Summary
גילוי מוקדם של אפופטוזיס עשוי לזהות אוכלוסיות בסיכון סלולריים במגוון רחב של מחלות. כאן אנו מראים שיטה לקשר חלבון מוקדם אפופטוזיס איתור (Annexin V) כדי nanoparticle-MRI לגילוי תחמוצת ברזל (SPIO). שיטה זו עשויה להתארך עד חלבונים אחרים בעלי עניין לייצר-MRI לגילוי בדיקות הדמיה מולקולרית.
Abstract
אפופטוזיס נייד הוא מאפיין בולט של מחלות רבות, וזה מוות תאים מתוכנת מתרחשת בדרך כלל לפני הביטויים הקליניים של המחלה ניכרות. אמצעי לזהות אפופטוזיס הראשונים שלה, בשלבים הפיך היה להרשות לעצמו קדם קליניים "חלון" שבמהלכו אמצעי מניעה או טיפול שניתן לנקוט כדי להגן על הלב מפני נזק בלתי הפיך. אנו מציגים כאן שיטה פשוטה חזקים כדי להטות האדם Annexin V (ANX), אשר נקשר לתאי בשקיקה אותם בשלבים הראשונים הפיך של אפופטוזיס, לגהץ פאראמגנטי תחמוצת (SPIO) חלקיקים, המשמשים כסוכן-MRI לגילוי ניגוד. שיטת הצמידה מתחיל חמצון של חלקיקים SPIO, אשר מתחמצנים קבוצות carboxyl על הקליפה פוליסכריד של SPIO. מטוהרים חלבון ANX נוסף ואז במסגרת של פתרון נתרן borate כדי להקל על האינטראקציה קוולנטי של ANX עם SPIO במאגר צמצום. השלב האחרון עם ירידה borohydrid נתרןהדואר מתבצעת על מנת להשלים את הירידה, ואז התגובה היא הרווה. ANX Unconjugated יוסר תערובת ידי סינון microcentrifuge. גודל והטוהר של המוצר ANX-SPIO מאומת על ידי פיזור אור דינאמי (DLS). שיטה זו אינה דורשת בנוסף, או שינוי, פוליסכריד SPIO פגז, בניגוד צולבים תחמוצת ברזל החלקיקים שיטות לצמידה או ביוטין, שכותרתו חלקיקים. כתוצאה מכך, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה, חזקה כי ניתן להאריך את הצמידה של חלבונים אחרים בעלי עניין.
Protocol
מעובד מתוך מחקר לפני 1.
1. נטיה של Annexin V כדי SPIO
- לחמצן חלקיקים SPIO (האוקיינוס ננוטק Inc, 5 מ"ג / מ"ל) עבור 1 שעה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בחושך בתמיסה עם 0.15 מ 'נתרן periodate (NaIO 4) (4:01 משקל: יחס משקל) 2.
- דגירה SPIO חמצון במשך שעה עם 12 מטוהרים חלבון ANX (1:1 יחס, משקל: משקל) ב borate M 0.15 נתרן (Na 2 B 4 O 7 10 שעות 2 O) בשעה 20 ° C.
- מנמיכים את תערובת נוספת שעה 1 עם borohydride נתרן (NaBH 4) מתחת למכסה המנוע קטר ואז להרוות עם 0.15 מ 'טריס-HCl.
- הפרד ANX ללא ANX-SPIO ידי צנטריפוגה ב XG 14,000 (75 נקבוביות מיקרומטר Microcon מסנן, Millipore, Billerica, MA).
- לחדד עוד יותר את המתחם על ידי הסרת זיהומים מאוגד באמצעות מכשיר מפריד מגנטי (האוקיינוס ננוטק, Inc).
- לכמת את retentate מסנן (ANX-SPIO) רמות החלבוןעל ידי assay חלבון ברדפורד וחנות ב -80 ° C ב 2 מ"ג / מ"ל 0.1 M Tris-HCl עם 1% מעכבי פרוטאז אלבומין בסרום (פרוטאז האלט מעכב, Thermo Scientific, 1-50 מ"ג / ANX מ"ג).
