Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Summary

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode voor

Abstract

Genomen zijn georganiseerd in drie-dimensionale structuren, de vaststelling van hogere-orde-conformaties in de microscopisch kleine nucleaire ruimtes ^{7, 2, 12.} Dergelijke architecturen zijn niet willekeurig en actie tussen genpromoters en regulerende elementen ^13. De binding van transcriptiefactoren specifieke regulerende sequenties brengt een netwerk van transcriptie-regulatie en coördinatie ^{1, 14.}

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is ontwikkeld om te identificeren deze hogere-orde chromatine structuren ^5,6. Cellen zijn vast en interactie loci worden opgevangen door covalente DNA-eiwit cross-links. Om niet-specifieke geluid te minimaliseren en de complexiteit te verminderen en om de specificiteit van de chromatine interactie analyse te verhogen, wordt chromatine immunoprecipitatie (ChIP) gebruikt tegen specifiek eiwit factoren om chromatine fragmenten van belang te verrijken voor de nabijheid van ligatie. Ligatie met half-linkers vormt vervolgens covalente banden tussen paren van DNA-fragmenten bij elkaar binnen de afzonderlijke complexen chromatine vastgebonden. De flankerende MmeI restrictie-enzym sites in de half-linkers maken extractie van gepaarde eind-tag-linker-tag constructies (PET's) op MmeI spijsvertering. Aangezien de halve linkers gebiotinyleerd worden deze constructen PET gezuiverd met streptavidine-magnetische korrels. Het gezuiverde Huisdieren zijn geligeerd met next-generation sequencing adapters en een catalogus van op elkaar inwerkende fragmenten wordt gegenereerd via de volgende generatie sequencers zoals de Illumina Genome Analyzer. Mapping en bio-informatica analyse wordt vervolgens uitgevoerd om ChIP verrijkt bindingsplaatsen en chip-verrijkte chromatine interacties ^{8 geven.}

Wij hebben een video om kritische aspecten van de Chia-PET-protocol, in het bijzonder de voorbereiding van de microchip aan te tonen als de kwaliteit van ChIP speelt een belangrijke rol in de uitkomst van een Chia-PET-bibliotheek. Aangezien de protocollenlang, slechts de kritische stappen in de video.

Protocol

A. chromatine immunoprecipitatie (ChIP) (zie figuur 1)

1. Dubbele verknoping van chromatine-gebonden eiwitten en Cell Oogst

(Om 02:10 van de video)

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is de eerste cruciale stap die betrokken zijn bij de aanleg van een Chia-PET-bibliotheek. Dit is belangrijk de complexiteit, achtergrondlawaai verminderen en specificiteit voegen. De voorbereiding van de chip zal moeten worden geoptimaliseerd voor celtype en factor van belang. Dit protocol is gebaseerd op de RNA polymerase II chia-PET bibliotheek bereid uit MCF-7 cellen ⁹ uitgevoerd in ons laboratorium. Om ervoor te zorgen dat de resulterende bibliotheek is van voldoende complexiteit, raden wij u aan 1 x 10 ⁸ cellen aan de chip materiaal voor te bereiden. Afhankelijk van het doel en cellijn geschiedt, kan de opbrengst tussen de 100 ng tot 300 ng. We raden een minimum van 100 ng chip moet gebruikt worden om samen tenstruct een Chia-PET-bibliotheek met minder dan 20 PCR-cycli om redundantie te minimaliseren tijdens de sequencing. Grotere hoeveelheden van CHIP materiaal zal zorgen voor een verdere verlaging van redundantie, het verbeteren van de kwaliteit van de bibliotheken.

1. Tweemaal wassen 1 x 10 ⁸ MCF-7 cellen (gelijk aan vijf 500 cm ² vierkante platen van 2 x 10 ⁷ cellen) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voorverwarmd bij 37 ° C.
2. Crosslink MCF-7 cellen met 1,5 mM vers bereide ethylglycol bis (SuccinimidylSuccinate) (EGS)) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (22 ° C) met draaiing in een afzuigkap.
3. Voeg 37% formaldehyde tot een uiteindelijke concentratie van 1% gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (22 ° C) met draaiing in een afzuigkap.

4. Doof het verknopingsmiddelen door 2 M glycine tot een eindconcentratie van 200 mM. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur(22 ° C) met rotatie.

5. Gooi afgeschrikte crosslinkers in een afval kolf en twee keer wassen cellen met koude PBS.
6. Gooi PBS en oogst cellen door schrapen. Houd geoogste cellen op ijs. Spoel de plaat met 5 ml PBS (met proteaseremmers ("+ PI") toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant) om de verzameling van cellen te maximaliseren.
7. Pellet de cellen bij 1.800 xg (3000 rpm) gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Gooi supernatant en ga naar cel lysis. Ook opslaan pellet bij -80 ° C.

2. Cell Lysis

(Om 04:15 van de video)

1. Hersuspenderen pellet in 15 ml 0,1% SDS lysisbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS + PI) goed door het pipetteren. Draaien gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
2. Pellet gelyseerd cellen op 800 xg (2000 rpm) gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
3. Gooi supernatant en herhaal cellysis een keer als per stap 2.1 en 2.2.
4. De geïsoleerde nucleaire pellet is klaar voor de nucleaire lysis. Als alternatief, op te slaan pellet bij -80 ° C.

3. Nucleaire Lysis

(05:00 van de video)

Nucleaire lysis wordt uitgevoerd om verknoopt chromatine de toets loslaat voordat chromatine fragmentatie. Aangezien kernmembraan kan de verknoopte chromatine worden gesonificeerd met zachtere omstandigheden. Soms sonicatie kracht niet voldoende zijn om breken van de kernmembraan in welk geval minder chromatine worden verkregen omdat de intacte kernen worden verwijderd na centrifugeren. Kunnen echter verschillende celtypen vereisen verschillende omstandigheden.

