השעיה זנב מבחן

Summary

המבחן זנב ההשעיה הוא תוקף של הליך ניסיוני כדי להעריך את היעילות של טיפולים תרופתיים נגד דיכאון בעכברים. עכברים מושעים על ידי הזנבות שלהם במשך שש דקות להימלט הקשורות התנהגויות מוערכים. אנו מתארים הליכים המשמשים בביצוע הבדיקה ההשעיה הזנב.

Abstract

המבחן זנב ההשעיה הוא מבחן התנהגותי העכבר שימושי ההקרנה של תרופות נוגדות דיכאון פוטנציאל, והערכת מניפולציות של אחרים, כי הם צפויים להשפיע על התנהגויות הקשורות לדיכאון. עכברים מושעים על ידי זנבותיהם עם הקלטת, במצב כזה זה לא יכול לברוח או להחזיק משטחים סמוכים. במהלך הבדיקה הזו, בדרך כלל שש דקות משך, התנהגויות בריחה כתוצאה אוריינטציה הם לכימות. המבחן זנב ההשעיה היא כלי רב ערך לגילוי סמים להקרנה תפוקה גבוהה של תרכובות נוגדות דיכאון פוטנציאליים. כאן, אנו מתארים את הפרטים הנדרשים ליישום של מבחן זה, עם דגש נוסף על בעיות פוטנציאליות שעלולות להתרחש וכיצד להימנע מהם. אנו מציעים גם פתרון התנהגות הזנב טיפוס, בעיה נפוצה כי מבחן זה הופך חסר תועלת בכמה זנים העכבר, כגון C57BL בשימוש נרחב / 6. באופן ספציפי, אנחנו למנוע התנהגויות טיפוס הזנב על ידי העברת העכבר זנבות דרך פלסטיק קטןגליל לפני ההשעיה. לבסוף, אנו בפירוט כיצד באופן ידני הציון התנהגויות באים לידי ביטוי בבדיקה זו.

Protocol

1. חומרים

1. השעיה Box

המבחן זנב ההשעיה (TST) כרוכה עכברים השעיית מעל פני הקרקע על ידי הזנבות שלהם. ברמה הבסיסית ביותר, ההליך רק דורש בר השעיה או מדף מדף, ועל הקלטת. עם זאת, הניסוי צריך לשקול את השימוש רקע המספק ניגודיות אופטימלית. בנוסף, זה נבון לנקוט צעדים כדי למנוע עכברים מצפייה בבעלי חיים אחרים, כי נבדקות. במעבדה שלנו, אנו משתמשים מיוצרים במיוחד ההשעיה זנב תיבות (ארבע שעות ביום, בולטימור MD), עשוי פלסטיק עם מידות (55 גובה X 60 רוחב X עומק 11.5 ס"מ). כדי למנוע חיות מהתבוננות או אינטראקציה אחד את השני, כל עכבר הוא מושעה בתוך תא משלו שלושה קירות מלבני שלה (55 גובה X 15 רוחב X עומק 11.5 ס"מ). העכבר הוא מושעה במרכז תא זה ואת רוחב ועומק הם בגודל מספיק, כך העכבר לא יכול לעשות שיתוף ntact עם הקירות. בהגדרה זו, את המרחק המשוער בין האף של העכבר על הרצפה המנגנון הוא 20-25 ס"מ. ישנם ארבעה תאים זהים כגון במנגנון שמאפשר לנו לבדוק ארבעה עכברים בכל פעם. ההשעיה אלומיניום בר (1 ס"מ. X 1 ס"מ גובה. רוחב x 60 ס"מ. אורך), המשמש להשעות את הזנב של העכבר כל, ממוקם בחלק העליון של התיבה. מידות שבו אנו משתמשים במעבדה שלנו יש להתייחס כהערה כללית. לדוגמה, בגודל של תאים בודדים של תיבת הזנב ההשעיה ניתן להגדיל אם זן גדול עכבר outbred (למשל CD-1) נמצא בשימוש.

