Svansen suspensionsprov

Summary

Svansen-fjädring test valideras som en experimentell procedur för att bedöma den antidepressiva effekten av läkemedelsbehandling hos möss. Möss är upphängd i sina svansar i sex minuter och fly-relaterade beteenden bedöms. Vi beskriver metoder som används i utför testet svansen suspension.

Abstract

Svansen-fjädring test är en mus beteende testa användbara vid screening av potentiella antidepressiva läkemedel, och bedömning av andra manipulationer som förväntas påverka depression beteenden. Möss är upphängd i sina svansar med tejp, i ett sådant läge att den inte kan fly eller hålla på till närliggande ytor. Under detta test, vanligtvis sex minuter i längd, är den resulterande fly orienterade beteenden kvantifieras. Svansen-fjädring test är ett värdefullt verktyg för läkemedelsutveckling för high-throughput screening av blivande antidepressiva föreningar. Här beskriver vi de uppgifter som krävs för att genomföra detta test med ytterligare tonvikt på potentiella problem som kan uppstå och hur man undviker dem. Vi erbjuder också en lösning på svansen klättring beteende, ett vanligt problem som gör detta test värdelös i vissa mus stammar, som används allmänt C57BL / 6. Specifikt förhindrar vi svans klättring beteenden genom att passera musen svansar genom ett litet plastcylindern innan avstängning. Slutligen har vi i detalj hur du manuellt poäng de beteenden som manifesteras i detta test.

Protocol

1. Material

1. Fjädring Box

Svansen-suspensionsprov (TST) innebär upphävande möss ovanför marken av deras svansar. På den mest grundläggande nivån, krävs att det förfarande bara en suspension bar eller hylla avsats, och tejp. Dock bör försöksledaren överväga att använda en bakgrund som ger optimal kontrast. Dessutom är det klokt att vidta åtgärder för att hindra möss från att observera andra djur som testas. I vårt laboratorium använder vi specialtillverkade lådor svans fjädring (Fyra timmars arbetsdag, Baltimore MD), av plast med måtten (55 höjd x 60 bredd x 11,5 cm djup). För att hindra djur från att observera och interagera med varandra, varje mus som är upphängd i sina egna tre väggar rektangulära fack (55 höjd x 15 bredd x 11,5 cm djup). Musen är upphängd i mitten av detta fack och bredden och djupet är tillräckligt stora så att musen inte kan göra tillsammansntact med väggarna. I den här inställningen är den ungefärliga avståndet mellan musens nos och apparaturen golv 20-25 cm. Det finns fyra sådana identiska fack i apparaten ger oss möjlighet att testa fyra möss åt gången. En aluminium fjädring Bar (1 cm. Höjd x 1 cm. Bredd x 60 cm. Längd), används för att hänga i svansen på varje mus är placerad på toppen av lådan. Måtten som vi använder i vårt laboratorium bör betraktas som en allmän referens. Till exempel kan storleken på de enskilda fack i svansen-upphängning rutan ökas om en stor utavlat musstam (t.ex. CD-1) används.

Längst ner på varje fack vi placerar en löstagbar aluminium bricka som samlar avföring eller urin från djuren. Vi använder en mörk grå ruta för albinodjur och en kräm färgade rutan för möss av andra päls färger. Detta arrangemang ger oss bättre kontrast och därför mer tillförlitlig beteende poängsättning av testet.

2. Tape

3. Timer

4. Videoinspelningsenhet

En videokamera och ett stativ (eller annan stödjande struktur) behövs. Eftersom denna test vanligtvis innebär flera djur testas samtidigt, kommer att leva scoring vara svårt och rekommenderas inte. Videokameran ska spela in i hiGH tillräckligt hög upplösning för att göra en bildkvalitet som kommer att användas senare för beteende-poäng. Se alltid till att det finns tillräckligt inspelning minne i kameran innan du startar testet. Vi använder oss av en videokamera som registrerar digitalt utan användning av fysiska medier (dvs videokassett), vilket möjliggör enkel överföring av video.

5. Vitt brus generator

Bullret generator bör masken intermittenta miljöljud. Användningen av ett brus generator rekommenderas särskilt i laboratoriemiljöer där plötsliga höga ljud kan höras som potentiellt skulle skrämma möss. I vårt testrum den omgivande ljudnivån (utan vitt brus aktiveras generator) är ca 60 dB. Den totala ljudnivån med vitt brus generator aktiveras vid den plats där TST bedrivs är 70-72 dB. Det bör dock noteras att dessa siffror ges som exempel bara, och varje laboratorium bör väljarätt bullernivåer enligt deras unika miljö och omständigheter.

