Summary
꼬리 - 서스펜션 시험은 마우스에서 약물 치료의 약은 효능을 평가하기위한 실험 절차로 검증됩니다. 생쥐 6 분 동안 자신의 꼬리에 의해 중단되고 탈출 관련 동작이 평가됩니다. 우리는 꼬리 정지 테스트를 수행에 사용되는 절차를 설명합니다.
Abstract
꼬리 - 서스펜션 테스트는 잠재적인 약은 약물 검사에 유용 마우스 동작 테스트하고, 우울증과 관련된 행동에 영향을 미칠 것으로 예상되는 다른 조작의 평가. 생쥐가 탈출하거나 가까운 표면에 물을 수 없습니다 것과 같은 위치에, 테이프 자신의 꼬리에 의해 중지됩니다. 이 테스트가 진행되는 동안, 일반적으로 기간이 여섯 분, 결과 지향적인 탈출 동작 계량입니다. 꼬리 - 서스펜션 테스트 예비 약은 화합물의 높은 처리량 검사를위한 약물 발견에 유용한 도구입니다. 여기, 우리가 발생할 수 있으며이를 방지하는 방법 잠재적인 문제에 대한 자세한 중심으로이 테스트의 구현에 필요한 세부 정보를 설명합니다. 우리는 또한 널리 사용되는 C57BL / 6로 꼬리 등산 문제에 대한 해결책, 일부 마우스 변종이 테스트 쓸모없는 렌더링 일반적인 문제를 제공합니다. 특히, 우리는 작은 플라스틱을 통해 마우스 꼬리를 통과하여 꼬리 등반 행위를 방지이전 중지 실린더. 마지막으로, 우리는 자세히 어떻게 수동으로 테스트에 나타나신있는 동작을 점수.
Protocol
1. 자료
1. 서스펜션 상자
꼬리 - 서스펜션 테스트 (TST)는 자신의 꼬리로 지상 정지 쥐를을 포함한다. 가장 기본적인 수준에서 프로 시저는 서스펜션 바 또는 진열 선반, 그리고 테이프가 필요합니다. 그러나 실험자 최적의 명암을 제공하는 배경의 사용을 고려해야합니다. 또한, 그것은 테스트중인 다른 동물을 관찰에서 마우스를 방지하기 위해 조치를 취할 신중한 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는 크기 (55 X 높이 60 X 폭 11.5 cm 깊이)과 플라스틱으로 만들어진 특별히 제조 꼬리 서스펜션 상자 (4 시간 일, 볼티모어 MD)를 사용합니다. 서로를 관찰하거나 상호 작용하는 동물을 방지하기 위해, 각각의 마우스는 자체적으로 세 벽으로 둘러싸인 직사각형 구획 (55 X 높이 15 X 폭 11.5 cm 깊이) 내에 일시 중지되었습니다. 마우스가이 구역의 중간에 중단하고 너비와 깊이 마우스 공동 안 수 있도록 충분히 크기뿐입니다벽 ntact. 이 설정에서 마우스의 코 및 장치 층 사이의 대략적인 거리는 20~25cm 있습니다. 우리는 한 번에 4 마우스를 테스트 수 있도록 장치에서 네번이나 같은 동일한 구획이있다. 각 마우스의 꼬리를 중단하는 데 사용되는 알루미늄 서스펜션 바 (1cm. 높이 X 1cm. 너비 X 60cm. 길이), 상자의 상단에 위치합니다. 우리 연구실에서 사용하는 크기는 일반적인 기준으로 간주되어야합니다. 예를 들어, 꼬리 - 중지 상자의 각 구획의 크기가 큰 outbred 마우스 변형이 (예 : CD - 1)를 사용하는 경우 증가 수 있습니다.
각 구역의 하단에서 우리는 동물의 대변 또는 소변을 수집 분리형 알루미늄 트레이를 놓습니다. 우리는 흰둥이 동물 어두운 회색 상자 및 기타 코트 색상의 마우스를위한 크림 색상 상자를 사용합니다. 이 협정은 우리에게 더 나은 명암과 시험 그러므로 더욱 안정적인 행동 점수를 제공합니다.