בחלק התחתון של כל תא שאנחנו במקום מגש אלומיניום להסרה שאוסף צואה או שתן של בעלי החיים. אנו משתמשים קופסת אפור כהה לבעלי חיים לבקנים וקופסת שמנת צבעוניים עבור העכברים של צבעים מעיל אחרים. הסדר זה נותן לנו טוב יותר לעומת הניקוד התנהגותית ולכן אמין יותר של הבדיקה.

2. סרט

= "Jove_content"> Tape צריך לדבוק היטב הן את הזנב של העכבר בשורת ההשעיה, ולהיות חזק מספיק כדי לשאת את משקל העכבר נבדק (למשל מערכות תיוג TimeMed, Inc, בר רידג' IL, רוחב 1.9 ס"מ). עם זאת, הסרט לא אמור להיות דביק מדי שכן בסוף הפגישה הוא יוסר מן הזנב. אנחנו חותכים 17 ס"מ שברים של קלטת במקום 2 ס"מ מקצה אחד סימן. חלק זה 2 ס"מ שימש מצרף את הקלטת הזנב, בעוד שאר 15 ס"מ שימש ההשעיה של העכבר.

3. שעון עצר

4. מכשיר הקלטת וידאו

מצלמת וידאו חצובה (או מבנה תמיכה אחרים) יש צורך. מאז בדיקה זו בדרך כלל בעלי חיים רבים נבדק באותו הזמן, הבקיע חיים יהיה קשה ולא מומלץ. מצלמת וידאו צריך להקליט בהייGH ברזולוציה מספיק כדי לעבד תמונה איכותי אשר ישמש מאוחר יותר הבקיע התנהגותיות. תמיד לוודא שיש מספיק זיכרון הקלטה של ​​המצלמה לפני תחילת הבדיקה. אנו משתמשים במצלמת וידאו דיגיטלית אשר רשומות ללא שימוש במדיה פיזית (כלומר קלטת וידאו), המאפשר העברת פשוטה של ​​קטעי וידאו.

5. מחולל רעש לבן

מחולל רעש צריך מסכה צלילים סביבתיים לסירוגין. השימוש מחולל רעש מומלץ במיוחד בסביבות מעבדה שבה רעשים פתאומיים ניתן לשמוע כי היה פוטנציאל לזעזע עכברים. בחדר הניסוי שלנו על רמת רעש הסביבה (ללא מחולל רעש לבן מופעל) הוא סביב 60 דציבל. רמת הצליל הכולל עם מחולל רעש לבן מופעל במקום שבו מתנהל TST היא 70-72 דציבל. עם זאת, יש לציין כי נתונים אלה ניתנים כדוגמה בלבד, כל מעבדה צריך לבחור את רמות רעש זכות על פי הסביבה הייחודית שלהם ואת הנסיבות.

6. ניקוי אספקה

תיבת ההשעיה יש לנגב ביסודיות עם פתרון העיקור (למשל MB-10, חדוד Laboratories Inc, Wilmington, DE, או דומה) לאחר כל מפגש.

7. Climbstoppers (אופציונלי: תלוי זן בשימוש)

עכברים של כמה רקעים, כגון C57BL / 6, עשויה לטפס הזנבות שלהם במהלך הבדיקה ^1. נקה גלילים חלולים (4 ס"מ אורך, 1.6 ס"מ מחוץ בקוטר 1.3 ס"מ בתוך קוטר, 1.5 גרם), כי הם לחתוך לאורך four ס"מ (על ידי FourHourDay Inc, בולטימור MD) מתוך צינורות פוליקרבונט (# 8585K41, מקמאסטר-קאר, Santa Fe Springs , CA) ממוקמים סביב זנבות של עכברים כדי למנוע זנב כזה טיפוס התנהגות ^2,3. התקנים אלה יכולים להתבצע במעבדה עם כל הכלים והחומרים משותף.

