尾懸垂テスト

Summary

尾懸垂試験は、マウスにおける薬物治療の抗うつ効果を評価するための実験手順として検証されます。マウスは、6分間その尾によって中断され、エスケープ関連の行動が評価されています。我々は、尾懸垂試験の実施に使用される手順を説明します。

Abstract

尾懸垂試験は、潜在的な抗うつ薬のスクリーニングに有用なマウスの行動テストで、うつ病に関連する行動に影響を与えないことが予想されている他の操作の査定。マウスは、それがエスケープまたは近くの表面に保持できないような位置に、テープで彼らの尾によって停止されています。このテスト中は、通常は6分間持続時間で、結果として得られるエスケープ指向の振る舞い​​が定量化されています。尾懸垂試験は、将来の抗うつ薬化合物のハイスループットスクリーニングのための創薬に有用なツールです。ここでは、発生する可能性があると、それらを回避する方法を潜在的な問題についての追加重点を置いて、このテストの実施に必要な詳細を説明します。我々はまた、広く使用されているC57BL / 6とテールクライミング動作を解決する、いくつかのマウス系統では、このテストは役に立たないレンダリングする共通の問題を、提供しています。具体的には、小さなプラスチックを通してマウスの尾を渡すことによって、テール登山行動を防ぐ前のサスペンションのシリンダー。最後に、どのように手動でこのテストで明らかにされている行動を獲得するために我々詳細。

Protocol

1。材料

1。サスペンションボックス

尾懸垂試験（TST）は、彼らの尾で地面からマウスを中断伴います。最も基本的なレベルでは、手順はサスペンションのバーや棚の棚、およびテープが必要です。しかし、実験者は、最適なコントラストを提供するバックグラウンドの使用を考慮する必要があります。さらに、それはテストされている他の動物を観察するからマウスを防ぐための対策を講じるのが賢明です。当研究室では、我々は大きさ（55高さX 60幅× 11.5 cmの深さ）とプラスチック製の特別に製造された尾懸垂ボックス（4時間の日、ボルティモアMD）を、使用してください。お互いを観察したり、相互作用から動物を防ぐために、各マウスは、その独自の3層長方形区画（55高さX 15幅× 11.5 cmの深さ）の中で中断されます。マウスは、この区画の真ん中に懸濁させ、幅と深さはマウスが協力を行うことができないようなサイズに設定されていますされ壁とntact。この設定では、マウスの鼻と装置の床面との間のおおよその距離は20〜25 cmです。私たちは一度に4匹のマウスをテストできるように装置のような4つの同一のコンパートメントがあります。各マウスの尾を中断するために使用されるアルミサスバー（1 cmの高さX 1センチメートル。幅× 60センチの長さ）は、ボックスの上部に位置している。我々は我々の研究室で使用するディメンションは、一般的な基準とみなされるべきである。大規模な近交系マウス系統（例：CD - 1）が使用されている場合例えば、テールサスペンションボックスの個々の区画のサイズを大きくすることができます。

各コンパートメントの一番下に私たちは動物から糞や尿を収集する取り外し可能なアルミのトレイを置きます。我々は、アルビノの動物のための暗い灰色のボックスと他のコートの色のマウスのクリーム色のボックスを使用してください。この取り決めは、私たちより良いコントラストとテストのため、より信頼性の高い行動の得点を与える。

2。テープ

3。タイマー

4。ビデオ録画デバイス

ビデオカメラと三脚は、（または他の支持構造）が必要である。このテストは通常​​、同時に試験される複数の動物を含んでいるので、ライブスコアが困難になるのでお勧めできません。ビデオカメラは、ハワイ州で記録する必要があります行動スコアリングのために後で使用される高品質の画像をレンダリングするためにGH十分な解像度。常にテストを開始する前に、カメラに十分な記録のメモリがあることを確認してください。我々は、ビデオの簡単な転送を可能にする、物理メディア（すなわちビデオカセット）を使用せずにデジタル記録するビデオカメラを使用。

5。ホワイトノイズ発生器

ノイズ発生器は、断続的な環境音にマ​​スクをかける必要があります。ノイズジェネレーターの使用は、特に突然大きな音が潜在的にマウスを驚愕することを聞くことができる実験室環境で推奨されます。我々の実験室での周囲雑音レベルは、（アクティブホワイトノイズ発生器なし）を60 dB程度です。 TSTが行われる場所でアクティブにホワイトノイズ発生器との合計音のレベルは70〜72デシベルです。しかし、これらの図は例として提供されていることに注意すべきである、と各研究室では、選択してください彼らのユニークな環境や状況に応じて右側のノイズレベル。