2. 테이프
3. 타이머
4. 비디오 녹화 장치
비디오 카메라와 삼각대 (또는 기타 지원 구조) 필요합니다. 이 검사는 일반적으로 동시에 테스트하고 여러 동물과 관련된 때문에, 라이브 점수는 어려울 것이며, 권고하지 않습니다. 비디오 카메라는 하이에 기록한다행동 채점을 위해 나중에 사용됩니다 품질의 사진을 렌더링하기 위해 GH 충분한 해상도. 항상 시험을 시작하기 전에 카메라의 충분한 기록 메모리가있다는 것을 확신합니다. 우리는 비디오 전송을위한 간단한 수 있도록 물리적인 매체 (즉, 비디오 카세트)를 사용하지 않고 디지털로 기록하는 비디오 카메라를 사용합니다.
5. 화이트 노이즈 생성기
소음 발생기는 간헐 환경 소리를 마스크한다. 소음 발생기의 사용은 특히 갑자기 큰 소리가 잠재적으로 쥐를 놀라게한다고 들었 수 실험실 환경에서 권장합니다. 우리의 실험 공간에서 주위 소음 수준 (작동 백색 잡음 발생기 제외) 60dB 주변입니다. TST가 실시되는 위치에 활성화된 백색 잡음 발생기와 함께 전체 사운드 수준은 70-72dB 있습니다. 그러나 이러한 수치는 예를 들어 전용으로 제공하는 것을인지해야하고, 각 연구실을 선택합니다그들의 독특한 환경과 상황에 따라 바로 소음.
6. 물품을 세척
서스펜션 상자는 살균 용액 (예 : 메가바이트 - 10, 경구 연구소 주식 회사, 윌밍턴, DE, 또는 이와 유사한 것) 각 세션 후에는 철저하게 닦아해야합니다.
7. Climbstoppers (옵션 : 변형에 의존 사용)
이러한 C57BL / 6와 같은 배경의 마우스는 시험 일 동안 자신의 꼬리를 올라갈 수 있습니다. 폴리 카보 네이트 튜브에서 사cm 길이 (FourHourDay Inc의 볼티모어 MD에 의해) (# 8585K41, McMaster - 카, 산타페 스프링스 버렸어요 지우기 중공 실린더 (4cm 길이, 직경 외부 1.6 cm, 직경 내부 1.3 cm, 1.5 g) , CA)는 동작 2,3를 등반과 같은 꼬리를 방지하기 위해 생쥐의 꼬리 주위에 배치됩니다. 이러한 장치는 일반적인 도구와 자료가있는 모든 실험실에서 만들 수 있습니다.
2. 행동 절차
- 위치에 카메라를 배치합니다. 카메라는 동물의 가능한 가장 높은 해상도를 얻기 위해서는 최대한하여야한다.
- 세션 중에 사용됩니다 테이프 조각은 절단 표시, 세션에 대한 준비를해야합니다.
- 사용중인 경우에는 생쥐가 테스트 룸으로 도입되기 전에, 백색 잡음 발전기를 시작합니다. 백색 소음의 수준은 외부 소음을 마스크로 충분합니다. 높은 볼륨을 방지하고 백색 잡음 같은 수준의 모든 동물에 사용됩니다 있는지 확인하십시오.
- 가져와테스트 룸에 imals. 동물이있는 룸과 테스팅 룸 비슷한 주변 조건에 서로 인접해있는 경우에는 acclimation 기간이 필요하지 않을 수 있습니다. 그렇지 않으면, acclimation의 기간 (일반적으로 최소한 1 시간)에 대한 테스트 룸에 동물을 배치. 같은 방에 배치 다른 동물들이 후각과 초음파 단서를 느낄 수있다는 점에 유의하십시오.
- 이러한 C57BL6 / J로 자신의 꼬리를 등반 알려진 변형은 테이프를 적용하기 전에 꼬리 주변 장소 Climbstoppers를 사용중인 경우.
- 생쥐의 꼬리에 테이프를 준수합니다. 테이프의 끝을 표시를 사용하여 테이프가 꼬리 다시 자체에 막대기 있는지 확인하십시오. 테이프는 테이프 이외의 나머지 꼬리 2-3mm와 꼬리의 끝까지 적용해야합니다.
- 일단 테이프의 각 조각은 새장의 내부 벽에 테이프의 중간 부분을 스틱 마우스 꼬리에 첨부되어 있습니다. 이것은 서로 테이프 조각 일의 방지 도움이 될 것입니다. 참고 C이 방식으로 onfinement은 스트레스의 원인과 가능한 한 빨리 각 동물에 테이프를 신청 절차를 완료하는 것이 중요합니다 것이 있습니다.