6. Rengöringsmedel

Suspensionen boxen skall torkas noggrant efter varje session med en sterilisering lösning (t.ex. MB-10, QUIP Laboratories Inc., Wilmington, DE, eller liknande).

7. Climbstoppers (tillval: beroende på stam som använts)

Möss av vissa bakgrunder, såsom C57BL / 6, kan klättra på svansen under testet ^1. Rensa ihåliga cylindrar (4 cm långa, 1,6 cm ytterdiameter, 1,3 cm innerdiameter, 1,5 gram) som skärs till fyra cm längd (av FourHourDay Inc, Baltimore MD) från polykarbonat slang (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs , Kalifornien) är placerade runt svansen på möss för att förhindra sådana svans klättring beteende ^2,3. Dessa enheter kan göras i något laboratorium med gemensamma verktyg och material.

2. Behavioral Rutiner

1. Placera kameran på plats. Kameran ska vara så nära som möjligt för att uppnå högsta möjliga upplösning av djuren.
2. Tejp fragment som kommer att användas under sessionen borde sänkas, märkas och förberett för sessionen.
3. Starta vitt brus generator, om det används, innan möss införs den testning rummet. Nivån av vitt brus bör endast vara tillräckligt för att maskera yttre ljud. Undvik hög volym och se till att samma nivå av vitt brus används för alla djur.
4. Ta med enDJUR i test rummet. Om rummet där djuren bor och testning rummet är bredvid varandra med liknande omgivande villkor, får ingen acklimatisering period vara nödvändig. Annars, placera djur i tester rum för en period av acklimatisering (i allmänhet minst en timme). Var medveten om att andra djur placeras i samma rum kan känna lukt-och ultraljud signaler.
5. Om en stam känd för att klättra deras svansar, såsom C57BL6 / J, används plats Climbstoppers runt svansen före ansökan bandet.
6. Följ bandet runt svansen på möss. Använd den markerade slutet på bandet och se till att bandet fastnar på svansen och tillbaka till sig själv. Tejpen bör tillämpas till slutet av svansen med 2-3 millimeter av svansen kvar utanför bandet.
7. När varje bit tejp är ansluten till en mus svans sticka den mellersta delen av bandet till de inre väggarna i buren. Detta förhindrar trassel av tejp bitar till varandra. Notera att confinement på detta sätt kan orsaka stress och att det är viktigt att slutföra processen att tillämpa bandet till varje djur så snart som möjligt.
8. När all tejp används, starta inspelningen och identifiera sessionen innan möss är suspenderade.
9. Häng djuren genom att placera den fria änden av bandet om avbrytande baren eller hylla i en ordning som är balanseras mellan behandlingsgrupperna. Häng möss på ett sätt som inte skymmer kameran uppfattning eftersom hela TST sessionen görs och hindrar att kameran kommer att leda till en oförmåga att bedöma beteenden under den tiden. Kontrollera att all tejp ändar hänger parallellt med fjädring bar eller hylla med en lika lång slack för varje mus.
10. Vid slutet av sessionen (som är normalt sex minuter), gå tillbaka djuren till deras homecage och försiktigt ta bort tejpen från varje svans genom att försiktigt dra bort det. Inte slita tejpen från svansen eftersom detta kan orsaka smärta till MICe.
11. Efter att ha återvänt möss till sina koloni rum kasta avföring Boli och urin från insamling facken och torka av apparaten med en sterilisering lösning.