1. Hersuspenderen geïsoleerde kernen pellet in 15 ml 1% SDS lysisbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natriumchloride Deoxycholate, 1% SDS + PI). Overdracht kernen schorsing aan een hoge snelheid-centrifugebuis (Oak Ridge centrifugebuis (polypropyleen)) en draai gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
2. Pellet gelyseerd kernen pellet op 47.810 xg (20.000 rpm) gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
3. Giet supernatant en break pellet met een P1000 pipetpunt.
4. Was de pellet met 30 ml 0,1% SDS lysisbuffer (+ PI).
5. Draaien gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
6. Pellet chromatine bij 47.810 xg (20.000 rpm) gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
7. Gooi supernatant en herhaal Was eenmaal per stap 3,4 tot 3,6 alvorens tot chromatine fragmentatie. Als alternatief, op te slaan chromatine pellet bij -80 ° C.

4. Fragmentatie van chromatine

(Om 07:03 van de video)

1. Transfer chromatine pellet over in een 14 ml polystyreen met ronde bodem van reageerbuis.
2. Voeg 1 ml 0,1% SDS lysisbuffer (+ PI) naar chromatine pellet. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het mengsel, omdat dit sonicatie efficiëntie beïnvloeden.
3. Shear chromatine-DNA tot een grootte van 200 tot 600 basenparen met een Branson Digital Sonifer Cell Disrupter (amplitude 35%, 9 minuten (30 seconden aan, 30 seconden uit)) en houd monsters koud te allen tijde om oververhitting te voorkomen door het uitvoeren van de sonicatie in een koude ruimte (zie figuur 2).
4. Reverse-verknopen een hoeveelheid van chromatine en controleer fragmentatie efficiëntie met de volgende stappen. (De volgende stappen worden niet weergegeven in de video).
   • Aliquot 10 pi van chromatine na sonificatie.
   • Centrifugeer gesoniceerd chromatine op 16.110 xg (13.200 rpm) gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
   • Breng supernatant naar een nieuwe buis en voeg 2 pi Proteinase K-oplossing.
   • Incubeer gedurende 30 minuten bij 50 ° C
   • Los draaien verknoopt chromatine op een 1,5% agarosegel.
   • Repeat sonicatie als de grootte van DNA groter dan verwacht.
5. Centrifugeer resterende lysaat bij 16.110 xg (13200 rpm) gedurende 30 minuten bij 4 ° C en overdracht gesonificeerd chromatine (supernatant) in een nieuwe buis voor preclearing met magnetische korrels. Als alternatief, op te slaan gesoniceerd chromatine bij -80 ° C totdat er voldoende chromatine wordt verzameld om een ​​chip te starten.

5. Wassen, Preclearing en Coating van antilichaam aan Beads

(Om 08:17 van de video)

1. Preclearing van chromatine
   1. Gebruik 300 ul van magnetische proteïne G kralen voor een IP.
   2. Driemaal wassen met 5 ml kralen kralen wasbuffer (PBS, 0,1% Triton X-100). Deze en toekomstige wasbeurten met magnetische proteïne G kralen bestaan ​​uit de volgende stappen. Zorg ervoor dat magnetische korrels niet uitdrogen.
      • Reclaim kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator.
      • Discard supernatant.
      • Resuspendeer kralen met buffer.
      • Draai gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
      • Centrifugeer op 129 xg (800 rpm) gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
      • Reclaim kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator.
      • Gooi supernatant.
   3. Combineer gesoniceerde chromatine met voorwas kralen, op de achtergrond binding van chromatine om kralen te verwijderen.
      • Houd 10 ul van gesoniceerde chromatine als "input" voor verdere verrijking controle met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR). Bewaar bij 4 ° C.
   4. Draai overnacht bij 4 ° C.
   5. Centrifugeer gesonificeerd chromatine op 129 xg (800 rpm) gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
   6. Plaats buis op de magnetische deeltjes concentrator.
2. Coating Antilichamen tegen magnetische korrels
   1. Aliquot 300 ul magnetische proteïne G korrels naar een nieuwe buis.
   2. Driemaal wassen met 5 ml kralen kralen wasbuffer (PBS, 0,1% Triton X-100).
   3. Voeg een gelijkwaardige hoeveelheid (als bij stap 5.1.3) van kralen Wash Buffer.
   4. Voeg 35 ug RNA polymerase II (8WG16) monoklonale antilichaam.
   5. Draai overnacht bij 4 ° C.
   6. Twee keer wassen antilichaam-gecoate kralen met 5 ml kralen Wash Buffer.
   7. Reclaim antilichaam-gecoate kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator.

6. Chromatine immunoprecipitatie

(Om 10:03 van de video)

Om het niveau van complexiteit en achtergrondgeluid te verminderen, worden antilichamen tegen specifiek eiwit factoren gebruikt om specifieke chromatine fragmenten van belang te verrijken voordat nabijheid ligatie ^6.

Hier wordt gebruik gemaakt van een muis RNA polymerase II monoklonaalantilichaam (8WG16) die de opening vorm van het eiwit herkenden. Door verrijken DNA-fragmenten die worden geassocieerd met RNA polymerase II specificiteit van de bibliotheek kan worden verhoogd, waardoor de identificatie van grote afstand chromatine interacties tussen actieve promotors en de bijbehorende regulatoire gebieden ^9.

1. Verwijder wasbuffer van antilichaam beklede kralen met behulp van een magnetisch concentrator.
2. Transfer gesonificeerd chromatine (supernatant van stap 5.1.6) met behulp van de magnetische deeltjes concentrator antilichaam beklede korrels (van stap 5.2.7).
3. Draai overnacht bij 4 ° C.