6。クリーニング用品

サスペンションボックスは滅菌溶液（例えばMB - 10、皮肉Laboratories社、ウィルミントン、DE、または類似の）と各セッションの後は十分に拭き取ってください。

7。 Climbstoppers（オプション：使用ひずみに依存）

このようなC57BL / 6などのいくつかの背景を、、のマウスは、試験^1の間に彼らの尾を登ることができる。ポリカーボネートチューブから4 cmの長さ（FourHourDay株式会社、ボルティモアMDによる）（＃8585K41、マクマスター - カー、サンタフェスプリングスにカットされている明確な中空円筒（4センチ長さ、外径1.6センチメートル、内径1.3センチメートル、1.5グラム） 、CA）が動作^2,3を登るような尾を防ぐために、マウスの尾の周りに配置されています。これらのデバイスは、共通のツールや材料を持つ任意の実験室で行うことができます。

2。行動手順

1. の位置にカメラを置きます。カメラは、動物の可能な限り高い解像度を得るためにできるだけ近いはずです。
2. セッション中に使用されるテープの断片は、カットマーク、およびセッションのために準備する必要があります。
3. マウスは、試験室に導入される前に、使用されている場合、ホワイトノイズ発生器を起動します。ホワイトノイズのレベルは、外部ノイズをマスクするために十分なはずです。高音量を回避し、ホワイトノイズと同じレベルのすべての動物のために使用されていることを確認します。
4. 持参試験室にimals。動物が存在する部屋や試験室は、同様の環境条件との相互に隣接している場合は、順化期間は必要になる場合があります。そうでなければ、順化の期間（一般的には少なくとも1時間）に試験室に動物を置く。同じ部屋に配置された他の動物は嗅覚と超音波手がかりを感知できることに注意してください。
5. このようなC57BL6 / Jのような尾を、登ることが知られ菌株は、テープを適用する前に、尾の周りの場所のClimbstoppersを使用されている場合。
6. マウスの尾にテープを付着する。テープの著しい先端を使って、テープが尾とバック自体にくっついていることを確認します。テープは、テープの外側に残っている尾の2〜3ミリメートルとテールの一番最後に適用する必要があります。
7. かつてテープの各部分は、ケージの内側の壁にテープの中央部分をスティックマウスの尾部に取り付けられています。これはお互いにテープ片のもつれを防ぐことができます。なお、Cこの方法でonfinementはストレスを引き起こすため、早急に各動物にテープを適用するプロセスを完了することが重要であることができる。
8. すべてのテープが適用されると、録音を開始し、マウスが中断される前にセッションを識別します。
9. 治療群間で相殺されるためにサスペンションのバーや棚の上にテープの自由端を置くことによって、動物を一時停止します。全体TSTセッションが得点し、カメラがその時に行動を評価するためにできないことにつながる妨害されるため、カメラのビューを妨げないような方法でマウスをサスペンド。すべてのテープの両端がそれぞれのマウスのスラックの同じような長さとサスペンションのバーや棚に平行にハングアップしていることを確認してください。
10. セッションの終了（通常は6分である）で、彼らのhomecageに動物を戻すと、慎重にゆっくりとそれを引っ張って各尾からテープを削除する。そうすることがマイクに痛みを引き起こす可能性があるので尾からテープをリッピングしないでください。E.
11. 彼らのコロニーの部屋にマウスを返した後にコレクショントレーから糞便玻璃と尿を破棄し、消毒液で装置を拭いてください。

