Summary
La prueba de la cola de suspensión se valida como un procedimiento experimental para evaluar la eficacia de los tratamientos farmacológicos antidepresivos en ratones. Los ratones son suspendidos por la cola durante seis minutos y escapar de conductas relacionadas con la evaluación son. Se describen los procedimientos utilizados en la realización de la prueba de suspensión de la cola.
Abstract
La prueba de la cola de suspensión es una prueba de comportamiento del ratón útil en la detección de potenciales fármacos antidepresivos, y la evaluación de otras manipulaciones que se espera que afecte a los comportamientos relacionados con la depresión. Los ratones son suspendidos por la cola con la cinta, en una posición tal que no puede escapar o aferrarse a las superficies cercanas. Durante esta prueba, normalmente de seis minutos de duración, las conductas de escape resultante orientado se cuantifican. La prueba de la cola de suspensión es una herramienta valiosa en el descubrimiento de fármacos para el cribado de alto rendimiento de los futuros antidepresivos. A continuación, describimos los detalles necesarios para la ejecución de esta prueba con especial hincapié en los problemas potenciales que pueden ocurrir y cómo evitarlos. También ofrecemos una solución para el comportamiento de la cola de escalada, un problema común que hace que esta prueba inútil en algunas cepas de ratón, como el ampliamente utilizado C57BL / 6. En concreto, podemos prevenir conductas cola subiendo al pasar colas de ratón a través de un pequeño de plásticocilindro antes de la suspensión. Por último, se detalla la forma de puntuación de forma manual los comportamientos que se manifiestan en esta prueba.
Protocol
1. Materiales
1. Suspensión Caja
La prueba de la cola de suspensión (TST) implica la suspensión de los ratones por encima del suelo por la cola. En el nivel más básico, el procedimiento sólo requiere de una barra de suspensión o repisa estante, y la cinta. Sin embargo, el investigador debe considerar el uso de un fondo que ofrece un contraste óptimo. Además, es prudente tomar medidas para evitar que los ratones de la observación de otros animales que están en estudio. En nuestro laboratorio, se utiliza especialmente fabricado cajas de suspensión de la cola (cuatro horas al día, Baltimore MD), hecho de plástico con las dimensiones (55 x altura 60 de ancho x 11,5 cm de profundidad). Con el fin de evitar que los animales de la observación o que interactúan entre sí, cada ratón se suspende dentro de sus propios tres paredes del compartimiento rectangular (55 x altura 15 de ancho x 11,5 cm de profundidad). El ratón se suspende en el centro de este compartimiento y el ancho y la profundidad son de tamaño suficiente para que el ratón no se puede hacer contact con las paredes. En este contexto, la distancia aproximada entre la nariz del ratón y el garaje es de 20-25 cm. Hay cuatro compartimientos idénticos como en el aparato que nos permite poner a prueba cuatro ratones a la vez. Una barra de suspensión de aluminio (1 cm. Altura X 1 cm. Ancho x 60 cm. Longitud), para suspender la cola de cada ratón, se coloca en la parte superior de la caja. Las dimensiones que usamos en nuestro laboratorio debe ser considerado como una referencia general. Por ejemplo, el tamaño de los compartimentos de la caja de la cola de suspensión se puede aumentar si una cepa de ratón outbred grandes (por ejemplo, CD-1) se utiliza.
En la parte inferior de cada compartimento se coloca una bandeja de aluminio desmontable que recoge las heces o la orina de los animales. Usamos una caja de color gris oscuro para los animales albinos y una caja de color crema para los ratones de colores de la capa otros. Este acuerdo nos da un mejor contraste y la calificación de conducta por lo tanto más confiable de la prueba.
2. Cinta
3. Temporizador
4. Dispositivo de grabación de vídeo
Una cámara de video y un trípode (o estructura de apoyo) son necesarios. Como esta prueba por lo general implica varios animales se está probando al mismo tiempo, anotando en vivo será difícil y no es aconsejable. La cámara de vídeo debe registrar en altagh suficiente resolución para hacer una imagen de calidad que se utilizarán más adelante para la puntuación de comportamiento. Asegúrese siempre de que no hay memoria suficiente en la grabación de la cámara antes de comenzar la prueba. Usamos una cámara de vídeo que graba digitalmente sin el uso de medios físicos (es decir, casetes de vídeo), lo que permite la transferencia directa de videos.
