Halen Opslæmningsprøve

Summary

Halen-suspension test er valideret som en eksperimentel procedure for at vurdere antidepressiv effekt af medicinsk behandling hos mus. Mus er suspenderet af deres haler i seks minutter og flygte-adfærd vurderes. Vi beskriver procedurer, der anvendes på at føre den halen suspension test.

Abstract

Halen-suspensionsprøvning er en mus adfærdsmæssige test nyttige i screening af potentielle antidepressive lægemidler, og vurdering af andre manipulationer, som forventes at påvirke depression adfærd. Mus er suspenderet fra deres haler med tape, i en sådan position, at det ikke kan undslippe eller holde på nærliggende overflader. Under denne test, seks minutters varighed typisk er den resulterende undslippe orienterede adfærd kvantificeret. Halen-suspensionsprøvning er et værdifuldt redskab inden for lægemiddelforskning for high-throughput screening af potentielle antidepressive stoffer. Her beskriver vi de oplysninger, der kræves for gennemførelsen af ​​denne test med ekstra fokus på potentielle problemer, der måtte opstå, og hvordan man kan undgå dem. Vi tilbyder også en løsning på halen klatring adfærd, et fælles problem, der gør denne test ubrugelig i nogle mus stammer, såsom den meget brugte C57BL / 6. Konkret vi forhindre hale klatring adfærd ved at føre musen halen gennem et lille plasticcylinder før suspensionen. Endelig vil vi beskrive, hvordan du manuelt score den adfærd, der er manifesteret i denne test.

Protocol

1. Materialer

1. Suspension Box

Halen-suspension test (TST) medfører suspension mus over jorden ved deres haler. På det mest grundlæggende niveau, kun den procedure kræver en suspension bar eller hylde afsats, og tape. Dog bør forsøgslederen overveje brugen af ​​en baggrund, der giver optimal kontrast. Desuden er det fornuftigt at tage skridt til at forhindre mus i at observere andre dyr, der bliver testet. I vores laboratorium, bruger vi specielt fremstillet hale suspension bokse (Fire timers arbejdsdag, Baltimore MD), lavet af plastik med de dimensioner (55 højde x 60 Bredde x 11,5 cm dybde). For at forhindre dyrene i at observere og interagere med hinanden, er hver mus ophængt i sine egne tre-walled rektangulære rum (55 højde X 15 bredde x 11,5 cm dybde). Musen er udsat i midten af ​​dette rum, og den bredde og dybde er tilstrækkelig størrelse, så musen kan ikke gøre samarbejdetntact med væggene. I denne indstilling, er den omtrentlige afstand mellem musens næse og apparatet gulvet 20-25 cm. Der er fire sådanne identiske rum i apparatet giver os mulighed for at teste fire mus ad gangen. En aluminium suspension bar (1 cm. Højde x 1 cm. Bredde x 60 cm. Længde), der anvendes til at suspendere halen af ​​hver mus, er placeret på toppen af ​​kassen. De dimensioner, som vi bruger i vores laboratorium bør betragtes som en generel reference. For eksempel kan størrelsen af ​​de enkelte rum i halen-suspension box øges, hvis en stor udavl musestamme (fx CD-1) anvendes.

I bunden af ​​hvert rum placerer vi en aftagelig alu bakke, der opsamler afføring eller urin fra dyrene. Vi bruger en mørk grå boks til albinoer og en creme farvet boks for mus af andre pelsfarver. Dette arrangement giver os bedre kontrast og derfor mere pålidelige adfærdsmæssige scoring af testen.

2. Tape

3. Timer

4. Videooptagelse enhed

En video kamera og et stativ (eller anden støtte struktur) er nødvendige. Da denne test som regel involverer flere dyr bliver testet på samme tid, vil leve scoring være vanskelig og kan ikke tilrådes. Videokameraet skal optage i high nok opløsning til at gøre en kvalitet billede, der vil blive brugt senere til adfærdsmæssige scoring. Vær altid sikker på, at der er tilstrækkelig optager hukommelse i kameraet, før du starter testen. Vi bruger et videokamera, der optager digitalt uden brug af fysiske medier (dvs. videokassette), der giver mulighed for enkel overførsel af videoer.

5. Hvid støj generator

Den støj generator skal maske intermitterende miljømæssige lyde. Brugen af ​​en støj generator anbefales især i laboratoriet miljøer, hvor pludselige høje lyde kan høres, som potentielt startle mus. I vores eksperimentelle rum Støjen fra omgivelserne (uden den hvide støj aktiveret generator) er omkring 60 dB. Den samlede lydniveau med hvid støj generator aktiveres på det sted, hvor TST drives på, er 70-72 dB. Dog skal det bemærkes, at disse tal er angivet som eksempel alene, og hvert laboratorium skal vælgehøjre støjniveau i henhold til deres unikke omgivelser og omstændigheder.