7. Wassen en elutie van immunogeprecipiteerd DNA-eiwitcomplexen

(Om 11:13 van de video)

1. Drie keer wassen chromatine-immunogeprecipiteerd kralen met 5 ml 0,1% SDS Lysis Buffer.
2. Ze wast kralen met 5 ml High Salt Wash Buffer (50 mM HEPES pH 7,5, 350 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS).
3. Keer wassen met 5 ml kralen lithiumchloride wasbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholaat).
4. Gooi wasbuffer en resuspendeer gewassen kralen met 1 ml TE-buffer.
5. Draai gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Het monster is klaar voor kwantificering en chip verrijking controle. Zodra voldoende ChIP materiaal is verzameld, het monster is klaar om te worden geconstrueerd in een Chia-PET-bibliotheek. Deze stap is van cruciaal belang, en moet worden gedaan om succesvol te Chia-PET bibliotheek de bouw te garanderen. ChIP verrijkte korrels kunnen worden opgeslagen voor maximaal 2 weken bij 4 ° C terwijl het ondergaan van kwantificatie, ChIP verrijking controles, en de accumulatie van voldoende materiaal.
   1. Elueer en reverse-verknopen "input" DNA en chip-verrijkte kralen met de volgende stappen. (De volgende stappen worden niet getoond in de video.)
      • Elueren 20% ChIP verrijkte korrels met 200 ul ChIP elutiebuffer (50 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Draaien gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer geëlueerd kralen aan 6100 xg (800 rpm) gedurende 1 minuut bij 4 ° C. Overdracht geëlueerd ChIP complexen (supernatant) naar een nieuwe buis met behulp van de magnetische deeltjes concentrator.
      • Omgekeerd crosslink "input" en geëlueerd ChIP complexen met 2 pi Proteinase K (eindconcentratie van 0,2 g / ml) gedurende 2 uur bij 50 ° C.
      • Overdracht reverse-verknoopt "input" DNA en geëlueerd ChIP DNA in een 2 ml MaXtract High Density (respectievelijk). Voeg 200 ul 25:24:1 fenol-chloroform-isoamylalcohol pH 7,9 tot de tubes in een chemische dampkap en keer goed te mengen. Draai de buizen 5 minuten bij 16.110 xg (13200 rpm) bij kamertemperatuur.
      • Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis en neerslaan keren verknoopt DNA-with 20 ul 3 M natriumacetaat pH 5,5, 200 pi isopropanol en 1 pi 15 mg / ml Glycoblue. Incubeer bij -80 ° C gedurende 30 minuten en pellet DNA gedurende 30 minuten bij 16.110 xg (13200 rpm) bij 4 ° C.
      • Na het centrifugeren van isopropanol neergeslagen DNA, DNA-pellet twee keer wassen met 75% ijskoude ethanol en resuspendeer DNA-pellet in 20 ul TE-buffer.
   2. Kwantificeren "input" DNA (uit stap 5.1.3) en chip DNA door picogreen test ^10.
   3. Voer een verrijking controle via kwalitatieve PCR (qPCR).

B. Chromatine Interactie analyse met behulp van gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET)

De tweede helft van de video wordt ingegaan op de belangrijkste stappen in de bouw van een Chia-PET-bibliotheek.

1. End-afstomping van CHIP DNA-fragmenten

In dit hoofdstuk van de video belicht twee Main punten, een stap-voor-stap procedure van het wassen van magnetische korrels om enzymen te verwijderen en als buffer zout van de vorige reactie (Stap 1.1, 12u22-12u54 van de video) en de procedure van het opzetten van enzymatische reacties waarbij magnetische korrels in het reactiemengsel (stap 1,2, 12:54 tot 13:25 video).

1. Ze wast ChIP verrijkte korrels met ijskoude TE-buffer. Deze en toekomstige wasbeurten met magnetische korrels bestaan ​​uit de volgende stappen.
   • Centrifugeer bij 6100 xg (800 rpm) gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
   • Reclaim kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator.
   • Gooi supernatant.
   • Voeg buffer korrels.
   • Mix kralen met buffer door de knop actie.
   • Centrifugeer bij 6100 xg (800 rpm) gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
   • Reclaim kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator.
   • Gooi supernatant.
2. Om fill-in gesoniceerde overhangs te bereiden een meester-mix met 70 pi 10 x buffer voor T4 DNA polymerase, 7 pi 10 mM dNTP's en 615,8 pi nuclease-vrij water. Meng goed en resuspendeer gewassen kralen met master-mix. Voeg 7,2 pi 9,7 U / pl T4 DNA polymerase tot een eindvolume van 700 pi. Mengen en incuberen gedurende 40 minuten bij 37 ° C met draaiing (met Palico Biotech Intelli-Mixer RM-2L F8, 30 rpm, U = 50, u = 60). Voer alle volgende enzymatische reacties met de volgende stappen.
   • Verdunnen reactie buffers met nuclease-vrij water.
   • Voeg alle andere reagentia (met uitzondering van enzymen) tegen verdunde buffer.
   • Meng goed. Resuspendeer kralen / pellet met de reactie mix.
   • Voeg enzym om geresuspendeerd kralen / pellet (Keep enzymen op benchtop koelbox te allen tijde om een ​​maximale enzymatische activiteit te waarborgen).
   • Sluit de buis met parafilm.
   • Zorg ervoor dat de kralen zijn goed gemengd in de hele incubation.
3. Gooi reactiemengsel en afwassen resterende bufferzouten en enzymen driemaal met ijskoude wasbuffer (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl).

2. Ligatie van gebiotinyleerde Half-Linkers om ChIP DNA

Dit hoofdstuk van de video belicht de eigenschappen van de halve linker oligonucleotiden gebruikt bij de constructie van chia-PET en het gebruik van nucleotide barcode samenstelling te onderscheiden aspecifiek en specifieke ligatieproducten (13:28 tot 14:24) van de video). Het hoofdstuk toont ook de stap-voor-stap procedure voor het opzetten van een half-linker ligatiereactie (Stap 2.2, 14:24 tot 15:54 van de video).

Twee typen van gebiotinyleerde half-linkers die in dit protocol en zijn voorzien van een inwendige barcode vier nucleotiden (TAAG of ATGT) en een herkenningsplaats voor het restrictie-enzym van type IIS MmeI (TCCAAC). Na ChIP verrijkenment, gesoniceerd chromatine fragmenten gelijkelijk verdeeld in twee porties en geligeerd worden eerst met een overmaat van een half-linker A of half-linker B ^5,9.