5. Generador de ruido blanco
El generador de ruido intermitente debe enmascarar los sonidos ambientales. El uso de un generador de ruido es especialmente recomendable en entornos de laboratorio, donde ruidos fuertes y repentinos se puede escuchar que potencialmente podría asustar a los ratones. En nuestra sala experimental el nivel de ruido (sin el generador de ruido blanco activado) es de alrededor de 60 dB. El nivel de sonido total con el generador de ruido blanco activado en el lugar donde se lleva a cabo la TST es 70-72 dB. Sin embargo, cabe señalar que estas cifras se proporcionan a modo de ejemplo solamente, y cada laboratorio debe seleccionar elniveles adecuados de ruido de acuerdo a su entorno y circunstancias únicas.
6. Artículos de limpieza
El cuadro de suspensión se debe limpiar a fondo después de cada sesión con una solución de esterilización (por ejemplo, MB-10, Quip Laboratories Inc., Wilmington, DE, o similar).
7. Climbstoppers (opcional: depende de la cepa utilizada)
Los ratones de algunos fondos, como C57BL / 6, puede subir la cola durante la prueba 1. Claro cilindros huecos (4 cm de largo, 1,6 cm de diámetro exterior, 1,3 cm de diámetro interior, 1,5 gramos) que se cortan a la longitud cm cuatro (por FourHourDay Inc, Baltimore MD) de tubo de policarbonato (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs , CA) se colocan alrededor de las colas de los ratones para evitar que la cola como subir el comportamiento 2,3. Estos dispositivos se pueden hacer en cualquier laboratorio con herramientas y materiales comunes.
2. Procedimientos de comportamiento
- Coloque la cámara en su posición. La cámara debe estar lo más cerca posible a fin de obtener la mayor resolución posible de los animales.
- Fragmentos de la cinta que se utilizarán durante la sesión debe ser cortado, marcado, y se preparó para la sesión.
- Iniciar el generador de ruido blanco, si se utilizan, antes de que los ratones son introducidos a la sala de pruebas. El nivel de ruido blanco sólo debe ser suficiente para enmascarar los ruidos externos. Evitar un alto volumen y asegúrese de que el mismo nivel de ruido blanco se utiliza para todos los animales.
- Llevar el unoimals en la sala de pruebas. Si la habitación donde los animales viven y la sala de pruebas son adyacentes entre sí, con condiciones ambientales similares, sin período de aclimatación puede ser necesario. De lo contrario, colocar los animales en la sala de pruebas por un período de aclimatación (por lo general al menos una hora). Tenga en cuenta que los animales que se hicieron en la misma habitación puede detectar señales olfativas y con ultrasonido.
- Si una cepa conocida para subir la cola, como C57BL6 / J, se está utilizando Climbstoppers lugar alrededor de la cola antes de aplicar la cinta.
- La cinta se adhieran a las colas de los ratones. Use el extremo marcado de la cinta y hacer que la cinta se pega a la cola y sobre sí mismo. La cinta se debe aplicar hasta el final de la cola con 3.2 milímetros de la cola quedan fuera de la cinta.
- Una vez que cada trozo de cinta está conectado a una cola de ratón pegar la parte central de la cinta a la pared interior de la jaula. Esto ayudará a evitar que se enreden de trozos de cinta entre sí. Tenga en cuenta que confinement de esta manera puede causar estrés y que es importante para completar el proceso de aplicación de la cinta a cada animal tan pronto como sea posible.
- Una vez que toda la cinta se aplica, iniciar la grabación e identificar la sesión antes de que los ratones están suspendidos.