2. נוהלי ההתנהגות

> עיצוב ניסיוני הכולל צריך לשקף מאזנת כראוי בין משתנים ספציפיים הניסוי. לדוגמה, בניסויים שלנו אנחנו מנסים לייצג כל קבוצה שווה כל פגישה TST (כלומר, אם יש ארבע קבוצות הטיפול, כל אחד יהיה מיוצג בכל פגישה). בנוסף, עמדות של עכברים הם מסובבים בצורה כזאת כי עכברים מכל קבוצת טיפול ממוקמים בעמדה שונה בכל פגישה.

1. מניחים את המצלמה במצב. המצלמה צריכה להיות קרוב ככל האפשר על מנת לקבל את הרזולוציה הגבוהה ביותר של בעלי החיים.
2. שברי Tape אשר ישמשו במהלך הפגישה יש לחתוך, מסומן, והכינה עבור הפגישה.
3. הפעל את מחולל רעש לבן, אם בשימוש, לפני העכברים הם הציגו לחדר הבדיקה. רמת רעש לבן צריך רק להיות מספיק כדי להסוות רעשים חיצוניים. הימנע נפח גבוה ולוודא את אותה רמת רעש לבן משמשת כל בעלי החיים.
4. הביאו אתimals לחדר הבדיקה. אם החדר שבו החיות לשכון וחדר בדיקות הם סמוכים זה לזה עם תנאי הסביבה דומים, אין תקופת הסתגלות עשוי להיות נחוץ. אחרת, במקום החיות בחדר הבדיקה לתקופה של הסתגלות (בדרך כלל לפחות שעה אחת). שימו לב כי בעלי חיים אחרים ממוקמים באותו חדר יכולים לחוש אותות הריח ואת קולי.
5. אם זן ידוע לטפס על זנבותיהם, כגון C57BL6 / J, נמצא בשימוש Climbstoppers מקום סביב זנבות לפני החלת את הקלטת.
6. ציית את הקלטת זנבות של עכברים. השתמש סוף מסומן של הקלטת ולוודא הקלטת מקלות על הזנב לאחור על עצמה. הקלטת צריך להיות מיושם עד הסוף של הזנב עם 2-3 מילימטרים של הזנב שנותר מחוץ קלטת.
7. לאחר כל קטע של סרט מחובר זנב עכבר מקל את החלק האמצעי של הסרט אל הקירות הפנימיים של הכלוב. זה יעזור למנוע להסתבך חתיכות סרט זה לזה. שים לב, גonfinement באופן זה עלול לגרום ללחץ וזה חשוב כדי להשלים את התהליך של יישום הקלטת כל חיה בהקדם האפשרי.
8. לאחר כל סרט מוחל, להתחיל את ההקלטה ולזהות את הפגישה לפני העכברים מושעים.
9. להשעות את בעלי החיים על ידי הצבת את הקצה החופשי של הקלטת בשורת ההשעיה או מדף בצו זה מתאזן בין קבוצות הטיפול. עכברים להשעות באופן שאינו מסתיר את תצוגת המצלמה כי הפגישה TST כולו יהיה כבש שיבוש המצלמה תוביל חוסר היכולת להעריך התנהגויות בתקופה זו. בדוק כי כל הקצוות קלטת תלויות במקביל לבר השעיה או מדף באורך דומה של רפיון עבור כל עכבר.
10. בסוף הפגישה (שהוא בדרך כלל שש דקות), להחזיר את בעלי החיים שלהם homecage ובזהירות להסיר את הסרט מן הזנב כל על ידי משיכתו בעדינות מעל. אין להעתיק את הקלטת מזנב מאחר שהדבר עלול לגרום לכאב אל מיקרופוןה
11. לאחר שחזר העכברים לחדר המושבה שלהם לבטל את boli שתן צואה ומן מגשי איסוף לנגב את המנגנון עם פתרון חיטוי.