6. Rengøringsmateriel

Suspensionen kassen skal tørres grundigt efter hver session med sterilisering opløsning (fx MB-10, quip Laboratories Inc., Wilmington, DE, eller lignende).

7. Climbstoppers (ekstraudstyr: afhængig af virusstamme, der anvendes)

Mus af nogle baggrunde, som f.eks C57BL / 6, kan klatre deres haler under testen ^1. Klar hule cylindre (4 cm længde, 1,6 cm ydre diameter, 1,3 cm indvendig diameter, 1,5 gram), som er skåret til fire cm længde (ved FourHourDay Inc, Baltimore MD) fra polycarbonat slange (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs , Californien) er placeret rundt om halen af mus for at forhindre en sådan hale klatring adfærd ^2,3. Disse enheder kan gøres på alle laboratorier med fælles værktøjer og materialer.

2. Behavioral Procedurer

1. Anbring kameraet i stilling. Kameraet skal være så tæt som muligt for at opnå den højest mulige opløsning af dyrene.
2. Tape fragmenter, der vil blive anvendt under sessionen skal skæres, mærket, og forberedt til sessionen.
3. Start hvid støj generator, hvis det bliver brugt, før den mus er introduceret til testning værelse. Niveauet af hvid støj bør kun være nok til at maskere eksterne lyde. Undgå en stor mængde, og sørg for samme niveau af hvid støj bruges til alle dyr.
4. Bring enimals ind i test værelse. Hvis det rum, hvor dyrene bor og afprøvning rum støder op til hinanden med lignende omgivende forhold, må der ikke akklimatiseringsperiode være nødvendig. Ellers placere dyrene i testen plads til en periode på akklimatisering (generelt mindst én time). Vær opmærksom på, at de andre dyr placeret i samme rum kan fornemme olfaktoriske og ultralyd signaler.
5. Hvis en stamme kendt for at klatre deres haler, som f.eks C57BL6 / J, der bliver brugt plads Climbstoppers omkring haler forud for anvendelsen af ​​båndet.
6. Overhold båndet til haler af mus. Brug den markerede slutningen af ​​båndet, og sørg for båndet klæber til halen og tilbage på sig selv. Båndet bør anvendes til den bitre ende af halen med 2-3 millimeter af halen resterende uden for båndet.
7. Når hvert stykke tape er knyttet til en mus hale stick den midterste del af båndet til den indvendige vægge af buret. Dette vil hjælpe med at forhindre sammenfiltring af tape stykker til hinanden. Bemærk, at Confinement på denne måde kan medføre stress, og at det er vigtigt at fuldføre processen for at anvende båndet til hvert enkelt dyr så hurtigt som muligt.
8. Når alle bånd anvendes, skal du starte optagelsen og identificere sessionen, før mus er suspenderet.
9. Hæng dyrene ved at placere den frie ende af båndet om suspension baren eller på en hylde i en rækkefølge, der modsvares mellem behandlingsgrupperne. Suspend mus på en måde, der ikke forhindrer kameraet se, fordi hele TST session vil blive scoret, og blokerer for kameraet vil føre til manglende evne til at bedømme adfærd i løbet af denne tid. Kontrollér, at alle bånd ender hænger parallelt til suspension bar eller hylde med en lignende længde slack for hver mus.
10. I slutningen af ​​sessionen (som er typisk seks minutter), tilbagesende dyrene til deres homecage og fjern forsigtigt tapen fra hver hale ved forsigtigt at trække det ud. Du må ikke flå tapen fra hale, da dette kan forårsage smerte til MIC-e.
11. Efter at returnere mus til deres koloni værelse kassere fecal Boli og urin fra samlingen bakker og tør apparat med en steriliserende løsning.