2. פיזור אור דינאמי
- בנפרד לדלל את SPIO ANX ו-SPIO ב PBS צפיפות אופטית של 0.1 ולנתח ידי פיזור אור דינאמי על מכונת ננו DLS Zetasizer (Malvern בע"מ, ווסטרשייר, בריטניה) 3.
- להשיג פסגות monomodal (באופן אידיאלי) עבור המתחם, בגודל Z-הממוצע החלקיקים ואת ראשי polydispersity (PDI). תשוו את זה גודל לגודל DLS-מדודה של nanoparticle תחמוצת ברזל בלבד. ANX-SPIO תוצאות DLS הראה חלקיק המצומד הידרודינמית בקוטר של 78 ננומטר עם פ"ד של 0.13 1, המשקף הומוגניות ANX-SPIO המינים 3.
3. תרבית תאים, אינדוקציה של אפופטוזיס בתרבות, ו-MRI של תאים בתרבית
- למבוגרים תרבות העכבר מח עצם של mesenchymalתאים TEM (mMSCs) ב DMEM השלימו עם 10% ו 1% FBS פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, Inc), רצוי במעבר 20-30 אפריל.
- לגרום אפופטוזיס בתאי תרבית ידי טיפול עבור משתנה פעמים ב 37 ° C עם DOX (Sigma, 1 מ"מ מלוחים 0.9%, ריכוז 1 מיקרומטר בתקשורת) 12.
- לכמת את כמות אפופטוזיס בתרבות או באמצעות MRI עם ANX-SPIO (המתואר 3.4 להלן) או באמצעות מיקרוסקופ לאחר TUNEL כתם (APO-BrdUTM TUNEL Assay קיט, בדיקות מולקולריות / Invitrogen, יוג'ין, OR) או אחריו כתם עם ANX-FITC (Roche, שוויץ).
- לתייג את התאים עם ANX-SPIO (10 חלבון / mL מ"ג בינוני למעט כאמור), או עם משקל שווה ערך חינם SPIO (5 מ"ג), במשך 15 דקות ב 37 ° C. לשטוף 4 פעמים עם PBS, וכן כיסוי עם 1 מ"ל של agarose 1% כדי למנוע דיפוזיה של חלקיקים SPIO. לבצע בדיקת MRI של המנות (כמתואר בהמשך). לחלופין, לשטוף את התאים לאחר trypsinize DOX ANX ו-SPIO תיוג, ואז לאפשר לתאיםיוצרים כדורי ב Eppendorf צינורות.
4. במבחנה MRI
- השתמש 1.5 או 3 טסלה GE Signa סורק Excite עם סליל המקלט תקן הברך בניתוח MRI חוץ גופית.
- מניחים את הכלים תרבות או צינורות לתוך רפאים אגר, ואת התמונה, תוך שימוש ברצף הדרגתי, הד שיפוע מפונק: זמן החזרה (TR) 550 מילישניות, זמן אקו (TE) 10 ms, זווית להעיף 15 °, מטריקס 256 x 256, שדה של נוף 3 ס"מ X 3 ס"מ, עובי פרוסת 1.3 מ"מ, מספר ממוצעים (NEX) 2, 0 המרווח 5 מ"מ. תמונה axially דרך שכבת תאים בצלחת על אובדן האות * T2, תוך שימוש באזורים של ריבית (ROIs) של אזור קבוע (למשל, 0.8 מ"מ 2). להתאים את הרקע באמצעות אותות בקרה ROI מ רפאים אגר. למדוד את רעשי הרקע של האות האוויר המקיף את הפנטום.
- חישוב יחס ניגודיות MRI לרעש (CNR: [SI SI-ROI מדגם השליטה ROI] / [SD של SI של רעשי רקע], שם SI היא עוצמת האות,SD הוא סטיית התקן) חושב על כל מאכל התרבות.