3. ניתוח התנהגות

1. באופן כללי, TST היא מתחילתו ועד סופו שש דקות אורך. בניגוד ההליך נעשה שימוש נרחב אחר יעילות נגד דיכאון, הבדיקה נאלץ לשחות, הפגישה כולה הבקיע. זאת בשל הכללית נמצא כי עכברים נוטים להפגין חוסר תנועה מוקדם יותר TST.
2. במעבדה שלנו, אנו להעלות את קבצי וידאו ישירות מהמצלמה למחשב שבו מתבצע הניתוח.
3. במהלך ניתוח התנהגות בזמן כי כל עכבר מבלה כמו סלולרי נמדד. אמנם זה אפשרי למדוד את הזמן תנועה ישירות, מצאנו את זה יותר קל לזהות ולמדוד תנועות פעיל ולא חוסר תנועות כאלה.
4. ההיבט החשוב ביותר של ניתוח התנהגותי TST היא זיהוי עקבי של התנועהזה כי הם נרשמו ניידות בתום לב. עכברים, במיוחד בתחילת הפגישה, התנהגויות להתבטא בגלוי כי הם לברוח בנושא. אלה כוללים מנסה להגיע קירות של המנגנון ואת בר השעיה, רעד חזק של הגוף, התנועה של הגפיים דומה פועל. תנועות אלו מהוות בבירור ניידות. אלו התנהגויות אז לשכוך ולהפוך מעודן. ב תנועות מעבדה קטנה שלנו מוגבלים הרגליים הקדמיות אך ללא מעורבות של הרגליים האחוריות לא ייספרו ניידות. בנוסף, תנודות המטוטלת כמו נדנדות, כי הן בשל המומנטום שנצבר במהלך התקפי ניידות מוקדם גם לא ייספרו ניידות.
5. במעבדה שלנו אנו משתמשים בתוכנה על המסך שעון עצר למדידת זמן (שעון עצר Xnote, dnSoft קבוצת המחקר). שני סטופרים נפרד משמשים על המסך. סטופר first ספירות למטה 360 שניות והתראות הצופה כאשר תקופת ניתוח התנהגותי מסתיים. השני stopwatch מבוקר על ידי הצופה אמצעים הזמן המושקע ניידים. תוכנות מסוימות סטופר יש את היכולת להקצות מקשים כדי להתחיל ולהפסיק פונקציות, כך על המסך, המקלדת יכולה לשלוט בשעון העצר. במקום מקלדת רגילה, אנו משתמשים התקן קלט הידוע בכינויו "Gamepad" לשלוט סטופרים.
6. אם יש יותר מאחד העכבר נבדק להציג על המסך זה רעיון טוב כדי לכסות את חיים אחרים, כך התנועות שלהם לא להסיח את דעתו של הצופה. ניתן להשיג זאת באמצעות חלון נוסף בתוכנית או פיזית על ידי כיסוי עכברים אחרים על המסך עם נייר.
7. ייתכנו כמה הטיה המתרחשים אם הסכום הכולל של הזמן שחלף ניידות עבור העכבר מסוים גלוי לפני השלמת הדיון ניתוח. אם על המסך שעון עצר משמש, אנו ממליצים לכסות את כל אבל עשרוניות אלפית שנייה של שעון העצר. על ידי כיסוי סטופר הצופה יודע אם הוא סטופראו לבטל בכל נקודה אבל לא יודע את סך כל הזמן שחלף, ולכן לא יכול להיות מושפע הטיה כלשהי. בגישה זו את הצופה, תוך עיוור מטלות קבוצה של בעלי החיים, לא יהיה לך מושג כללי על רמת הניידות כל חיה.
8. מבחן אמינות interobserver צריכה להתנהל עבור כל משקיף חדש לפני תחילת לאסוף נתונים מבעלי חיים מבחן. במעבדה שלנו כל משקיף החדש הראשון שעונים משקיף מנוסה בזמן שהוא או היא מניה. לאחר משקיפים חדשים לרכוש את אמונו מספיק כדי לבדל את הניידות של חוסר תנועה, אז הם ציון בזמן אמת עם הצופה חווה צופים להצביע טעויות. לאחר שלב זה מסתיים בהצלחה, המשקיפים החדש יהיה לנתח סדרה ספציפית של קטעי וידאו TST לנו לשמור במעבדה שלנו למטרות אימונים. רק לאחר רמה גבוהה של התאמה interobserver מתקבל עם הצופה חווה אינו חוקר לנתח קטעי וידאו TST מ בפועלניסויים. אנחנו בארכיון נתונים אלה מנתח הכשרה מהווה תקן פנימי במעבדה. ראינו הבדלים בין זני באופן שבו הם מביעים ניידות (ו תנועה) התנהגויות אומר שהגיע הזמן תנועה בין המינים. כאשר מודל חדש זן, מין, או מהונדסים גנטית העכבר נבדק במעבדה יש ​​צורך שוב לבצע סוג זה של ניתוח אמינות.