3。行動分析

1. 一般的に、TSTは長さが6分を最初から最後までです。他の広く使用されている抗うつ効果の手続き、強制水泳試験とは異なり、セッション全体がスコアリングされ。これは、マウスは以前TSTでマニフェスト不動する傾向があることを見つける一般的な原因です。
2. 私たちのラボでは、カメラからの分析が行われているPCに直接ビデオファイルをアップロードする。
3. 行動の分析中に携帯電話が測定される各マウスが費やす時間。それは直接不動時間を測定することは可能ですが、我々はそれが容易ではなく、そのような動きの欠如よりも活発な動きを検出し測定することを発見した。
4. TST行動分析の最も重要な側面は、動きの一貫性のある識別です善意のモビリティとして記録されているの。特にセッションの開始時にマウス、、公然と逃げる関係しているマニフェストの行動。これらは装置の壁とサスペンションバー、ボディの強い揺れ、そして実行に似て手足の動きの情報を表示しようとして含まれています。これらの動きは明らかにモビリティを構成する。その後、これらの行動治まると微妙になる。前脚に限定されていますが、後ろ足の関与なしにモビリティとしてカウントされていない我々の研究室の小さな動きで。さらに、以前のモビリティの試合で得た勢いを原因とするスイングのような振動と振り子はまた、モビリティとしてカウントされません。
5. 私たちのラボでは、時間の測定（Xnoteストップウォッチ、dnSoft研究グループ）のための画面上のストップウォッチのソフトウェアを使用してください。二つの独立したストップウォッチは、画面上で使用されています。時の行動分析期間が終了する第一ストップウォッチは360秒とアラートからオブザーバをダウンカウントします。第二STO時間は、モバイル過ごしたオブザーバー-措置によってpwatch制御さ。特定のストップウォッチのソフトは、画面上にキーボードがストップウォッチを制御できるように、機能を起動および停止するキーを割り当てる機能を持っています。代わりに通常のキーボードの、我々​​は一般的にストップウォッチを制御するために"ゲームパッド"として知られている入力デバイスを使用してください。
6. 画面上でテストされた、現在複数のマウスがある場合、それは彼らの動きが観察者の気をそらすことがないように他の動物をカバーすることをお勧めします。これは、別のプログラムのウィンドウを使用するか、物理的に紙と画面上の他のマウスを覆うことによって行うことができます。
7. 特定のマウスの経過モビリティの時間の合計は、分析前のセッションが完了するまで表示されている場合に発生するいくつかのバイアスがあるかもしれません。画面上のストップウォッチを使用する場合、我々はすべてがストップウォッチの秒の小数をカバーするために示唆している。ストップウォッチをカバーすることによって観察者は、唯一のストップウォッチがあるかどうかを知っている合計時間が経過し、従ってあらゆるバイアスの影響を受けないことを知っていないオンまたはオフにいずれかの時点でですが。このアプローチのオブザーバを用いて、動物のグループの割り当てにブラインドしながら、それぞれの動物の移動性のレベルの一般的な考えを持っていないでしょう。
8. 者間の信頼性試験は、試験動物からデータを収集を開始する前に、すべての新しい観察のために実施されるべきである。彼または彼女が得点している間私たちの研究室では各々の新しい観察は、最初に経験豊かな観測者を監視します。新しいオブザーバーは不動の機動性を区別するために十分な信用を得るの後、彼らはその後、経験豊かな観測者が視聴して誤りがあれば指摘してリアルタイムで得点。このフェーズが正常に完了すると、新たなオブザーバーは、我々は訓練の目的のために当研究室で維持しているTSTビデオの特定のセットを分析します。者間の相関の高いレベルは、経験豊富な観察で得られた後にのみ調査官は、実際のTSTのビデオを分析していません実験。我々は、アーカイブ、これらのトレーニングの分析からのデータは、実験室の内部標準を構成する。我々は、彼らがモビリティ（と不動）の行動を表現し、男女間の不動時間を意味する方法で菌株間の違いを観察している。新しい系統、性別、または遺伝子改変マウスモデルが実験室で試験されている場合は、再度信頼性のこのタイプの分析を行うことが必要です。

4。代表的な結果

我々は、様々なマウス系統におけるリチウムの治療（図^1）3〜抗うつ薬のような応答を評価するためにTSTを使用している。この実験の実験の詳細はできますから、2011年³公開されています。

図1、5つの近交系マウスにおける慢性的なリチウムの投与後に尾懸垂試験において無動時間。マウスは、グループの家でしたD、ケージあたり4匹。リチウム治療群のマウスは、3週間で4 g / kgの塩化リチウムを含むリチウム順子を受けた。対照動物は、塩化リチウムなく同一の食品を受け取りました。 **：P <0.01、***：P <0.001で有意な、対応のないt検定を示す。データは平均± SEMとして表される。各菌株のグループごとにnは:10 - 12匹。 （図³から再生された）。

この例では、食品に配信慢性リチウムの有意な治療効果は、C57BL/6JとDBA/2J系統で観察される。他の3株では、不動時間に統計的に有意な減少が観察されなかった。これらのデータはまた、他の抗うつ薬^4月8日に観察されているように慢性リチウム治療に抗うつ薬のような応答が依存する株であることを示している。