- Colgar a los animales mediante la colocación de la extremidad libre de la cinta en la barra de suspensión o un estante en un orden que se compensa entre los grupos de tratamiento. Suspender los ratones de una manera que no se obstruya la vista de la cámara porque la sesión TST todo se calificará y obstrucción de la cámara dará lugar a la incapacidad de evaluar los comportamientos durante ese tiempo. Compruebe que todos los extremos de la cinta están colgando en paralelo a la barra de suspensión o estanterías con una longitud similar de holgura para cada ratón.
- Al final de la sesión (que suele ser de seis minutos), el retorno a los animales a su homecage y retirar con cuidado la cinta de cada cola tirando suavemente de él fuera. No rasgar la cinta de la cola, ya que hacerlo puede causar dolor al micrófonoe.
- Después de regresar a los ratones a su cuarto colonia descartar el boli fecal y la orina de las bandejas de recogida y limpie el aparato con una solución esterilizante.
3. Análisis de la Conducta
- En general, la TST es de principio a fin seis minutos de duración. A diferencia de otro procedimiento de eficacia ampliamente utilizado antidepresivos, la prueba de natación forzada, toda la sesión se anotó. Esto se debe a la conclusión general de que los ratones tienden a la inmovilidad de manifiesto anteriormente en el TST.
- En nuestro laboratorio hemos subir los archivos de vídeo directamente desde la cámara a un PC donde se lleva a cabo el análisis.
- Durante el análisis del comportamiento del tiempo que pasa cada ratón como móviles se mide. Si bien es posible medir el tiempo de inmovilidad directamente, hemos encontrado que es más fácil de detectar y medir los movimientos de activos en lugar de la falta de estos movimientos.
- El aspecto más importante de análisis de comportamiento TST es la identificación constante de movimientos que se registran en la movilidad de buena fe. Los ratones, especialmente al comienzo de la sesión, manifestando conductas que son abiertamente escapar relacionados. Estas incluyen tratar de llegar a las paredes del aparato y la barra de suspensión, una fuerte sacudida del cuerpo, y el movimiento de las extremidades similar a manejar. Estos movimientos constituyen claramente la movilidad. Estos comportamientos luego desaparecen y se convierten en sutiles. En los movimientos de nuestro pequeño laboratorio que se limitan a las patas delanteras, pero sin la participación de las patas traseras no se cuentan como la movilidad. Además, las oscilaciones del péndulo y como cambios que se deben al impulso alcanzado durante los combates a principios de la movilidad también no se cuentan como la movilidad.
- En nuestro laboratorio utilizamos un software en la pantalla del cronómetro para medir el tiempo (cronómetro Xnote, dnSoft Grupo de Investigación). Dos cronómetros separados se utilizan en la pantalla. El primer cronómetro cuenta atrás de 360 segundos y avisa al observador, cuando el período de análisis de comportamiento extremos. El segundo stopwatch controlado por el observador mide el tiempo dedicado a móviles. Ciertos software cronómetro tiene la capacidad de asignar teclas para iniciar y detener funciones, por lo que en la pantalla el teclado puede controlar el cronómetro. En lugar de un teclado normal, se utiliza un dispositivo de entrada se conoce comúnmente como 'gamepad' para controlar los cronómetros.
- Si hay más de un ratón a prueba y presente en la pantalla es una buena idea para cubrir los otros animales para que sus movimientos no distraer al observador. Esto se puede lograr mediante el uso de otra ventana del programa o física que cubre los otros ratones en la pantalla con el papel.
- Es posible que haya algún sesgo que ocurre si la cantidad total de tiempo transcurrido para la movilidad de un ratón en particular es visible antes de la finalización de la sesión de análisis. Si un cronómetro en la pantalla se utiliza, le sugerimos que para cubrir todos los decimales, pero milésima de segundo del cronómetro. Al cubrir el cronómetro el único observador sabe si el cronómetro estáo desactivar en cualquier momento, pero no sabe el tiempo total transcurrido y por lo tanto no pueden ser afectados por cualquier sesgo. Utilizando este enfoque, el observador, mientras que ciega a las asignaciones de grupo de los animales, no se tiene una idea general del nivel de movilidad de cada animal.
