार धोयें. सतह पर तैरनेवाला निकालें और बर्फ पर सूखी जबकि हवा की अनुमति देते हैं.
  4. 50 μL lysis बफर (6 एम यूरिया, 50 मिमी Tris आधार, 1 मिमी EDTA) में गोली Resuspend के. 100 मिमी (2 Carboxyethyl) Tris phosphine (TCEP) का 0.5 μL तो कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए incubating के द्वारा डाइसल्फ़ाइड बांड को कम करने के लिए जोड़ा जाता है.
  5. अभिकर्मक ट्यूबों acetonitrile की 20 μL जोड़ने टैग solubilize टैग तैयार. भंवर और नीचे करने के लिए नीचे स्पिन.
  6. बाहर अतिरिक्त Microcon 3KD केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस (Millipore) के का उपयोग TCEP धो लें. 50 μL नमूना Microcon 3KD स्तंभ जोड़ें, और 50 μL सेल के स्तंभ के लिए बफर. 10,000 XG और 4 सी. डिग्री पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र तीन बार की कुल के लिए इस चरण को दोहराएँ. स्तंभ निकालें और एक साफ ट्यूब में पलटना. 1000 XG और 4 सी. ° 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
  7. पीएच की जाँच करें. यदि आवश्यक हो, एम 1 एचसीएल के साथ 7.0-8.0 पीएच को समायोजित.
  8. CysTM के 5 μL जोड़ेंप्रत्येक नमूना (cysTMT अभिकर्मक किट 500 μg प्रोटीन के लिए 20 μL टैग प्रदान करता है इस पद्धति का 100 μg प्रोटीन का उपयोग करता है, इसलिए हम एक टैग के पांचवें का उपयोग करें.) टी अभिकर्मक. प्रतिक्रिया के लिए कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें.
  9. नमूने Laemmli एक 1:1 अनुपात में नमूना बफर (जैव रेड) के साथ संयुक्त थे.

5. गैर प्रतिक्रिया व्यक्त टैग नमूना Fractionation निकालना

  1. नमूने 5 मिनट के लिए उबला हुआ गया और एक पूर्व डाली 12% polyacrylamide जेल (जैव रेड) पर अलग. जेल फ़िल्टर एच 2 हे के साथ 5 मिनट के अंतराल में तीन बार से rinsed किया गया था और 1 घंटे के लिए Coomassie ब्लू (जैव रेड) के साथ दाग. जेल डी - एच 2 ओ के साथ दाग रातोंरात था
  2. बारह भिन्न प्रत्येक जेल लेन से एकत्र किए गए. Fractions प्रोटीन बैंड सांद्रता द्वारा निर्धारित किया गया है. Fractions हैं 1mm टुकड़े में काट रहे थे और एक 1.5 एमएल ट्यूब में एकत्र.
  3. जेल टुकड़े डे दाग थे, एच 2 में 50% acetonitrile और 0.1 एम अमोनियम बिकारबोनिट का उपयोग
  4. De-दाग जेल टुकड़े 15 मिनट,, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और एक SpeedVac का उपयोग कर सूखे टुकड़े के लिए 100% acetonitrile (जेल टुकड़े को कवर) का उपयोग कर सूख गया.
  5. 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट का एक ही मात्रा (लेबल नमूना के रूप में जमा) में अनुपात: 1:10 पर (Promega) trypsin (प्रोटीन trypsin) भंग. उदाहरण के लिए, 500 μL की एक मात्रा के साथ 600 μg प्रोटीन नमूना 60 μg 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के 500 μL में भंग trypsin की जरूरत है.
  6. जेल टुकड़े trypsin समाधान जोड़ें और बर्फ पर सेट करने के लिए rehydrate. यदि टुकड़े शामिल नहीं हैं 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट बफर जोड़ें. पुनर्जलीकरण के बाद, 12-16 घंटे के लिए 37 ° C पर सेते हैं.
  7. Incubated नमूनों से तरल प्रोटीन निकालने निकालें.
  8. प्रतिक्रिया बंद करो और 5% चींटी एसिड 50% acetonitrile के साथ जेल टुकड़े को कवर द्वारा किसी भी शेष प्रोटीन डाइजेस्ट को हटा दें .. कमरा ते पर 20 मिनट के लिए जेल टुकड़े शेकmperature. 5.7 से निकाले प्रोटीन नमूना ट्यूबों के लिए स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. निष्कर्षण प्रक्रिया दो बार दोहराएँ. सूखी निकाले SpeedVac का उपयोग कर पेप्टाइड्स.