4. נציג תוצאות

השתמשנו TST להעריך דיכאון כמו התגובות טיפול ליתיום עכבר זנים שונים (איור 1) ^3. פרטים ניסויית של ניסוי זה מתפרסמים יכול et al. 2011 ^3.

באיור 1. חוסר תנועה בתוך זמן לבדוק את הזנב השעיה לאחר מתן ליתיום כרונית חמישה זנים עכבר מולדת. עכברים היו קבוצת ביתד, ארבעה עכברים לכל כלוב. עכברים בקבוצת הטיפול שקיבלו ליתיום ליתיום האוכל המכיל 4 גרם / ק"ג LiCl במשך שלושה שבועות. חיות בקרת קיבלו מזון זהה ללא כלוריד ליתיום. **: P <0.01, ***: p <0.001 לציין משמעותי, מזווג מבחן t. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. n :10-12 בעלי חיים לכל קבוצה עבור כל זן. (דמות לשכפל מ ^3).

בדוגמה זו, השפעה משמעותית של טיפול כרוני נמסר ליתיום במזון הוא ציין רק זנים C57BL/6J ו DBA/2J. בשלושת הזנים האחרים, ירידה לא משמעותית מבחינה סטטיסטית נצפתה תנועה בזמן. נתונים אלו מעידים כי תגובה דיכאון כמו ליתיום לטיפול כרוני הוא זן תלויים כמו גם נצפתה עם תרופות אחרות נגד דיכאון ^4-8.

Discussion

פיתוח TST על ידי Steru et al. ⁹ הושפע מבחן שפותחו בעבר נאלצו לשחות ^10-12. בדומה למבחן נאלץ לשחות, בעכברים TST ממוקמות במצב בלתי נמנעת אך מלחיצה למדי. היעדר התנהגות לברוח הקשורות נחשב תנועה. כמו במבחן נאלץ לשחות, TST הינה הבדיקה תוקף הטובה ביותר להערכת היעילות של תרופות נוגדות דיכאון, אך משמשים גם כדי להעריך את ההשפעות של מניפולציות סביבתיות הנוירוביולוגי, וגנטיים ^13-18. בניגוד למבחן נאלץ לשחות, ב TST אין סיכון של היפותרמיה בגלל הטבילה במים ^19. הנסיינים צריכים לזכור כי בעוד מבחן לשחות בכפייה TST הם לכאורה דומים, יש הבדלים חשובים שונים הרגישות שלהם ואת הביצועים ואת התוצאות של מבחן אחד לא בהכרח להיות משוכפל השני. תיאור מצוין ב ההבדליםetween אלה שתי בדיקות לראות את הפניות הבאות ^4,20,21. למרות שרוב תרופות נוגדות דיכאון לקחת שבועות להשפעות משמעות קלינית בחולים, תרופות נוגדות דיכאון יכולות להשפיע באורח שלהם TST ואת הבדיקה נאלץ לשחות שני טיפולים אקוטי וכרוני הבאים ^20,22,23. עם זאת, יש הרבה בדיקות התנהגותיות אחרות להערכת דיכאון אפקטים דמויי בעכברים כי הם רגישים בדרך כלל לטיפול כרוני בלבד. אלה כוללים מתח כרוני בלתי צפויות ^24, הלחץ החברתי להביס ^25, חידוש מודחקים האכלה ^26.