Discussion

Steru らによるTSTの開発^9は、以前開発した強制水泳試験^10月12日影響を受けていた。 TSTマウスの強制水泳試験、似ては避けられないが適度にストレスの多い状況に置かれている。エスケープ関連行動の欠如が不動とみなされます。強制水泳試験と同様に、TSTはテスト最良の薬の抗うつ効果を評価するための検証だけでなく、環境への神経生物学的、および遺伝的操作の影響^13-18を評価するために使用されます。強制水泳試験とは対照的に、TSTに水¹⁹の水没による低体温症の危険性はない。実験者は、強制水泳試験とTSTが同様の一応のある間、それらの感度及び性能の様々な重要な違いがあることを念頭に置く必要がありますし、つのテストの結果は、必ずしも他に複製されないことがあります。違いはbの優秀な説明については、etweenこれら2つのテストは以下の参照^4,20,21を参照してください。ほとんどの抗うつ薬は、患者の臨床的に有意な効果を発揮するために数週間かかるものの、抗うつ薬は、そのTSTに影響し、強制水泳試験は、以下の両方の急性および慢性の治療^20,22,23を発揮することができる。ただし、慢性の治療に一般的に敏感なマウスでは抗うつ薬のような効果を評価するために使用される多くの他の行動テストがあります。これらは、慢性的な予測できないストレス^24、社会的な敗北のストレス^25、および新規性^26を供給抑制が含まれています。

その小さなフットプリント、低コストとセットアップの相対的な容易さに加えて、TSTのデータ収集の自動化も^9,27,28可能です。自動化のための2つの主要なアプローチは、電気機械的測定システムとビデオの分析です。電気機械的なアプローチでは、動物は、ひずみゲージから中断され、動物の動きは（例えば、Mを測定していますEDアソシエイツ株式会社、セントオールバンズ、バーモント州、ハーバード装置、ホリストン、MA）。別のアプローチは、TSTのビデオ録画（; Cleversys社、レストン、バージニア州などNoldus社、オランダ）のソフトウェアベースの分析です。適用されたパラメータが各々の新しいマウスモデルや歪みに合わせて調整する必要があるとの結果が品質管理の目的のために人間の観察者によって検証されるべきであるしかし、さらに自動化で、人間の介入は、まだ、必要となります。

TSTとの特別な注目に値する一つの永続的な問題は、いくつかのマウスの尾-登山行動、特に、一般的に使用されるC57BL / 6系統^1,20です。これらの動物は手を伸ばすと、自分の尾を登山に向けて傾向がある。うまく自分の尾を登るマウスは、エスケープが可能であることを学んだ。このようなマウスは、したがって、必要なマウスの数を増加し、手順の信頼性を低下させる分析から除外する必要があります。 C57BL / 6マウスの系統は、ほとんどのCであるという事実神経生物学と遺伝学的研究で使用されているommon株は、この問題の影響を悪化させる。本稿では、私たちの研究室^2,3で開発されたテールクライミングの動作への解決策を詳述。尾クライミングの動作を防止するために、我々はマウスの尾の付け根のまわり中空シリンダーを配置。マウスは、これらのシリンダに保持できないため、彼らの尾を登ることができません。我々はこのアプローチ^2,3を使用^してもマウスは尾を登っていないことを観察した。さらに、我々はリチウムの抗うつ様効果は、それらの^3を使用するときにまだ存在している、シリンダ²⁹のこれらのタイプのなくTSTで以前に報告されたことが示されている。

それはこれらの動物のためだけに尾で、自分の体重を支えるために潜在的に苦痛なので、TSTは、ラット等重いげっ歯類のために推奨されていないことに注意する必要があります。同じトークンによって、注意がのために使用される異常に重いマウス（例えば、マウスを用いる場合には注意が必要モデリングの肥満）、およびこれらのケースで実験者は、それが全体の活動レベルに影響を及ぼす可能性のある操作が潜在的に誤った結論を導くTSTの移動度を変化させる可能性があることに留意する必要があるような強制水泳試験¹⁰などの代替試験のためになるはずです。このため、このようなオープンフィールドテスト³⁰のようなマウスでは全体の活動レベルを測定する別の行動テストでツ反の結果を確認することが重要です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tape
Timer
Video Camera
White Noise Generator (optional)
Climbstoppers (optional; depending upon strain used)