1. Verdeel ChIP verrijkte parels in twee porties voor DNA-half-linker ligatie door gebiotinyleerd half-linkers A of half-linkers B respectievelijk. Deze twee half-linkers hebben dezelfde nucleotidesequenties, met uitzondering van vier nucleotiden in het midden die (Half-linker A met TAAG, de helft-linker B met ATGT) dienen als nucleotide barcodes. In combinatie tijdens nabijheid ligatie willekeurige en niet-specifieke ligaties tussen twee andere chip complexen kan uit de populatie van sequenties heterodimeer AB linkers in vergelijking met specifieke ligaties die van de populatie van sequenties geïdentificeerd homodimeer AA BB of linkers .
2. Ligeren ChIP verrijkte kralen 140 ul 5 x T4 DNA ligase buffer met PEG, 3,5 ul 200 ng / ul gebiotinyleerd half-linkers A of B, 553,5 pi nuclease-gratis water en 3 pl 30 U / pl T4 DNA-ligase (Keep T4 DNA-ligase op een benchtop koelbox te allen tijde als ligasen zijn instabiel, zelfs op het ijs). Sluit de buis met parafilm en incubeer overnacht bij 16 ° C met rotatie.

3. Elutie en Proximity Ligatie van ChIP DNA-fragmenten

Dit hoofdstuk van de video legt de rol van de Buffer EB, SDS en Triton X-100 tijdens de elutie van chromatine complexen van kralen en toont ook de stap-voor-stap procedure voor het opzetten van een circularization reactie (Stap 3.9, 15:54 tot 17:10 van de video).

Na ligatie van het half-linkers van de chromatine fragmenten, beide fracties gecombineerd en geëlueerd uit de korrels. Interactie DNA fragmenten worden dan met elkaar verbonden door een volledige linkersequentie in nabijheid ligatie.

Met behulp van de nucleotide barcode samenstelling, de sequenties kunnen worden ingedeeld in drie categorieën, te weten sequenties wie heterodimeer AB linkers (barcode ATGT / TAAG) en sequenties met homodimeer AA of BB linkers (barcode TAAG / TAAG of ATGT / ATGT) om niet-specifieke en specifieke ligatieproducten onderscheiden met respectievelijk ^9.

Derhalve wordt de toepassing van twee half-linkers van verschillende nucleotide streepjescodes specificatie van verschillende experimenten of duplo, alsmede controle niet-specifieke chimère ligatie snelheid tussen verschillende chip complexen ^5.

1. Driemaal wassen half-koppelstuk-geligeerde kralen met ijskoude wasbuffer (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl).
2. Combineren buizen half-koppelstuk-geligeerde kralen op de volgende wijze.
   • Terugwinnen een van de buizen van half-koppelstuk-geligeerde korrels met een magnetisch concentrator ("Tube A").
   • Houd de andere buis van een halve-linker-geligeerde kralen op ijs ("Tube B").
   • Gooi Was Buffer (van stap 3.2.1) from Tube A en half-linker-geligeerde kralen (van stap 3.2.2) van de buis B te zetten in Tube Een tijdje Tube A is nog steeds op de magnetische deeltjes verzamelaar.
   • Voeg 700 ul ijskoude wasbuffer te Tube B om het resterende half-linker-geligeerde kralen verzamelen en beide buizen van een half-linker-geligeerde kralen goed gecombineerd te garanderen. Breng de wasbuffer in Tube A. Gooi de lege tube B.
3. Fosforyleren half-koppelstuk-geligeerde korrels met 70 pi 10 x T4 DNA ligase buffer (NEB), 616 pi nuclease-vrij water en 14 pi 10 U / ul T4 DNA polynucleotidekinase. Incubeer 50 minuten bij 37 ° C met rotatie.
4. Reclaim gefosforyleerd half-linker-geligeerde kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator en gooi reactie mix.
5. Elueren half-koppelstuk-geligeerde chromatine-DNA complex met 200 ul vers bereide elutiebuffer (TE-buffer, 1% SDS). Gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (22 °C) met rotatie.
6. Breng eluaat naar een nieuwe buis en spoel kralen 900 ul Buffer EB. Breng supernatant van dezelfde buis aan de eluties combineren.
7. Overdracht verzameld eluaat de korffilterpapier twee centrifugebuis filters en centrifugeer bij 16.110 xg (13200 rpm) gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (22 ° C).
8. Sekwestreren SDS door het toevoegen van 90 pi 20% Triton X-100 en keer goed te mengen. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
9. Circularization wordt uitgevoerd onder extreem verdunde voorwaarden om ligatie gebeurtenissen voorkeur binnen de individuele cross-linked chromatine complexen, terwijl het minimaliseren ligatie gebeurtenissen tussen verschillende chromatine complexen die zou leiden tot ongewenste chimère DNA-moleculen. Werken op het ijs, over te dragen gedoofde eluaat in een 50 ml Falcon buis en voeg 7776 ul nuclease-vrij water, 1000 pi 10 x T4 DNA-ligase buffer (NEB) en 33,33 ul 30 U / pl T4 DNA-ligase. Incubeer overnacht bij 16° C.

4. Reverse-crosslinking en DNA-zuivering

Dit hoofdstuk van de video laat de stap-voor-stap procedure van fenol: chloroform-extractie (Stap 4.3, 17:11 tot 17:59) en de close-up van het ingehulde DNA na het centrifugeren in stap 4.4.