בנוסף טביעת רגל קטנה שלה, העלות הנמוכה והקלות היחסית של ההתקנה, אוטומציה של איסוף נתונים TST ניתן גם ^9,27,28. שתי גישות עיקריות אוטומציה הם אלקטרו מכניות מערכות מדידה וניתוח וידאו. בגישה אלקטרו מכניות, בעל חיים הוא הושעה מד המתח ואת התנועות של החיות נמדדים (למשל Mעורך Associates Inc, סנט אלבנס, VT: הרווארד Apparatus, Holliston, MA). גישה נוספת היא ניתוח המבוסס על תוכנה של הקלטות וידאו TST (למשל Noldus Inc, הולנד; Cleversys Inc, רסטון, VA). עם זאת, גם עם אוטומציה, התערבות אנושית עדיין יהיה צורך בכך, שכן הפרמטרים להחיל חייב להיות מותאם עבור כל דגם העכבר זן חדש או והתוצאות צריך להיות מאומת על ידי הצופה אדם למטרות בקרת איכות.

בעיה אחת מתמשכת שראוי לתשומת לב מיוחדת עם TST היא התנהגות הזנב טיפוס של עכברים מסוימים, במיוחד נפוץ C57BL / 6 זן ^1,20. בעלי חיים אלה יש נטייה לכיוון לכת עבור וטיפוס הזנבות שלהם. עכברים בהצלחה לטפס הזנבות שלהם למדו לברוח אפשרי. עכברים כאלה ולכן צריך להיכלל בניתוח, אשר מגדילה את מספר העכברים הנדרשים מקטין האמינות של ההליך. העובדה זן C57BL / 6 העכבר הוא ג ביותרזן ommon השתמשו במחקר הנוירוביולוגי וגנטיים מגביר את ההשפעה של בעיה זו. במאמר זה, אנו מפורט פתרון התנהגות הזנב טיפוס אשר פותחה במעבדה שלנו ^2,3. על מנת למנוע את ההתנהגות הזנב מטפס, אנחנו מקום גלילים חלולים מסביב לבסיס של הזנב של עכברים. העכברים לא יכול להחזיק גלילים אלה ולכן לא ניתן לטפס זנבותיהם. ראינו כי עכברים לא טיפסו זנבם בעת השימוש בגישה זו ^2,3. בנוסף, אנו הראו כי תרופות נוגדות דיכאון כמו ההשפעה של ליתיום, דיווחה בעבר TST ללא סוגים אלה של ²⁹ צילינדרים, עדיין קיימות בעת השימוש בהם ^3.

יצוין כי TST אינה מומלצת מכרסמים כבדים כגון חולדות, שכן היא מכאיבה פוטנציאלי עבור החיות האלה כדי לתמוך במשקל שלהם רק באמצעות זנבותיהם. באותה מידה, יש לנקוט זהירות עם עכברים כבד במיוחד (למשל, בעכברים המשמשיםהשמנה דוגמנות), ובמקרים אלה הנסיינים צריך לחפש מבחנים חלופיים כגון מבחן נאלץ לשחות ¹⁰ יש לזכור כי כל המניפולציות שעשויים להשפיע על רמת הפעילות הכוללת פוטנציאלי עלול לשנות את הניידות TST המוביל למסקנות מזויף. בגלל זה, חשוב לוודא את התוצאות של TST עם בדיקות התנהגותיות נפרד למדוד את רמות הפעילות הכוללת של עכברים כמו מבחן פתוח בתחום ^30.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tape
Timer
Video Camera
White Noise Generator (optional)
Climbstoppers (optional; depending upon strain used)