- Una prueba de fiabilidad interobservador debe realizarse para cada nuevo observador antes de comenzar a recopilar datos de los animales de prueba. En nuestro laboratorio de cada nuevo observador primero observa a un observador experimentado, mientras que él o ella está anotando. Después de los nuevos observadores ganar la confianza suficiente como para diferenciar la movilidad de la inmovilidad, que la puntuación en tiempo real con el observador experimentado mirando y señalando errores. Una vez que esta fase se completa con éxito, los nuevos observadores se analizará un conjunto específico de videos TST que mantenemos en nuestro laboratorio con fines de formación. Sólo después de un alto nivel de correlación interobservador se obtiene con el observador experimentado hace un investigador analizar los videos de TST realexperimentos. Guardamos los datos de estos análisis de la formación para constituir una norma interna para el laboratorio. Hemos observado diferencias entre las cepas de la manera en la que expresan la movilidad (y la inmovilidad) los comportamientos, y la media de tiempo de inmovilidad entre los sexos. Cuando un nuevo modelo de cepa, sexo, o genéticamente modificados ratón se pone a prueba en el laboratorio es necesario para llevar a cabo una vez más este tipo de análisis de confiabilidad.
4. Resultados representante
Hemos utilizado la TST para evaluar los antidepresivos como la respuesta al tratamiento de litio en diferentes cepas de ratón (Figura 1) 3. Los detalles experimentales de este experimento se publican en Can et al., 2011 3.
Figura 1. Tiempo de inmovilidad en el ensayo de suspensión de cola después de la administración de litio crónica en cinco cepas de ratones endogámicos. Grupo de ratones se casad, cuatro ratones por jaula. Los ratones del grupo de tratamiento recibieron litio litio comida que contiene 4 g / kg LiCl durante tres semanas. Los animales control recibieron alimentos idénticos sin el cloruro de litio. **: P <0,01, ***: p <0,001 denotan un cambio significativo, unpaired t-test. Los datos se expresan como media ± SEM. n :10-12 animales por grupo para cada cepa. (Figura realizada a partir de 3).
En este ejemplo, un efecto significativo del tratamiento crónico con litio de entrega de alimentos se observa solamente en las cepas C57BL/6J y DBA/2J. En las otras tres cepas, sin disminución estadísticamente significativa en el tiempo de inmovilidad se observó. Estos datos indican que una respuesta de tipo antidepresivo para el tratamiento crónico con litio es dependiente de la cepa, como también se ha observado con otros medicamentos antidepresivos 4.8.
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Discussion
Desarrollo de la TST por Steru et al. 9 fue influenciado por el desarrollado anteriormente obligado nadar la prueba 10-12. Similar a la prueba de natación forzada, en el TST ratones se colocan en una situación ineludible, pero moderadamente estresantes. La falta de conducta de evitación se considera relacionada con la inmovilidad. Al igual que la prueba de natación forzada, la TST es una prueba mejor validados para la evaluación de la eficacia antidepresiva de los medicamentos, pero también se utiliza para evaluar los efectos de las manipulaciones del medio ambiente, neurobiológicos y genéticos 13-18. En contraste con la prueba de natación forzada, en el TST que no hay riesgo de hipotermia por sumersión en el agua 19. Los experimentadores deben tener en cuenta que si bien la prueba de natación forzada y TST son similares a primera vista, hay varias diferencias importantes en su sensibilidad y rendimiento y los resultados de una prueba no necesariamente se repetirá en el otro. Para una excelente descripción de las diferencias bntre estas dos pruebas consulte las siguientes referencias 4,20,21. Aunque la mayoría de los antidepresivos tardan semanas en ejercer efectos clínicamente significativos en pacientes, los antidepresivos pueden ejercer sus efectos en el TST y la prueba de natación forzada tanto siguientes tratamientos agudos y crónicos 20,22,23. Sin embargo, hay muchas otras pruebas de comportamiento para evaluar los efectos de tipo antidepresivo en ratones que son sensibles al tratamiento crónico solamente. Estos incluyen el estrés crónico impredecible 24, el estrés derrota social 25, y la novedad suprimido la alimentación 26.