6. लेबल पेप्टाइड्स cysTMT का नमूना संवर्धन

  1. एक 50% घोल के लिए 0.5 एमएल ट्यूबों विरोधी टीएमटी राल की एक ढाल जोड़ें. (ढाल fractionation जेल में बैंड एकाग्रता से निर्धारित किया गया था यदि एक अंश संग्रह एक अंधेरे बैंड के होते हैं, अधिक राल की जरूरत है. कमजोर बैंड के साथ भागों कम राल की आवश्यकता के रूप में वहाँ कम प्रोटीन है.)
  2. राल तो 1x का एक स्तंभ की मात्रा के साथ है तीन बार धोया Tris-buffered खारा (टीबीएस) (25 मिमी Tris, 0.15 एम NaCl, 7.2 पीएच) (थर्मो वैज्ञानिक पियर्स प्रोटीन अनुसंधान उत्पाद).
  3. प्रत्येक नमूना के लिए 200 μL 1xTBS जोड़ें. नमूने तो विरोधी टीएमटी राल (थर्मो वैज्ञानिक पियर्स प्रोटीन अनुसंधान उत्पाद) में जोड़ा जाता है 2 4 सी. ° रात कमाल के बाद घंटे के लिए कमरे के तापमान पर उत्तेजित
  4. (स्तंभ नमूना जोड़ेंआरएमओ वैज्ञानिक पियर्स प्रोटीन अनुसंधान) उत्पाद.
  5. प्रत्येक स्तंभ 1x 200 μL टीबीएस के साथ तीन बार धो लें. यह तो 0.05% Chaps (1x टीबीएस में भंग) के साथ तीन बार धोने के साथ पीछा किया जाता है.
  6. स्तंभ तो 1x टीबीएस में 4 एम यूरिया के साथ है तीन बार धोया. एच 2 हे दो सौ microliters तो स्तंभ तीन बार धोने के लिए इस्तेमाल किया जाता है.
  7. प्रत्येक नमूना 200 μL 50% प्रोद्धावन के बफर (50% acetonitrile, 0.4% TFA) के साथ तीन बार के eluted है.
  8. नमूने तो एक वैक्यूम concentrator में सूख रहे हैं.

7. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

  1. 3% acetonitrile की μL में 12 नमूने 0.1% चींटी एसिड के साथ है और Resuspend 5 μL एक Eksigent NanoLC-1D उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ (अटल बिहारी SCIEX, संयुक्त राज्य अमरीका) पर सीधे इंजेक्षन.
  2. पेप्टाइड्स एक Proteopep द्वितीय C18 स्तंभ 75 माइक्रोन आईडी पर अलग हो जाएगा एक्स 20 सेमी (नई उद्देश्य, संयुक्त राज्य अमरीका) एक 4-60% ढाल (एक का उपयोग कर: 3%, acetonitrile, 0.1% चींटी एसिड, बी: acetonitrile 97%, 0.1% फार्मिक एसिड)3 में μL / 60 मिनट से अधिक मिनट.
  3. एक थर्मो वैज्ञानिक LTQ Orbitrap एक्स्ट्रा लार्ज मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए एक शीर्ष 2 का उपयोग कर पेप्टाइड्स का पता लगाने एक्स 3 एक मंच एमएस मिलकर प्रयोग 3 के एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा उच्च ऊर्जा सी जाल पृथक्करण (HCD) विखंडन के साथ अधिग्रहण के बाद एमएस द्वारा 3 द्वारा पीछा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था / एमएस प्रोटीन की पहचान के लिए टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) के साथ. 50% (दो चरणों के साथ 10%); अलगाव चौड़ाई: इस मोड में टकराव ऊर्जा 3.0 मीटर z / पैरामीटर थे. केवल दोगुना और triply चार्ज पेप्टाइड्स विखंडन के लिए चयन किया गया था. गतिशील बहिष्कार मानकों करने के लिए सेट किया गया: गिनती = 1 दोहराएँ, दोहराएँ अवधि = 60; बहिष्करण सूची आकार = 500; बहिष्करण अवधि = 28. लक्ष्य मान रहे हैं के रूप में इस प्रकार है: एमएस = 5 ई 5, एमएस / एमएस (HCD) = 1 ई 5. आयन हस्तांतरण बार और FTMS एमएस / एमएस (HCD) के लिए 300 के लिए 500 के लिए सेट किया गया. दो microscans HCD स्पेक्ट्रा के लिए आवश्यक थे.