1. Omgekeerd crosslink eiwit en verminderde door toevoeging van 100 ul 20 mg / ml Proteinase K oplossing. Incubeer 2 uur bij 50 ° C.
2. Breng chromatine DNA in een 50 ml MaXtract High Density en voeg 9 ml nuclease-vrij water tot een eindvolume van 19 ml.
3. Voeg 19 ml 25:24:1 fenol-chloroform-isoamylalcohol pH 7,9 op de buis in een chemische dampkap en keer goed te mengen. Draai de buizen 5 minuten bij 1800 xg (3000 opm) bij kamertemperatuur.
4. Breng de bovenste waterige fase in een 50 ml Oak Ridge centrifugebuis (Teflon FEP) en neerslag chromatine DNA met 1,9 ml 3 M natriumacetaat pH 5,5, 19 ml isopropanol en 5 ul Glycoblue. Glycoblue toegevoegd om de zichtbaarheid van de pellet verbeteren.
5. Incubeer bij -80 ° C gedurende ten minste een uur. Laat de bevroren oplossing ontdooien voor centrifugeren bij 38.720 xg (18.000 rpm) gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
6. Na het centrifugeren van isopropanol neergeslagen DNA, DNA-pellet twee keer wassen met 75% ijskoude ethanol en resuspendeer DNA-pellet in 34 ul buffer EB. Overdracht DNA-mengsel in een 1,7 ml DNA LoBind buis.
7. Resuspendeer DNA-pellet in 34 ul buffer EB.
8. (RNase behandeling is optioneel als de daaropvolgende wassen en zuivering stappen in de Chia-PET-protocol dienen om te verwijderen vervuilende RNA en manuele inspecties van de Chia-PET-sequenties van onze in-house bibliotheken zijn geen sporen van besmetting van RNA weergegeven).
   • Voer RNase spijsvertering door de toevoeging van 10 ui RNase ONE 10 x Reaction Buffer, 55 ul nuclease-vrij water en 1 pi 10 U / pl RNase ONE Ribonuclease. Incuberen bij 37° C gedurende een uur.
   • Overdracht chromatine DNA in een 2 ml MaXtract met hoge dichtheid. Voeg 100 ul 25:24:1 fenol-chloroform-isoamylalcohol pH 7,9 op de buis in een chemische dampkap en keer goed te mengen. Draai de buis 5 minuten bij 16.110 xg (13200 rpm) bij kamertemperatuur (22 ° C).
   • Breng bovenstaande waterige fase naar een nieuwe buis neerslag reverse verknoopt DNA met 10 pl 3 M natriumacetaat pH 5,5 en 100 pl isopropanol. Incubeer bij -80 ° C gedurende 30 minuten en pellet DNA gedurende 30 minuten bij 16.110 xg (13200 rpm) bij 4 ° C.
   • Na het centrifugeren van isopropanol neergeslagen DNA, de DNA-pellet twee keer wassen met 75% ijskoude ethanol en resuspendeer DNA-pellet in 34 ul buffer EB.

5. Immobilisatie van Chia-PET DNA aan streptavidine Beads

De introductie van dit hoofdstuk vertelt over de aanwezigheidvan de MmeI erkenning site en de gebiotinyleerde T in de halve linker oligonucleotiden met de winning van de tag-linker-tag constructies ("huisdieren", 18:02 tot 19:10 van de video) te vergemakkelijken. Daarnaast is dit hoofdstuk van de video geeft ook een snel overzicht van stap 5.2, de stap-voor-stap procedure voor het opzetten van een PCR-reactie (Stap 6,1, 19:10 uur tot 20:00 uur van de video) en het uitsnijden van een succesvolle Chia-PET-DNA (Stap 6.9, 20:00 tot 20:30).

Half-linkers A en B bevatten flankerende MmeI herkenningsplaatsen, waardoor dit type IIS restrictie-enzym tot 18/20 baseparen geknipt stroomafwaarts van hun doelgroep bindingsplaatsen te kort "tags" van de chromatine fragment te produceren, het produceren van gepaarde tag-linker-tag constructies ("PET").

Om de zuivering van PET constructen inschakelen streptavidine-beklede magnetische korrels zowel half linker A en B worden gemodificeerd met biotine, waardoor vangen en zuivering van het chia-PET constructen.

1. Laat C losaptured chia-PET DNA door toevoeging van 5 pi 10 x NEBuffer 4, 5 ul vers bereid 500 uM (10 x) S-adenosylmethionine (SAM) en 1 pi 2 U / pl MmeI aan geresuspendeerde DNA. Quench overtollige MmeI door het toevoegen van 5 pi niet-gebiotinyleerd half-linkers de reactie mix voor MmeI kan zelf-remmend zijn in overmaat. Incubeer 2 uur bij 37 ° C.
2. Om uitgebracht Chia-PET-DNA, overdracht 50 ul van de geresuspendeerde M-280 streptavidine kralen vast te leggen aan een DNA LoBind buis. Tweemaal wassen kralen met 2 x Binden en wasbuffer (2 x B & W: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA 2 M NaCl). Hersuspenderen kralen in 50 pi 2 x B & W Buffer en overdracht 50 pi digestie mix (in stap 5.1) van dezelfde buis. Meng goed en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur met rotatie.
3. Reclaim kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator en gooi supernatant. Tweemaal wassen kralen 150 ul 1 x Binden en wasbuffer (1 x B & W: 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl).
4. Reclaim kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator en gooi supernatant. Driemaal wassen kralen met 150 ul 1 x B & W Buffer.
5. Nick vertalen Chia-PET-DNA met 5 pi 10 x NEBuffer 2, 2,5 ul 10 mM dNTPs, 38,5 ul nuclease-vrij water en 4 pl 10 U / pl Escherichia coli DNA-polymerase I incubeer overnacht bijkamertemperatuur (22 ° C) met rotatie.
6. Reclaim kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator en gooi supernatant. Driemaal wassen kralen met 150 ul 1 x B & W Buffer.
7. Resuspendeer kralen met 50 ul buffer EB.