Además de su reducido tamaño, bajo coste y relativa facilidad de la instalación, automatización de la recolección de datos en la TST es posible 9,27,28. Dos enfoques principales para la automatización son sistemas electromecánicos de medición y análisis de vídeo. En el enfoque de electro-mecánico, el animal se suspende de un medidor de tensión y los movimientos de los animales se miden (por ejemplo, Med Associates Inc, St. Albans, VT, Harvard Apparatus, Holliston, MA). Otro enfoque es el análisis basado en software de grabación de vídeo TST (por ejemplo, Noldus Inc., Países Bajos; Cleversys Inc., Reston, VA). Sin embargo, incluso con la automatización, la intervención humana sigue siendo necesaria, ya que los parámetros para su uso debe ser ajustada para cada modelo de ratón o de nueva cepa y los resultados deben ser verificados por un observador humano con fines de control de calidad.
Uno de los problemas persistentes que merece una atención especial con el TST es el comportamiento de la cola de escalada de algunos ratones, especialmente los de uso común C57BL / 6 cepa 1,20. Estos animales tienen una propensión hacia el logro de la escalada y la cola. Los ratones que subir con éxito sus colas han aprendido que es posible escapar. Los ratones lo tanto, deben ser excluidos del análisis, lo que aumenta el número de ratones necesarias y reduce la fiabilidad del procedimiento. El hecho de que la cepa de ratón C57BL / 6 es el más cCOMUNES cepa utilizada en la investigación neurobiológica y genética exacerba la influencia de este problema. En este trabajo se detalla una solución para el comportamiento de la cola de escalada que se ha desarrollado en nuestro laboratorio 2,3. Con el fin de evitar que el comportamiento de cola de escalada, ponemos cilindros huecos alrededor de la base de la cola de los ratones. Los ratones no pueden retener las botellas y por lo tanto, no pueden subir sus colas. Hemos observado que los ratones no han subido sus colas cuando se utiliza este método 2,3. Además, hemos demostrado que los efectos de tipo antidepresivo del litio, informó anteriormente en el TST sin este tipo de cilindros de 29, todavía están presentes cuando se utilizan los tres.
Cabe señalar que el PPD no es recomendable para los más pesados roedores tales como ratas, ya que es potencialmente doloroso para estos animales para soportar su peso sólo por la cola. De la misma manera, se debe tener cuidado con los ratones inusualmente pesados (por ejemplo, los ratones utilizados parala obesidad de modelado), y en estos casos los experimentadores deben buscar métodos alternativos tales como la prueba de natación forzada 10 Hay que tener en cuenta que cualquier manipulación que pueda afectar los niveles de actividad general puede potencialmente alterar la movilidad en el TST que conducen a conclusiones falsas. Debido a esto, es importante para verificar los resultados de TST con distintos tests de comportamiento que miden los niveles generales de actividad en los ratones, como la prueba de campo abierto 30.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio ha sido financiado por la beca R01 y R21 NiHM MH091816 MH084043 a TDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tape | |||
| Timer | |||
| Video Camera | |||
| White Noise Generator (optional) | |||
| Climbstoppers (optional; depending upon strain used) |
References
- Mayorga, A. J., Lucki, I. Limitations on the use of the C57BL/6 mouse in the tail suspension test. Psychopharmacology (Berl). 155, 110-112 (2001).
- Dao, D. T. Mood Disorder Susceptibility Gene CACNA1C Modifies Mood-Related Behaviors in Mice and Interacts with Sex to Influence Behavior in Mice and Diagnosis in Humans. Biological Psychiatry. 68, 801-810 (2010).
- Can, A. L. Antidepressant-like responses to lithium in genetically diverse mouse strains. Genes, Brain and Behavior. 10, 434-443 (2011).
- Bai, F., Li, X., Clay, M., Lindstrom, T., Skolnick, P. Intra- and interstrain differences in models of "behavioral despair". Pharmacol. Biochem. Behav. 70, 187-192 (2001).