8. डेटाबेस खोज की और quantitation

  1. हासिल कर ली सीआईडी ​​और HCD डेटा के एक थेnalyzed एक branched वर्कफ़्लो जो एक रिपोर्टर आयन प्रमात्रक (टुकड़ा आयनों के 20 पीपीएम जन सहिष्णुता) लागू करने के लिए अनुपात यों के माध्यम से थर्मो वैज्ञानिक Proteome आविष्कार 1.2 सॉफ्टवेयर (थर्मो वैज्ञानिक पियर्स प्रोटीन अनुसंधान उत्पाद) का उपयोग कर. एक अलग खंड स्पेक्ट्रम चयनकर्ता, की स्पेक्ट्रम प्रसामान्यक, और स्पेक्ट्रम समूहक नोड्स के माध्यम से एमएस 2 स्पेक्ट्रा संसाधित.
  2. डेटा तब SEQUEST खोज इंजन के खिलाफ खोजा गया. एक 20 पीपीएम जन सहिष्णुता इस्तेमाल किया गया था. स्थिर संशोधनों cysTMT अभिकर्मक करने के लिए सेट किया गया (304.18 दा) और गतिशील संशोधन phosphorylation और methionine ऑक्सीकरण (15.99 दा) शामिल है. टमाटर के लिए एक कस्टम डेटाबेस शाही सेना (हार्वर्ड विश्वविद्यालय से 350,000 प्रविष्टियों के साथ के बारे में) डेटा दोनों ही मामलों में 13 इस्तेमाल किया गया था का उपयोग कर बना था.

9. प्रतिनिधि परिणाम

नियंत्रण टमाटर के पौधे की पत्ती और एक स्यूडोमोनास टीका पत्ती के एक प्रतिनिधि छवि हैचित्र 1 में दिखाया गया है. इलाज नियंत्रण और Pseudomonas के इलाज पत्तियों के बीच एक अंतर मनाया जाता है. के बाद पत्तियों को हटा रहे हैं का उपयोग दाग थपका, डी - धुंधला प्रक्रिया Histochemical दाग के लिए पत्ता ऊतक में ROS के लक्षण (चित्रा 2) दिखाने की अनुमति देता है. चित्रा 2A नहीं धुंधला साथ एक नियंत्रण पत्ती के प्रतिनिधि चित्रा 2B है. प्रतिनिधि है एच 2 हे 2 उत्पादन के लिए स्यूडोमोनास और सकारात्मक धुंधला के साथ इलाज की पत्ती की. Proteome डिस्कवर डेटा विभिन्न redox विनियमित प्रोटीन उत्पादन का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. इस प्रोटीन एक ज्ञात redox विनियमित प्रोटीन ferredoxin 1 14 है और स्यूडोमोनास syringae pv 15 टमाटर के खिलाफ रक्षा में एक भूमिका निभा दिखाया गया है. नियंत्रण और टीका नमूने के बीच पीक तीव्रता रिश्तेदार मात्रा का ठहराव है, जो ferredox में महत्वपूर्ण परिवर्तन से पता चला प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता हैमें 1 redox विनियमन (पी <0.05). उच्च तीव्रता चोटियों सुझाव है कि इस प्रोटीन रोगज़नक़ के इलाज के लिए प्रतिक्रिया में ऑक्सीकरण हो जाता है चित्रा 4 Proteome डिस्कवर डेटा एक प्रोटीन है कि एक नियंत्रण और टीका नमूना के बीच एक प्रोटीन की समान redox विनियमन है उत्पादन का एक उदाहरण है. इसी तरह की तीव्रता की चोटियों डाइसल्फ़ाइड बांड की उपस्थिति के उपचार में एक परिवर्तन के द्वारा विनियमित नहीं की सलाह देते हैं. विधि में क्रांतिकारी बदलाव होगा कैसे वैज्ञानिकों redox उत्तरदायी cysteines और 10 disulfides का पता लगाने.

चित्रा 1
चित्रा 1 टीका टमाटर का एक प्रतिनिधि छवि नियंत्रण समाधान (ए) और स्यूडोमोनास (बी) के साथ छोड़ देता है.