6. Versterking van Chia-PET DNA

1. Stel PCR-reacties met 2 pl kralen vering, 21 ul nuclease gratis water, 1 ui 10 uM Illumina 1-454 primer, 1 ui 10 uM Illumina 2-454 primer en 25 ul Phusion High Fidelity Master Mix.
2. Om het aantal cycli nodig om voldoende PCR-producten voor sequencing gegenereerd moet worden, dat is opgericht drie test-PCR-reacties met 16, 18 en 20 cycli. Niet meer dan 20 cycli hebben wij gevonden dat dit leidt tot zeer lage bibliotheek complexiteit.

Eerste Stap	30 seconden	98 ° C	(Denaturatie)
18-25 cycli	10 seconden	98 ° C	(Denaturatie)
	30 seconden	65 ° C	(Annealing)
	30 seconden	72 ° C	(Verlenging)
Laatste stap	5 minuten	72 ° C	(Laatste extensie)

3. Bepaal de laagst mogelijke cyclus aantal door het uitvoeren van de PCR-reacties op 4-20% gradiënt TBE gel en kleuring met SYBR Green I, waarbij de aanwezigheid van een band van 223 baseparen, dat de lengte van de chia-PET DNA.
4. Versterken de rest van de chia-PET DNA gebonden streptavidine korrels in een grote PCR met slechts PCR cycli mogelijk terwijl het verkrijgen van voldoende opbrengst sequentiebepaling.
5. Revordering kralen uit alle PCR-reacties met behulp van een magnetisch deeltje concentrator en het zwembad supernatant om twee nieuwe DNA-LoBind buizen. Precipiteren elke buis van het supernatans door toevoeging van 60 pl 3 M natriumacetaat, 2 pi GlycoBlue en 600 pi isopropanol samengevoegde reacties.
6. Incubeer bij -80 ° C gedurende 30 minuten. Centrifugeer op 16110 xg (13.200 rpm) gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
7. Na het centrifugeren van isopropanol neergeslagen DNA, was DNA-pellet met 75% ijskoude ethanol twee maal en resuspendeer DNA-pellet in 100 pi TE-buffer en 5 il 6 x laden kleurstof.
8. Verdelen PCR producten gelijkmatig in de putjes van een 6% TBE gel. Voer de gel in 1 x TBE buffer bij 200 V gedurende 35 minuten en vlek met SYBR Green I. Visualiseer de gel met een Dark Reader transilluminator.
9. Voorzichtig accijnzen de 223 bp band uit de gel en uit te voeren "gel Crush" DNA-extractie protocol als volgt:
   • Plaats weggesneden gel fragmenten in 0,6 ml microcentrifuge buizen die zijn op de bodem doorboord met een 21-G naald.
   • Plaats elke buis in een 1,5 ml schroefdop buis centrifuge bij 16.110 xg (13200 rpm) gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
   • Voeg 200 pi TE-buffer pH 8,0 tot elke buis en zorgen gel stukken volledig in het buffer.
   • Bevries op -80 ° C gedurende een uur en incuberen bij 37 ° C geroerd.
   • Overdracht elkaar gel stukken met de buffer in elke buis van de filter kop van een centrifugebuis filter en centrifugeer bij 16.110 xg (13200 rpm) gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
   • Spoel elk 1,5 ml buis met 200 ul TE-buffer pH 8,0 en overdracht spoelbuffer elk filter na voltooiing van de eerste rotatie.
   • Pool filter-through en neerslag met isopropanol.
   • Hersuspenderen DNA-pellet met 15 pi TE-buffer.

7. Kwaliteit te controleren eenD-versterking van Chia-PET DNA

1. Ga verder met kwaliteitscontrole met behulp van DNA-Agilent 1000 assay of Agilent een hoge gevoeligheid van DNA-test op Agilent Bioanalyzer 2100.
2. De elektroferogram van de Agilent DNA-test moet weergeven slechts een piek samen met een vlakke basislijn voordat u overgaat tot Illumina Genome Analyzer IIx sequencing.
3. Voorafgaand aan de Illumina Genome Analyzer IIx sequencing, Chia-PET DNA idealiter moet een minimale concentratie van 10 nM. Voer een 4-punts kwantitatieve PCR volgens Illumina qPCR Kwantificering Protocol Guide om de hoeveelheid van het monster te laden op de stroom cel te bepalen. Ook is, een een-punt kwantitatieve PCR als volgt:
   • Verdun de controle template tot 100 pM, 10 uur en dertien. Zoals beschreven in Illumina qPCR Kwantificering Protocol, is een controle-template gedefinieerd als een bibliotheek die is bereid voor het rangschikken van de Illumina-platform en het moet zoveel mogelijk gelijk op het vlak vantemplate grootte, GC-gehalte en een bibliotheek type.
   • Verdun de Chia-PET-DNA tot 10 uur.
   • Stel PCR drie exemplaren van elke verdunning met 0,1 ul qPCR Primer 1,1, 0,1 ul qPCR Primer 2.1, 5 pi LightCycler480 DNA SYBR Green I Master Mix, 3,8 ul nuclease-vrij water en 1 pl sjabloon met Roche Applied Science LightCycler 480 Real-Time PCR-systeem. Omvatten twee negatieve controles met 1 pi nuclease-vrij water als sjabloon.
     • Initiële denaturatie
       • 95 ° C 5 minuten 4,8 ° C / s
     • Versterking
       • 95 ° C 10 seconden 4,8 ° C / s
       • 60 ° C 1 minuut 2,5 ° C / s
       • 72 ° C 30 seconden 4.8 ° C/ S
     • Smeltcurve
       • 95 ° C 5 seconden 4,8 ° C / s
       • 65 ° C 1 minuut 2,5 ° C / s
       • 95 ° C 5 overnames per ° C
     • Koeling
       • 40 ° C 10 seconden 2,0 ° C / s
   • Zorg ervoor dat de negatieve controles geen versterking te laten zien en dat de standaarddeviatie voor de Ct-waarde is minder dan 0,1 voor de berekening van de concentratie van de bibliotheek templates gebaseerd op de standaard curve gegenereerd op basis van de controle template verdunningen.
4. Genereer clusters op het oppervlak van Illumina stroom cellen door het laden van 13u05 into Illumina CBOT Cluster Generation System volgens de aanwijzingen op het scherm.
5. Ga verder om de sequentie van Chia-PET-DNA op Illumina Genome Analyzer IIx met behulp van Illumina 3-454 sequencing primer en Illumina 4-454 sequencing primer in een enkele rijstrook om de kwaliteit van de bibliotheek te zien. Bewaar overgebleven Chia-PET-DNA bij -20 ° C. Als de bibliotheek goede gegevens bereiden monster extra punten van 4 tot 8 banen nodig op het monster baan resultaten van 18 tot 20 miljoen unieke gelezen verkrijgen.
   • De hoeveelheid van Chia-PET DNA geladen op de stroom cellen is sterk afhankelijk van de versie van de sequencing data-analyse software, volgorderegeling Illumina's Studio. Voor versie 2.9, de laad-concentratie varieert van een derde tot de helft van de maximale capaciteit van elke tegel, wat neerkomt op ongeveer 21 miljoen gefilterde pas leest met circa 9,5 miljoen leest van huisdieren.
   • Lagere belasting is nodig om ervoor te zorgen de juiste base-bellen fof barcode sequenties van de linkers. Deze fout treedt op wanneer een groot aantal soortgelijke nucleotiden sequentie, zoals het geval is wanneer de linker is sequentie te verkrijgen barcode informatie. Als barcoding informatie niet gewenst de linkers zijn niet gelezen, dan volledige lading concentratie kan worden gebruikt.
6. De qSeq bestanden omgezet door de offline basis beller kan verder worden geanalyseerd met behulp van de Chia-PET gereedschap volgens de Chia-PET Tool installatie handleiding (versie 4.1) ^8.