- Cervo, L. Genotype-dependent activity of tryptophan hydroxylase-2 determines the response to citalopram in a mouse model of depression. J. Neurosci. 25, 8165-8172 (2005).
- David, D. J., Renard, C. E., Jolliet, P., Hascoet, M., Bourin, M. Antidepressant-like effects in various mice strains in the forced swimming test. Psychopharmacology (Berl). 166, 373-382 (2003).
- Dulawa, S. C., Holick, K. A., Gundersen, B., Hen, R. Effects of chronic fluoxetine in animal models of anxiety and depression. Neuropsychopharmacology. 29, 1321-1330 (2004).
- Lucki, I., Dalvi, A., Mayorga, A. J. Sensitivity to the effects of pharmacologically selective antidepressants in different strains of mice. Psychopharmacology (Berl). 155, 315-322 (2001).
- Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology (Berl). 85, 367-370 (1985).
- Can, A., Dao, D. T., Arad, M., Terrillion, C. E., Piantadosi, S. C., Gould, T. D. The Mouse Forced Swim Test. J. Vis. Exp. 58, 3791-3638 (2012).
- Porsolt, R. D., Bertin, A., Jalfre, M. Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 229, 327-336 (1977).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioural despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments. Eur. J. Pharmacol. 47, 379-391 (1978).
- Crowley, J. J., Blendy, J. A., Lucki, I. Strain-dependent antidepressant-like effects of citalopram in the mouse tail suspension test. Psychopharmacology (Berl). 183, 257-264 (2005).
- Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415, 197-201 (2001).
- Lad, H. V., Liu, L., Paya-Cano, J. L., Fernandes, C., Schalkwyk, L. C. Quantitative traits for the tail suspension test: automation, optimization, and BXD RI mapping. Mammalian. Genome. 18, 482-491 (2007).
- Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biol. Psychiatry. 49, 575-581 (2001).
- Ripoll, N., David, D. J., Dailly, E., Hascoet, M., Bourin, M. Antidepressant-like effects in various mice strains in the tail suspension test. Behav. Brain. Res.. 143, 193-200 (2003).
- Mineur, Y. S., Belzung, C., Crusio, W. E. Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice. Behav. Brain. Res. 175, 43-50 (2006).
- Thierry, B., Stéru, L., Simon, P., Porsolt, R. D. The tail suspension test: Ethical considerations. Psychopharmacology. 90, 284-285 (1986).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 29, 571-625 (2005).
- O'Leary, O. F., Cryan, J. F. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice. Gould, T. D. 42, Humana Press. 119-137 (2009).
- Detke, M. J., Johnson, J., Lucki, I. Acute and Chronic Antidepressant Drug Treatment in the Rat Forced Swimming Test Model of Depression. Experimental and Clinical Psychopharmacology. 5, 107-112 (1997).
- Rupniak, N. M. J. Animal models of depression: challenges from a drug development perspective. Behavioural Pharmacology. 14, 385-390 (2003).
- Strekalova, T., Steinbusch, H. Mood and Anxiety related phenotypes in mice: Characterization using behavioral tests. 42, 153-176 (2009).
- Bartolomucci, A., Fuchs, E., Koolhaas, J. M., Ohl, F. Mood and Anxiety related phenotypes in mice: Characterization using behavioral tests. 42, 261-275 (2009).
- Samuels, B. A., Hen, R. Mood and Anxiety related phenotypes in mice: Characterization using behavioral tests. 63, 107-121 (2011).
- Juszczak, G. R. The usage of video analysis system for detection of immobility in the tail suspension test in mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 85, 332-338 (2006).
- Crowley, J. J., Jones, O. 'L. eary, F, O., Lucki, I. Automated tests for measuring the effects of antidepressants in mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 78, 269-274 (2004).
- Gould, T. D. Involvement of AMPA receptors in the antidepressant-like effects of lithium in the mouse tail suspension test and forced swim test. Neuropharmacology. 54, 577-587 (2008).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and Anxiety related phenotypes in mice: Characterization using behavioral tests. Gould, T. D. 42, Humana Press. (2009).