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चित्रा 2
चित्रा 2. टीका टमाटर की थपका धुंधला का एक प्रतिनिधि छवि नियंत्रण समाधान (ए) और स्यूडोमोनास (बी) के साथ छोड़ देता है. पत्तियां '3'-3 diaminobenzidine का उपयोग दाग रहे थे. क्लोरोफिल पत्तियों से 95% इथेनॉल में उबलते द्वारा हटा दिया गया था. डार्क धुंधला एच 2 2 हे की उपस्थिति का संकेत है. केवल टीका के साथ बैक्टीरिया संस्कृति अंधेरे धुंधला दिखाई छोड़ देता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. Ferredoxin - 1 Proteome डिस्कवर डेटा उत्पादन, विभिन्न redox विनियमित 14 प्रोटीन का एक उदाहरण है. प्रत्येक चोटी के ऊपर पीक तीव्रता पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए प्रयोग किया जाता है. नियंत्रण और टीका नमूने के बीच पीक तीव्रता प्रयोग किया जाता हैरिश्तेदार मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने के लिए.

चित्रा 4
चित्रा 4 Proteome डिस्कवर डेटा एक प्रोटीन है कि एक नियंत्रण और टीका नमूना के बीच इसी तरह के शिखर तीव्रता उत्पादन का एक उदाहरण है. इसी तरह की तीव्रता की चोटियों डाइसल्फ़ाइड बांड की उपस्थिति के उपचार में एक परिवर्तन के द्वारा विनियमित नहीं की सलाह देते हैं.

Discussion

इस प्रोटोकॉल एक थपका धुंधला प्रदर्शन पर जानकारी के cysTMT लेबल redox सिस्टीन मात्रा का ठहराव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रदान करता है. इन प्रक्रियाओं ROS के उत्पादन के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रोटीन विनियमन कि जब रक्तवृतांक्त स्यूडोमोनास syringae साथ inoculated है पर प्रभाव की जांच करने में फायदेमंद होते हैं. इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत तरीकों पूरी पत्ती के नमूने में एक तरीका है कि पत्ता ऊतक को नुकसान के कम से कम राशि का कारण बनता है में ROS की जांच के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं. लेबलिंग प्रक्रिया करने के लिए एक एक सिस्टीन लेबलिंग विधि के उपयोग द्वारा संभावित redox विनियमित प्रोटीन की जांच करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. यह फायदेमंद है, जब तनाव प्रतिक्रिया का एक प्रारंभिक चरण की जांच.

आइसोटोप कोडित संबंध (ICAT) टैग और cysTMT के तरीके के रूप में जैविक नमूनों में संभावित redox विनियमित प्रोटीन की जांच में इस्तेमाल किया जा सकता है. ICAT लेबलिंग और दो ​​12 नमूनों की तुलना की अनुमति देता है. दोनों तरीकों मुक्त cysteines लेबल और quantific प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है10,12 समझना. हालांकि, cysTMT विधि प्रयोगात्मक विभिन्नता में कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 10 बहुसंकेतन के लिए अनुमति देता है. टैग की संख्या में उपलब्ध के शोधकर्ताओं प्रतिकृति या उनके प्रयोगात्मक डिजाइन में कई नमूने शामिल करने के लिए अनुमति देता है. अधिक नमूनों के बाद पहचान प्रोटीन के एक उच्च संख्या के लिए क्षमता प्रदान करता है. CysTMT तकनीक का एक बड़ा नुकसान है कि यह लेबल पेप्टाइड्स (6.5-6.6) cysTMT के लिए चयनात्मक संवर्धन कदम की वजह से प्रोटीन की पहचान की समग्र गुणवत्ता से समझौता है. प्रोटीन की पहचान के लिए पेप्टाइड्स की संख्या प्रोटीन अनुक्रम में सिस्टीन अवशेषों की संख्या पर काफी हद तक निर्भर करता है. संवर्धन से पहले मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन की पहचान के लिए का हिस्सा tryptic नमूना प्रस्तुत करने के द्वारा इस समस्या को दूर किया जा सकता है.