- 모든 테이프가 적용되면, 녹음을 시작하고 생쥐가 중단되기 전에 세션을 식별합니다.
- 치료 그룹 사이에 counterbalanced하는 순서로 중지 표시줄이나 선반에있는 테이프의 무료 끝에 배치하여 동물을 일시 중지합니다. 전체 TST 세션이 점수와 카메라가 그 시간 동안 행동을 평가하기 위해 무능력으로 이어질 것입니다 방해되기 때문에 카메라보기를 방해하지 않는 방식으로 마우스를 일시 중지합니다. 모든 테이프 끝을 각 마우스 게으름과 비슷한 길이로 정지 표시줄이나 선반에 평행하게 걸려 있는지 확인합니다.
- 세션 (어떤은 일반적으로 육분이다)의 끝 부분에, 그들의 homecage으로 동물을 반환하고 조심스럽게 부드럽게 밀어하여 각 꼬리에서 테이프를 제거합니다. 이렇게하면 마이크에 통증을 일으킬 수 있으므로 꼬리에서 테이프를 벗겨하지 마십시오E.
- 그들의 식민지 실에 생쥐를 반환 후 컬렉션 트레이에서 배설물 boli과 소변을 버리고 살균 솔루션 기기를 닦아냅니다.
3. 행동 분석
- 일반적으로, TST는 길이 6 분 처음부터 끝까지됩니다. 다른 널리 사용되는 약은 효능 절차와는 달리, 강제 수영 시험은 전체 세션이 채점됩니다. 이것은 생쥐 이전 TST에 매니 페스트 부동하는 경향이있다 면요 일반 때문입니다.
- 저희 연구실에서는 카메라에서 분석이 실시하는 PC에 직접 동영상 파일을 업로드하십시오.
- 휴대가 측정 각 마우스가 지출되는 시간이 행동 분석하는 동안. 그것이 직접 부동 시간을 측정 가능하지만, 우리는 쉽게 오히려 그러한 움직임의 부족보다 적극적인 움직임을 감지하고 측정 발견했다.
- TST 행동 분석의 가장 중요한 부분은 운동의 일관성을 확인합니다타고난 이동성으로 기록됩니다의. 특히 세션의 시작 부분에서 마우스,, 명백히 탈출과 관련된 매니 페스트 동작. 이것은 장치의 벽과 서스펜션 바, 신체의 강한 흔들림, 그리고 실행 유사한 사지의 움직임에 도달하기 위해 노력하고 있습니다. 이러한 움직임이 명확하게 이동성을 구성합니다. 그리고 이러한 행동 가시고이 subtler된다. 앞 다리에 국한되지만 뒷다리의 참여없이 이동성으로 계산되지 않습니다 연구실 작은 움직임에서. 또한, 추진력에 의한 아르 그네처럼 oscillations과 진자가 이전 이동성 관찰하는 동안 얻은 또한 이동성으로 계산되지 않습니다.
- 저희 연구실에서는 시간 측정을위한 화면 스톱워치 소프트웨어 (Xnote 스톱워치, dnSoft 연구 그룹)을 사용합니다. 두 개의 스톱워치는 화면에 사용됩니다. 때 행동 분석 기간이 끝나는 첫 번째 스톱워치가 다운 360초 및 경고에서 관찰자로 계산됩니다. 두 번째 sto시간이 모바일 보낸 관찰자 - 조치하여 pwatch 제어. 특정 스톱워치 소프트웨어는 화면에 키보드 스톱워치를 제어할 수 있도록 기능을 시작하고 중지 키를 할당할 수있는 능력이 있습니다. 대신 일반 키보드의, 우리는 일반적으로 스톱워치를 제어하는 'gamepad'로 알려진 입력 장치를 사용합니다.
- 화면에 테스트와 현재 하나 이상의 마우스가있다면 그것은 그들의 움직임은 관찰자주의를 분산되지 않도록하는 다른 동물을 커버하는 것이 좋습니다. 이것은 다른 프로그램 윈도우를 사용하거나 물리적으로 종이로 화면에 다른 생쥐를 덮고하여 수행할 수 있습니다.