3. Behavior Analysis

1. Generelt er TST er fra start til slut seks minutter i længden. I modsætning til en anden udbredt antidepressiv effekt procedure, tvungen svømme testen er hele sessionen scoret. Dette skyldes den generelle konstatering af, at mus har tendens til at manifestere stilstand tidligere i TST.
2. I vores laboratorium har vi uploade video filer direkte fra kameraet til en PC, hvor analysen er foretaget.
3. Under adfærdsanalyse den tid, som hver enkelt mus bruger som mobile måles. Selv om det er muligt at måle immobilitet tid direkte, har vi fundet det lettere at opdage og måle aktive bevægelser snarere end mangel på sådanne bevægelser.
4. Det vigtigste aspekt af TST adfærdsanalyse er konsekvent identifikation af bevægelses, der er registreret som bona fide-mobilitet. Mus, især i begyndelsen af ​​sessionen, manifestere adfærd, der er åbenlyst undslippe relaterede. Disse omfatter forsøg på at nå væggene af apparatet og suspensionen baren, stærke rystelser af kroppen, og bevægelse af lemmerne beslægtet med at køre. Disse bevægelser udgør klart mobilitet. Disse adfærdsmønstre derefter aftager og bliver hårfin. I vores laboratorium små bevægelser, der er begrænset til de forreste ben, men uden inddragelse af bagbenene tælles ikke som mobilitet. Derudover svingninger og pendul som gynger, der skyldes, at momentum er opnået gennem tidligere mobilitet bouts også tælles ikke som mobilitet.
5. I vores laboratorium bruger vi en on-screen stopur software til tid målinger (XNote Stopur, dnSoft Research Group). To separate stopure bruges på skærmen. Den første Stopuret tæller ned fra 360 sekunder, og alarmerer observatør, når det adfærdsmæssige analyserede periode slutter. Den anden stopwatch-kontrolleret af observatør-måler den tid, der bruges mobilt. Visse stopur software har mulighed for at tildele taster til at starte og stoppe funktioner, så der på skærmen, tastaturet kan styre stopuret. I stedet for en almindelig tastatur, bruger vi en input-enhed almindeligt kendt som en "gamepad" til at styre stopure.
6. Hvis der er mere end én mus testet og til stede på skærmen, er det en god idé at dække de andre dyr, så deres bevægelser vil ikke distrahere observatør. Dette kan opnås ved at bruge et andet program vindue eller ved fysisk at dække de andre mus på skærmen med papir.
7. Der kan være en vis skævhed opstår, hvis den samlede mobilitet er gået lang tid for en bestemt mus er synlig inden afslutningen af ​​analysen session. Hvis en on-screen stopuret bruges, foreslår vi at dække alle, men det millisekund decimaler af stopuret. Ved at dække stopuret observatøren kun ved, om stopuret ertændt eller slukket på noget tidspunkt, men kender ikke den samlede tid der er gået og kan derfor ikke blive berørt af eventuelle bias. Brug denne fremgangsmåde observatøren, mens blind til gruppen opgaver af dyrene, vil ikke have en generel idé om omfanget af mobilitet på hvert dyr.
8. En interobserver pålidelighed test bør udføres for hver ny observatør, før du begynder at indsamle data fra forsøgsdyr. I vores laboratorium hver ny observatør første ure en erfaren observatør, mens han eller hun er scoring. Efter den nye observatører får selvtillid nok til at differentiere mobilitet fra immobilitet, de så score i realtid med den erfarne observatør, se og påpege eventuelle fejl. Når denne fase med succes er gennemført, vil den nye observatører analysere et bestemt sæt af TST videoer, som vi opbevarer i vores laboratorium med henblik på uddannelse. Først efter et højt niveau af interobserver sammenhæng er opnået med den erfarne observatør gør en efterforsker analysere TST videoer fra de faktiskeeksperimenter. Vi arkivere data fra disse uddannelse analyser til at udgøre en intern standard for laboratoriet. Vi har observeret forskelle mellem stammer i den måde, som de giver udtryk for mobilitet (og immobilitet) adfærd, og det gennemsnitlige immobilitet tid mellem kønnene. Når en ny stamme, køn, eller genetisk modificerede mus model er testet i laboratoriet, er det nødvendigt igen at påtage sig denne form for pålidelighed analyse.

4. Repræsentative resultater

Vi har brugt TST til at vurdere antidepressiv-lignende reaktioner på lithium behandling i forskellige mus stammer (Figur 1) ^3. Eksperimentel detaljer om dette eksperiment er offentliggjort i Can et al., 2011 ^3.

Figur 1. Immobilitet gang i halen suspensionsprøvning efter kronisk lithium administration i fem indavlede mus stammer. Musene blev gruppen husd, fire mus per bur. Mus i lithium behandling gruppe fik lithium chow indeholder 4 g / kg LiCl i tre uger. Kontrol dyrene modtog identisk fødevare uden tilsætning af lithium chlorid. **: P <0,01, ***: p <0,001 betegne en betydelig, uparret t-test. Data er udtrykt som gennemsnit ± SEM. n :10-12 dyr i hver gruppe til hver enkelt stamme. (Figur gengivet fra ^3).

I dette eksempel er en signifikant behandlingseffekt af kronisk lithium leveret i fødevarer kun observeret i C57BL/6J og DBA/2J stammer. I de øvrige tre stammer, var der ingen statistisk signifikant fald i ubevægelighed tid observeret. Disse data viser, at en antidepressiv-lignende reaktion på kronisk lithium behandling er belastning afhængig som er også blevet observeret med andre antidepressive medikamenter ^4-8.