प्रयोगात्मक डिजाइन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लेबल तंत्र कि cysTMT विधि का इस्तेमाल प्रकृति के कारण, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं. जबकि प्रोटीन preci प्रदर्शनpitation और गोली धोने (3.9) प्रोटीन गिरावट को कम करने के लिए बर्फ पर ठंडा नमूने रखने के लिए महत्वपूर्ण है. CysTMT लेबलिंग के दौरान कम करने अभिकर्मक (4.6) को हटाने के महत्वपूर्ण है क्योंकि नमूने रिवर्स लेबलिंग से गुजरना सकता है. रिवर्स लेबलिंग संभव है अगर अभिकर्मक को कम करने के नमूने में रहता है. यदि नमूने लेबलिंग के बाद कम कर रहे हैं, cysTMT टैग हटाया जा सकता है. एक बार लेबल नमूने के लिए जोड़ रहे हैं, पीएच स्तर (4.7) की जाँच की जानी चाहिए ताकि इष्टतम लेबलिंग दक्षता है. इसके अलावा, डेटा विश्लेषण क्या शोधकर्ता और प्रोटोकॉल का उपयोग कर में अंतिम लक्ष्य के लिए जरूरी है पर निर्भर है. यह भी इस्तेमाल किया जा रहा है के रूप में प्रत्येक सॉफ्टवेयर विभिन्न एल्गोरिदम सॉफ्टवेयर पर निर्भर है.

टमाटर में प्रतिक्रियाशील oxidative प्रजातियों में से बढ़ाया उत्पादन के लिए एक elicitor के रूप में यह प्रयोग रोगज़नक़ का इस्तेमाल, तथापि, अन्य redox विनियमित प्रतिक्रियाओं के अनुसार मापा जा सकता है. इस प्रयोगात्मक डिजाइन अन्य संयंत्र और जानवर सिस्टम के लिए अनुकूलनीय है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों लिए DC3000 तनाव, टमाटर के बीज, और सलाह प्रदान करने के लिए डा. ग्रेग मार्टिन (कार्नेल विश्वविद्यालय) और उनके समूह को धन्यवाद देना चाहूंगा. उन्होंने यह भी करने के लिए धन्यवाद डा. Zhonglin थपका और UF विधि विकास में सहायता के लिए जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के लिए अंतःविषय केंद्र पर प्रोटिओमिक्स डिवीजन प्रोटोकॉल के साथ मदद के लिए समझौता ज्ञापन करना चाहते हैं. प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल Hurkman और तनाका 16 से संशोधित किया गया था. 6 cysTMT लेबलिंग, 4 कदम पर प्रोटोकॉल मूल पियर्स थर्मो फिशर साइंटिफिक 17 पुस्तिका उत्पाद पर आधारित अनुकूलित किया गया. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (MCB 0,818,051 एस चेन के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MetroMix 500 BWI Companies TX-500
3,3'-Diaminobenzidine Sigma-Aldrich D8001
ReadyPrep Sequential Extraction kit Reagent 3 Bio-Rad 163-2104
CB-X protein assay Geno Technology 786-12x
cysTMT reagents Thermo Scientific Pierce Protein Research Products 90071
Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250 stain) Bio-Rad 161-0786
Microcon 3KD column EMD Millipore 42403
Immobilized Anti-TMT resin Thermo Scientific Pierce Protein Research Products 90076
Centrifuge column Thermo Scientific Pierce Protein Research Products 89896
Proteopep II C18 column New Objective PFC7515-PP2-10
NanoLC-1D HPLC AB Sciex 90389
LTQ Orbitrap XL Thermo Fisher Scientific, Inc. 0020137580
SpeedVac Labconco Corp. 7812013
Proteome Discoverer 1.2 software Thermo Scientific Pierce Protein Research Products
Trypsin Promega Corp. V5111
Oakridge Centrifuge Tube Thermo Scientific Nalgene Company 3139-0050
Microcentrifuge tube (2ml) USA Scientific, Inc. 1620-2700
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1043
Top of Form >Bio-Safe Coomassie StainBottom of Form Bio-Rad 161-0786
TMT enrichment kit Thermo Scientific Pierce Protein Research Products 90077

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References

  1. Almeida, N. F. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).
  2. Preiter, K. Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000. J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).
  3. Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction. Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).
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जेनेटिक्स 61 अंक, सिस्टीन-प्रतिक्रियाशील अग्रानुक्रम मास टैग (cysTMT) LTQ - Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमेट्री
Thiol redox आइसोटोप टैगिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री proteome रूपरेखा
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Parker, J., Zhu, N., Zhu, M., Chen,More

Parker, J., Zhu, N., Zhu, M., Chen, S. Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (61), e3766, doi:10.3791/3766 (2012).

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