- 특정 마우스에 대한 경과 이동성 시간의 총 금액이 사전에 분석 세션의 완성을 볼 수있다면 현상 바이어스가있을 수 있습니다. 화면에 스톱워치를 사용하는 경우, 우리 모두가지만, 스톱워치의 밀리초 소수 커버하는 것이 좋습니다. 스톱워치를 덮고함으로써 관찰자는 스톱워치가 있는지 여부를 알고하지만 켜거나 어떤 시점에서 총 시간이 어떤 편견에 의해 경과 따라서 영향을받을 수 없습니다 몰라요. 이 방법에게 관찰자를 사용하여 동물의 그룹 과제에 장님이 동안, 각 동물의 이동성의 수준에 대한 일반적인 생각을 가지고 있지 않을거야.
- 시험 동물에서 데이터를 수집하기 시작하기 전에 interobserver 신뢰성 시험은 모든 새 관찰자에 대해 실시한다. 그 또는 그녀가 채점하는 동안 저희 연구실에서는 각각의 새로운 관찰자 먼저 경험 관찰자을 감시합니다. 새로운 관측은 부동의 이동성을 차별화하는 데 충분한 자신감을 얻을 수 후에, 그들은 다음 경험 관찰자가 관찰하고 실수를 지적과 함께 실시간으로 점수. 이 단계가 성공적으로 완료되면, 새로운 관측은 우리가 훈련을 위해 저희 연구실에서 관리하는 TST 동영상의 특정 집합을 분석합니다. interobserver 상관의 높은 수준은 경험이 풍부한 관찰자로 얻은 후에만 조사는 실제에서 TST 동영상을 분석 않습니다실험. 우리는 보관이 훈련 분석의 데이터는 실험실에 대한 내부 기준을 구성합니다. 우리는 그들 (그리고 부동) 동작을 이동성을 표현하고, 남녀 사이의 부동 시간을 의미있는 방식으로 변종 사이의 차이를 관찰했습니다. 새로운 변형, 성별, 또는 유전자 조작 마우스 모델 실험실에서 테스트하는 경우는 다시 신뢰성 분석의 유형을 실시하는 것이 필요합니다.
4. 대표 결과
우리는 다양한 마우스 종자의 리튬 치료 (그림 1) 3 약은 같은 반응을 평가할 수있는 TST를 사용했습니다. 본 실험의 실험 자세한 내용은 수 외. 2011 년 3 출판하고 있습니다.
그림 1. 오 근친 마우스 종자의 만성 리튬 관리 후 꼬리 정지 테스트에서 부동 시간. 쥐 그룹 집에 있었다D, 케이지 당 4 개의 쥐. 리튬 치료 그룹의 마우스는 리튬 차우 세 주 4g / kg LiCl을 포함 받았습니다. 컨트롤 동물은 염화 리튬없이 동일한 음식을 받았다. ** : P <0.01, *** : P <0.001이 중요한, unpaired t - 테스트를 상징. 데이터는 ± SEM 의미로 표현됩니다. 각 변형에 대한 그룹당 n은 :10 - 12 동물. (그림 3에서 재현).
이 예제에서는 음식 배달 만성 리튬의 상당한 치료 효과는 C57BL/6J과 DBA/2J 종자에서 관찰됩니다. 다른 세 변종에서 부동 시간에 통계적으로 의미있는 감소는 관찰되지 않았습니다. 이 데이터는 또한 다른 약은 의약품 4-8로 관찰되어 같은 만성 리튬 치료 약은 같은 반응에 의존 변형임을 나타냅니다.
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Discussion
Steru 외 의해 TST의 개발. 9 이전에 개발된 강제 수영 시험 10-12 영향을 받았습니다. TST 생쥐의 강제 수영 테스트와 마찬가지로이 피할 수 있지만 적당히 스트레스 상황에 배치됩니다. 탈출과 관련된 행동의 부족은 부동 간주됩니다. 강제 수영 시험과 마찬가지로, TST는 최고의 마약 약은 효능 평가를위한 검증 시험입니다,뿐만 아니라 환경, 신경 생물학 및 유전자 조작 13-18의 효과를 평가하는 데 사용됩니다. 강제 수영 테스트와는 달리, TST에 물 19 잠수로 인해 저체온증의 위험이 없습니다. 경험은 강제 수영 테스트와 TST 비슷한 주역 facie하는 동안, 그들의 감성과 성능의 여러 중요한 차이가있다는 것을 염두에 두어야 한 검사의 결과는 반드시 다른 복제되지 않을 수 있습니다. 차이점 B의 훌륭한 설명을 보려면etween이 두 테스트는 다음과 같은 참조 4,20,21를 참조하십시오. 대부분의 항우울제가 환자의 임상 상당한 효과를 발휘하려면 몇주는 걸릴지만, 항우울제들은 TST의 효과와 강제 수영 시험 모두 다음과 같은 급성 및 만성 치료 20,22,23을 견딜수 있습니다. 단, 만성 치료에 일반적으로 구분 생쥐의 약은 같은 효과를 평가하는 데 사용되는 다른 많은 행동 테스트가 없습니다. 이들은 만성 스트레스를 예측할 수 24, 사회 패배 스트레스 25, 그리고 참신 26 수유 탄압을 포함합니다.