3. Beteende Analys

1. Generellt är TST från början till slut sex minuter i längd. Till skillnad från en annan vanligt förekommande antidepressiva effekten förfarande, de tvingas simma testet är hela sessionen poäng. Detta beror på den allmänna slutsatsen att möss tenderar att manifestera orörlighet tidigare i TST.
2. I vårt laboratorium har vi ladda upp videofiler direkt från kameran till en dator där analysen görs.
3. Under beteendeanalys den tid som varje mus spenderar som mobila mäts. Även om det är möjligt att mäta orörlighet tid direkt, har vi funnit det lättare att upptäcka och mäta aktiva rörelser snarare än brist på sådana rörelser.
4. Den viktigaste aspekten av TST beteendeanalys är sammanhängande identifiering av rörelses som registreras som äkta rörlighet. Möss, särskilt i början av sessionen, uppenbart beteenden som öppet är fly relaterade. Dessa inkluderar försöker nå väggarna i apparater och upphävandet baren, starka skakningar i kroppen, och rörelse i armar och ben liknar igång. Dessa rörelser är klart rörlighet. Dessa beteenden sedan avta och bli finare. I vårt laboratorium små rörelser som är begränsad till frambenen, men utan inblandning av bakbenen räknas inte som rörlighet. Dessutom fick svängningar och pendel som svänger som beror på den dynamik som under tidigare rörlighet skjutningarna inte heller räknas som rörlighet.
5. I vårt laboratorium använder vi en på skärmen stoppur programvara för tid mätningar (XNote Stoppur, dnSoft Research Group). Två separata stoppur används på skärmen. Den första stoppur räknar ner från 360 sekunder och varnar observatör när beteendeanalys är slut. Den andra stoPWATCH kontrollerade av observatören, mäter den tid mobil. Vissa stoppur mjukvara har möjlighet att överlåta nycklar att starta och stoppa funktioner, så att på skärmen tangentbordet kan styra stoppuret. Istället för ett vanligt tangentbord, använder vi en inmatningsenhet allmänt känd som en "gamepad" att kontrollera stoppur.
6. Om det finns mer än en mus testade och finns på skärmen är det en bra idé att täcka andra djur så att deras rörelser inte kommer att distrahera betraktaren. Detta kan göras genom att använda ett annat program fönster eller genom att fysiskt täcker andra möss på skärmen med papper.
7. Det kan finnas vissa fördomar uppstår om det totala rörlighet tid förflutit för en viss mus är synlig före slutförandet av analysen sessionen. Om en på skärmen stoppur används, föreslår vi att täcka alla men millisekund decimaler av stoppuret. Genom att täcka stoppuret betraktaren vet bara om stoppuretpå eller stänga av när som helst, men vet inte den totala tid som förflutit och kan därför inte påverkas av någon bias. Med hjälp av denna metod observatören, samtidigt blinda för den grupp uppdrag av djuren, inte kommer att ha en allmän uppfattning om graden av rörlighet i varje djur.
8. En interobserver tillförlitlighet prov bör utföras för varje ny observatör innan man börjar samla in data från försöksdjur. I vårt laboratorium varje ny observatör klockor först en erfaren observatör medan han eller hon är scoring. Efter att den nya observatörer få tillräckligt förtroende för att skilja rörlighet från orörlighet, poäng de sedan i realtid med erfaren observatör titta och peka ut eventuella misstag. När denna fas är avslutad kommer den nya observatörer analysera en specifik uppsättning TST videor som vi behåller i vårt laboratorium i utbildningssyfte. Först efter en hög interobserver korrelation erhålls med erfaren observatör inte analysera en utredare TST videoklipp från faktiskaexperiment. Vi arkivera data från dessa utbildning analyser att utgöra en intern standard för laboratoriet. Vi har sett skillnader mellan stammar i det sätt på vilket de uttrycker rörlighet (och orörlighet) beteenden och menar orörlighet tid mellan könen. När en ny stam, kön eller genförändrad mus modell testas i laboratoriet är det nödvändigt att återigen göra den här typen av tillförlitlighet analys.

4. Representativa resultat

Vi har använt TST att bedöma antidepressivliknande svar på litium behandling i olika musstammar (Figur 1) ^3. Experimentell detaljerna i detta experiment publiceras i Can et al. 2011 ^3.

Figur 1. Orörlighet tid i svansen suspensionsprov efter kronisk litium administration i fem inavlade musstammar. Möss grupp husd, fyra möss per bur. Möss i litium behandlingsgruppen fick litium chow innehåller 4 g / kg LiCl i tre veckor. Kontroll djuren fick identiska livsmedel utan litiumklorid. **: P <0,01, ***: p <0,001 beteckna en betydande oparade t-test. Uppgifterna är uttryckta som medelvärde ± SEM. n :10-12 djur per grupp för varje stam. (Bild hämtad från ^3).

I detta exempel är en signifikant behandlingseffekt av kronisk litium levereras i mat observerades endast i C57BL/6J och DBA/2J stammar. I de övriga tre stammar var ingen statistiskt signifikant minskning av orörlighet tid observerats. Dessa data visar att ett antidepressivt-liknande svar på kronisk litium behandling är stammen beroende som har också observerats med andra antidepressiva läkemedel ^4-8.