Discussion

Udvikling af TST ved Steru et al. ⁹ blev påvirket af den tidligere udviklede tvunget svømme test ^10-12. Svarende til det tvungne svømme test, i TST mus er placeret i en uundgåelig, men moderat stressende situation. Mangel på flugt adfærd betragtes som immobilitet. Ligesom tvunget svømme test, er TST en test bedste valideret til vurdering af antidepressive virkning af narkotika, men også bruges til at vurdere virkningerne af miljø-, neurobiologiske og genetiske manipulationer ^13-18. I modsætning til det tvungne svømme test, der i TST ikke er risiko for hypotermi på grund af nedsænkning i vand ^19. Den eksperimentatorer skal huske på, at mens den tvungne svømme testen og TST ligner umiddelbart, er der forskellige vigtige forskelle i deres følsomhed og resultater og resultaterne af en test kan ikke nødvendigvis gentages i den anden. For en glimrende beskrivelse af de forskelle, between disse to tests se følgende referencer ^4,20,21. Selv om de fleste antidepressiva tage uger at øve klinisk signifikant effekt hos patienter, kan antidepressiva udøver deres effekt i TST og tvang svømme teste både efter akut og kronisk behandling ^20,22,23. Men der er mange andre adfærdsmæssige test, der anvendes til at vurdere antidepressiv-lignende effekter i mus, der er generelt følsomme over for kronisk behandling alene. Disse omfatter kronisk uforudsigelige stress ^24, sociale nederlag stress ^25, og nyhedsværdi undertrykt fodring ^26.

Ud over sin lille størrelse, lave omkostninger og relativ nem opsætning, er automatisering af dataindsamling i TST også muligt ^9,27,28. To vigtigste metoder til automatisering er elektro-mekaniske målesystemer og video analyse. I den elektro-mekanisk tilgang, er dyret suspenderet fra en strain gauge og flytninger af dyrene måles (f.eks Med Associates Inc, St. Albans, VT, Harvard Apparater, Holliston, MA). En anden tilgang er software-baseret analyse af TST video-optagelser (f.eks Noldus Inc., Holland, Cleversys Inc., Reston, VA). Men selv med automatisering, vil menneskelig indgriben stadig være nødvendigt, da den anvendte parametre skal justeres for hver ny mus model eller stamme, og resultaterne skal verificeres ved en menneskelig observatør for kvalitetskontrol.

Et vedvarende problem, som fortjener særlig opmærksomhed med TST er halen-klatring opførsel af nogle mus, især de almindeligt brugte C57BL / 6 stamme ^1,20. Disse dyr har en tilbøjelighed i retning af at nå frem til og klatring deres egen hale. Mus, der med held klatre deres haler har lært, at undslippe er muligt. Sådanne mus bør derfor udelukkes fra analysen, hvilket øger antallet af nødvendige mus og nedsætter pålideligheden af ​​proceduren. Den omstændighed, at C57BL / 6 mus stamme er den mest cÆLLES virusstamme, der anvendes i neurobiologisk og genetisk forskning forværrer indflydelse af dette problem. I dette papir, detaljerede vi en løsning på halen-klatring adfærd, som blev udviklet i vores laboratorium ^2,3. For at forhindre halen-klatring adfærd, placerer vi hule cylindre omkring haleroden af ​​mus. Musene kan ikke holde fast i disse flasker og kan derfor ikke klatre deres haler. Vi har observeret, at ingen mus har besteget deres haler, når du bruger denne fremgangsmåde ^2,3. Derudover har vi vist, at antidepressiv-lignende virkning af lithium, rapporterede tidligere i TST, uden at disse typer af cylindre ^29, er stadig til stede, når du bruger dem ^3.

Det skal bemærkes, at TST ikke anbefales til tungere gnavere som rotter, da den potentielt er smertefuldt for disse dyr til at støtte deres vægt kun ved deres haler. Af samme årsag bør der udvises forsigtighed med usædvanligt tunge mus (fx mus anvendt tilmodellering fedme), og i disse tilfælde eksperimentatorer skal kigge efter alternative tests såsom tvang svømme testen ¹⁰ Det bør holdes for øje, at eventuelle manipulationer, der kan påvirke den samlede aktivitet potentielt kan ændre mobilitet i TST, der fører til falske konklusioner. På grund af dette, er det vigtigt at kontrollere resultaterne af TST med separat adfærdsmæssige test, der måler den samlede aktivitet i mus som open-field test ^30.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tape
Timer
Video Camera
White Noise Generator (optional)
Climbstoppers (optional; depending upon strain used)