작은 풋프린트, 낮은 비용과 설치의 용이성 상대뿐만 아니라, TST의 데이터 수집의 자동화도 9,27,28 가능합니다. 자동화를위한 두 가지 접근 방식은 전기 기계 측정 시스템 및 비디오 분석입니다. 전기 기계 방식에서 동물은 스트레인 게이지에서 정지하고 동물의 움직임 (예 : M을 측정에드 어소 시에이츠 Inc의, 세인트 Albans, VT, 하버드 장치, Holliston, MA). 또 다른 방법은 TST 비디오 레코딩 (; Cleversys 주식 회사, 레스 턴, VA 예 Noldus 주식 회사, 네덜란드)의 소프트웨어 기반의 분석이다. 적용된 매개 변수가 각각의 새 마우스 모델 또는 변형율에 맞게 변경해야하며 그 결과는 품질 관리 목적을 위해 인간의 관찰자에 의해 검증되어야합니다 이후 그러나, 심지어는 자동화와 인간의 개입은 여전히 필요합니다.
TST와 함께 특별한 관심을 받아야 하나의 영속 문제는 일부 생쥐의 꼬리 등반 행동, 특히 일반적으로 사용되는 C57BL / 6 변형 1,20입니다. 이 동물에 대한 도달 자신의 꼬리를 향해 등반 성향이 있습니다. 성공적으로 자신의 꼬리를 오르 마우스는 탈출이 가능하다는 것을 배웠습니다. 이러한 생쥐 따라서 필요한 생쥐의 수를 증가하고 절차의 안정성을 감소 분석에서 제외해야합니다. C57BL / 6 마우스 스트레인가 가장 C는 사실신경 생물학 및 유전자 연구에 사용되는 ommon 변형이 문제의 영향을 exacerbates. 본 논문에서는 우리 연구실 2,3에서 개발 꼬리 등반 동작에 대한 솔루션을 자세한. 꼬리 등반 동작을 방지하기 위해, 우리는 생쥐의 꼬리 기지 주변 중공 실린더를 놓습니다. 마우스는 이러한 실린더에 잡아 놓을 수없고, 따라서 자신의 꼬리를 올라갈 수 없습니다. 우리는이 방법 2,3를 사용하는 경우에는 쥐가 자신의 꼬리를 올랐다없는 것을 관찰했습니다. 또한, 우리는 리튬의 약은 같은 효과들을 3 사용할 때 여전히 존재하는, 실린더 29 이러한 유형 않고 TST 이전에 보고된 것으로 나타났습니다.
그것은 자신의 꼬리로 자신의 무게를 지탱하기 위해이 동물들을 위해 잠재적으로 고통스러운되기 때문에 이것은, TST가 같은 쥐 같은 설치류 동물 무거운하지 않는 것이 좋습니다 있다고 지적한다. 이와 마찬가지로,주의가 비정상적으로 큰 생쥐 (예 : 마우스가 함께 사용 복용해야모델링 비만), 이러한 경우에 경험은 그것이 전반적인 활동 수준에 영향을 미칠 수있는 조작 가능성이 가짜 결론으로 이어지는 TST의 이동성을 변경할 수 염두에 보관해야하는 강제 수영 시험 10 대체 시험을 볼 것입니다. 이 때문에 같은 오픈 필드 테스트 30 생쥐의 전반적인 활동 수준을 측정하는 별도의 동작 테스트와 TST의 결과를 확인하는 것이 중요합니다.
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Disclosures
저자 관심에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 부여 NIHM R01 MH091816과 TDG에 R21 MH084043에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tape | |||
| Timer | |||
| Video Camera | |||
| White Noise Generator (optional) | |||
| Climbstoppers (optional; depending upon strain used) |
References
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