Discussion

Utveckling av TST genom Steru et al. Var ⁹ påverkades av tvingade tidigare utvecklat simma testa ^10-12. I likhet med tvingades simma testet i TST möss är placerade i en ofrånkomlig men måttligt stressande situation. Brist på flykt beteenden anses orörlighet. Liksom de tvingades simma testet är TST ett test bäst validerade för utvärdering av den antidepressiva effekten av läkemedel, men också för att utvärdera effekterna av miljö-, neurobiologiska och genetiska manipulationer ^13-18. I motsats till de tvingas simma testet i TST finns det ingen risk för hypotermi följd av nedsänkning i vatten ^19. De praktiker bör ha i åtanke att även om tvingade simma test och TST liknar vid första anblicken, det finns flera viktiga skillnader i deras känslighet och prestanda samt resultaten av ett test inte nödvändigtvis upprepas i den andra. För en utmärkt beskrivning av skillnaderna Between dessa två tester se följande referenser ^4,20,21. Även om de flesta antidepressiva medel ta veckor att utöva kliniskt signifikanta effekter på patienter, kan antidepressiva utövar sina effekter på TST och tvingas simma testa både efter akut och kronisk behandling ^20,22,23. Men det finns många andra beteendemässiga tester för att bedöma antidepressiva-liknande effekter hos möss som är generellt känsliga för kronisk behandling enbart. Dessa inkluderar kronisk oförutsägbara stress ^24, sociala besegra stressen ^25, och nyhet undertryckta utfodring ^26.

Förutom sina små yttermått, låg kostnad och relativt enkel installation, är automatisering av datainsamling i TST också möjligt ^9,27,28. Två huvudsakliga tillvägagångssätt för automatisering är elektromekaniska mätsystem och videoanalys. I elektromekaniska tillvägagångssätt är djuret upphängd i ett töjningsmätaren och förflyttningar av djuren mäts (t.ex. MED Associates Inc, St Albans, VT, Harvard Apparatur, Holliston, MA). Ett annat tillvägagångssätt är mjukvarubaserad analys av TST videoinspelningar (t.ex. Noldus Inc., Nederländerna, Cleversys Inc. Reston, VA). Men även med automatisering, kommer mänsklig påverkan fortfarande vara nödvändigt, eftersom den tillämpade parametrar som måste anpassas för varje ny musmodell eller stam och resultaten bör verifieras genom en mänsklig observatör för kvalitetskontroll.

Ett bestående problem som förtjänar särskild uppmärksamhet med TST är svansen-klättring beteende av några möss, speciellt vanligaste C57BL / 6 stam ^1,20. Dessa djur har en benägenhet mot att nå för och klättring sin egen svans. Möss som framgångsrikt klättra deras svansar har lärt oss att fly är möjligt. Sådana möss bör därför uteslutas från analysen, vilket ökar antalet nödvändiga möss och minskar tillförlitligheten av förfarandet. Det faktum att C57BL / 6 musstam är det mest CEMENSAMMA stam som används i neurobiologiska och genetiska forskningen förvärrar påverkan av detta problem. I denna uppsats detaljerad vi en lösning till svans-klättring beteende som utvecklats i vårt laboratorium ^2,3. För att förhindra att svansen-klättring beteende, placerar vi ihåliga rullar runt svansroten av möss. Mössen kan inte hålla fast vid dessa cylindrar och därför inte kan klättra deras svansar. Vi har observerat att inga möss har klättrat på svansen när man använder denna metod ^2,3. Dessutom har vi visat att antidepressiva-liknande effekter av litium, rapporterade tidigare i TST utan dessa typer av cylindrar ^29, som fortfarande finns kvar när du använder dem ^3.

Det bör noteras att TST inte rekommenderas för tyngre gnagare som råttor, eftersom den är potentiellt smärtsamt för dessa djur för att stödja deras vikt bara av deras svansar. På samma sätt, bör försiktighet iakttas med ovanligt tunga möss (t.ex. möss används förmodellering fetma) och i dessa fall experimentatorerna bör leta efter alternativa tester som tvingades simma testa ¹⁰ Man bör komma ihåg att alla manipulationer som kan påverka den totala aktiviteten potentiellt kan påverka rörligheten på TST leder till falska slutsatser. På grund av detta är det viktigt att kontrollera resultaten av TST med separata beteendevetenskaplig tester som mäter totala aktivitetsnivån hos möss som friland testa ^30.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tape
Timer
Video Camera
White Noise Generator (optional)
Climbstoppers (optional; depending upon strain used)