C. Vertegenwoordiger Chia-PET-resultaten

We succes geconstrueerd chia-PET bibliotheken met RNA polymerase II antilichaam (8WG16) in MCF-7 cellen (CHM160 en CHM163) ⁹ met 672 ng ChIP materiaal als boven beschreven. De eerste diagnostische gel draaien van deze PCR-geamplificeerd bibliotheek, zoals vermeld in stap 6.2 van de Chia-PET-protocol, verschijnt een heldere en goed gedefinieerde bandde verwachte grootte van 223 basenparen voor alle PCR-fietsen gebruikt (zie figuur 4).

16 PCR cycli werd gebruikt om de chia-PET bibliotheek amplificeren en een totale opbrengst van 17,1 ng werd verkregen. Een intense piek elektroferogram werd waargenomen bij de verwachte grootte van 223 basenparen via Agilent 1000 DNA-analyse als vermeld in stap 7.1 van de chia-PET protocol (zie figuur 5).

Figuur 1. ChIP overzicht. MCF-7 cellen dual verknoopt met ethylglycol bis (SuccinimidylSuccinate (EGS) en formaldehyde elkaar, waardoor covalente koppelingen tussen spatieel naburige chromatine. Het verknoopte chromatine werd verkregen van de vaste MCF-7 cellen door cellyse en nucleaire lysis. de chromatine werd vervolgens onderworpen aan fragmentatie een grootte bereik van 200-600 basenparen. Na gesoniceerd chromatine met Protei vooraf opruimenn G magnetische korrels van niet-specifieke DNA te verwijderen, de pre-goedgekeurde chromatine werd 's nachts geïmmunoprecipiteerd met antilichaam-gecoate kralen om chromatine van belang vast te leggen.

Figuur 2. Gel analyse van gesoniceerde chromatine fragmenten. Een 100 bp DNA ladder is te zien in de eerste en laatste baan voor maat referentie. De gesoniceerde chromatine weergegeven sterke intensiteit tussen de 200 en 600 bp, die is ideaal om lange afstand chromatine interacties vast te leggen.

Figuur 3. Chia-PET-overzicht. Gefragmenteerde chromatine fragmenten zijn end-stomp en geligeerd aan gebiotinyleerd half-linkers met flankerende MmeI restrictieplaatsen. Intact chromatine complexen worden dan geëlueerd uit de kralen en onderworpen aan de nabijheid ligatie onder extreem verdunde omstandigheden, zodanig dat de interactie DNA-fragmenten zijn preferentially geligeerd aan elkaar. Na reverse verknoping DNA-geassocieerde eiwitten te verwijderen, MmeI digestie uitgevoerd om tag-linker-tag (PET) constructen, die vervolgens gezuiverd door selectieve binding aan streptavidine korrels vrij. De PET constructen worden geligeerd adapters voor high-throughput sequencing.

Figuur 4. Gelanalyse van chia-technologieën na PCR amplificatie. Een 25 bp DNA ladder wordt in laan 1 en 5 maat referentie. Lanen 2 en 4 zijn PCR-producten als na 16, 18 en 20 cycli van PCR-amplificatie van 2 ul van korrel-geïmmobiliseerde template, respectievelijk. Dit is een succesvolle bibliotheek, zoals aangegeven door de heldere, goed gedefinieerde balken verwachte grootte van 223 bp. De niet-specifieke uitstrijkjes wordt gegenereerd wanneer het aantal PCR-cycli wordt verhoogd, terwijl de laagste band van elke PCR-reactie wordt uit primer dimeren.

Figuur 5. Agilent 2100 Bioanalyzer analyse van gezuiverd Illumina-454-adapter-geligeerd Chia-PET. Screen capture van Agilent 2100 Bioanalyzer elektroferogrammen profileren van een succesvolle bibliotheek, met een piek op de verwachte grootte van 223 bp. Merk op dat de Agilent Bioanalyzer assay gewoonlijk een wat hogere dan verwachte grootte meldt, in dit geval de gewenste piek wordt op 237 bp plaats van 223 bp. Dit is in het 10% fout bereik van de Agilent assay.

Discussion

Chia-PET is een methode ontwikkeld om lange afstand interacties in transcriptieregulatie te identificeren. Een van de kritische factoren die de kwaliteit van een Chia-PET-bibliotheek te bepalen, is de kwaliteit van ChIP materiaal.

Het protocol in beeld omvat het gebruik van EGS en formaldehyde te verknopen de cellen. Het gebruik van formaldehyde gecombineerd met een tweede reagens verknopen met een langere spacer arm kunnen helpen bij de binding van eiwitten die niet kunnen worden gebonden formaldehyde alleen ^3,11,15. Wij hebben gebouwd bibliotheken met deze methode, die hebben aangetoond robuuste bindingsplaatsen en lange afstand interacties ^9. Echter, de verknoping en chip voorwaarden moet worden geoptimaliseerd voor elke factor van belang, en het is belangrijk niet te over-crosslink als te veel verknoping zal resulteren in problemen met fragmentatie door sonicatie, en mogelijk kan resulteren in valse chromatine interacties . Chromatine interactiesgeïdentificeerd door Chia-PET moet gevalideerd worden door een andere methode, zoals fluorescentie in-situ hybridisatie ^4.

We raden een minimum van 100 ng van chromatine materiaal. Hoewel we hebben gebouwd van goede kwaliteit bibliotheken uit 50 ng van chromatine materiaal, hebben we vastgesteld dat grote hoeveelheden uitgangsmateriaal mag de bouw van Chia-PET bibliotheken met minder dan 16 PCR-cycli, om zo amplicons en redundantie van elke bibliotheek. Deze lagere redundantie geassocieerd met meer unieke toegewezen labels en een hoog percentage aan gegevens, waardoor een vollediger chromatine interactie kaart met minder banen van sequencing. De laatste verpakt volume van kralen in elke buis moet 50 pl en 100 ul voor magnetische en Sepharose kralen respectievelijk. Als het verpakte kraal volume kleiner is dan aangegeven, te brengen tot het minimum vol volume met dezelfde pre-goedgekeurde blanco magnetische of Sepharose kralen om het verlies van DNA-dragende kraal een minimum te beperkens in latere stappen. Afgezaagde tips of grote-core tips moet worden gebruikt voor het pipetteren Sepharose kralen.

De volgende wijzigingen zijn verwerkt naar aanleiding van de eerder gepubliceerde Chia-PET-protocol ^5. Ten eerste zijn magnetische G kralen die voor de monsterneming verlies te minimaliseren tijdens het wassen. Bovendien identificeerden we niet-specifieke banden met afmetingen van ongeveer 100 bp en 138 bp zijn amplicons van zelf-geligeerde half-linkers en / of adapters. Daarom hebben we verminderde concentratie van gebiotinyleerde half-linkers en 454 GS20 adapters niet-specifieke banden minimaliseren PCR amplificatie. De nabijheid ligatie volume werd teruggebracht van 50 ml tot 10 ml tot monster verlies te minimaliseren tijdens de daaropvolgende zuivering stappen en ook besparen op de kosten reagens. We hebben ook verhoogde de incubatietijd naar Chia-PET DNA geïmmobiliseerd om de parels tot de maximale vangst van Chia-PET-DNA op de streptavidine kralen te garanderen.

In de nabijheid ligatie stap chimère ligaties that niet het ware in vivo chromatine interacties onvermijdelijk opgewekt in een niet-specifieke en willekeurige wijze. Derhalve de kwaliteit van gegevens van een chia-PET experiment evalueren, wordt de snelheid van chimerisme geschat uit het gebruik van twee verschillende halve linkers specifieke nucleotide barcodes TAAG en ATGT ^5. Na high-throughput sequencing, de chia-PET sequenties eerst geanalyseerd linker barcode samenstelling en sequenties afgeleid van specifieke ligatieproducten en aspecifieke ligatieproducten onderscheiden ^8. Het percentage van bekende hersenschimmen (dat wil zeggen heterodimeren AB linkers) die aanwezig zijn in onze in-house MCF-7 RNA polymerase II Chia-PET bibliotheken is minder dan 15%.

Chia-PET-sequenties worden vervolgens ingedeeld in twee categorieën, namelijk zelf-ligatie de persoonlijke levenssfeer en inter-ligatie levenssfeer. Self-ligatie Huisdieren zijn verkregen uit zichzelf circularization ligatie van de chromatine fragmenten en daarbij onder-ligatie Huisdieren zijn afgeleid van inter-ligatie tussen twee DNA-fragmenten. Dit laatste is dan onderverdeeld in drie verschillende categorieën op basis van de genomische afstand van elke tag op hetzelfde chromosoom (intrachromosomale inter-ligatie PET's) of dat beide tags zijn toegewezen aan twee verschillende chromosomen (interchromosomal inter-ligatie huisdieren). We hebben een Chia-PET hulpmiddel softwarepakket te sorteren op de verschillende categorieën ^8. Dit wordt gebaseerd op DNA-fragmenten die in de bibliotheek. In het algemeen zal kleiner ChIP fragmenten geven een hogere resolutie en de afgesneden voor deze RNA-polymerase II Chia-PET bibliotheken is ongeveer 4 kb.

Bovendien echte chromatine interacties kunnen worden onderscheiden van ruis door telling van het aantal onderling ligatie technologieën in een interactie cluster, met andere woorden een cluster van hoge PET aantal aldus een hogere kans een echt chromatine interactie ⁸ hebben .

Om onze valse positieven te filteren eenstijgen van hoog verrijkt ankers die onder-ligatie persoonlijke levenssfeer kunnen vormen door toeval, heeft een statistische analyse kader ook is geformuleerd om goed voor willekeurige vorming van een inter-ligatie gezelschapsdieren tussen twee ankers ^8.

Kortom, de Chia-PET-techniek maakt het mogelijk in kaart brengen van chromatine interactie netwerken op een wereldwijde schaal. De implementatie van ChIP in Chia-PET kan de vermindering van de bibliotheek complexiteit en achtergrondgeluiden. Bovendien ChIP voegt specificiteit van chromatine interacties, waardoor het onderzoek van specifieke chromatine interacties bij bepaalde transcriptiefactoren ^5.