5. נציג תוצאות
מדידה של אובדן * האות T2 במבחנה דורש פנטום אגר הומוגנית וחוסר בועות אוויר, אשר תיצור חלל חפץ האות. ממצא זה קשה להבחין בין אובדן אמיתי * T2 האות של SPIO, הוא קריטי לתוצאות לפירוש. אנא ראה איור 1 למשל של חפץ האוויר כמו גם תחמוצת ברזל אמיתי T2 * אובדן האות.
עבור הדמיה מנה חוץ גופית התרבות, החל נפח מתאים של ג'ל אגר לצלחת בכל תרבות, כך מספיקות פרוסות ה-MRI צירית, שהם כ 1 מ"מ עובי, ניתן לבצע את התמונה כראוי את המנה כולה. איור 2 ממחיש את האות הצפוי MRI מצלחות תרבות בודדים אגר. יש בדרך כלל איזו וריאציה האות בשולי הצלחת, לכן ניתוח של אזורים של interest יש להימנע באזורים אלה לא אחידים.
באיור 1. ANX-SPIO מזהה אפופטוזיס בתרבית cardiomyocytes חולדה היילודים. איור 1 א מציג תמונה של cardiomyocytes היילודים pelleted שטופלו פתרון שליטה (צינור משמאל), ANX-SPIO (צינור באמצע), ו-DOX + ANX SPIO (צינורית מימין) . הערה צבע חום של DOX + ANX-SPIO תאים שטופלו, המשקף שמירה מוגברת של המתחם ANX-SPIO בתאים אפופטוטיים. 1B איור בתמונות חוץ גופית ה-MRI הראו אינטנסיבי T2 * אובדן האות של + DOX ANX-SPIO תאים. כמו כן, בועת אוויר נתפס בין ה 4 ו 5 th Eppendorf צינורות (אות קטנה חלל שחור), אשר דומה הריק את האות של ANX-SPIO, ואשר יכול להשפיע על ניתוח של CNR.
איור 2. ANX-SPIOמחייב הוא ספציפי של תאים אפופטוטיים בתרבות. 2A איור מדגים cardiomyocytes חולדה אפופטוטיים היילודים על הכלים תרבות, נתון מכתים ANX-FLUOS או ANX-SPIO מכתים, עם ריכוז נמוך וגבוה (ימינה ושמאלה, בהתאמה) של ANX-SPIO. הערה אחרת T2 * אובדן האות (סיגנל שחור) של תאים אפופטוטיים כי טופלו ANX ניאון (ANX-FLUOS) ורמות נמוכות לעומת רמות גבוהות של ANX-SPIO. יותר T2 * אובדן האות בצד ימין קשורה האות ANX-FLUOS מופחת במידה ניכרת, אשר התחרו את ידי ASX-SPIO ריכוזים גבוהים יותר. איור 2B מדגים מחייב התחרותי של ANX-SPIO לעומת ANX-FLUOS האות דיסוציאציה קבוע, K i. ציר ה-X מציין את ריכוז החלבון Annexin בהיקף יומן.
סרט 1. לחץ כאן כדי להציג משלימההסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת הצמידה תיאר לקישור SPIO כדי Annexin V מנצל את שרשרת לוואי אמין קבוצות Annexin ואת moieties carboxyl של nanoparticle SPIO. דרך הפחתת חמצון צעדים ספציפיים, הצמדה קוולנטי של תרכובות אלה ניתן להשיג, ואת nanoparticle פונקציונליות וכתוצאה מכך יכול להיות מבודד. שיטה זו עשויה להכליל את חלבונים אחרים חלקיקים של עניין.
השלבים הקריטיים ביותר הם חמצון והפחתת התנאים, שבוצעו הטמפרטורות מתאימות עם ערבוב עדין. תשואה נמוכה עשויה לנבוע חמצון חלקי או ירידה, שתוצאתה שיורית חינם Annexin V כי יוסר במהלך שלב הסינון. כאשר מוחל על חלבונים אחרים בעלי עניין, תנאים אופטימליים עשויים להשתנות מאלה שתוארו לעיל. עם זאת, לאחר אותם תנאים אופטימליים מוגדרים, חלבון ללא סינון עלול להקטין את כמות זניחה, ועל כן, סינון מ microcentrifugeאיי להיות מיותר. אכן, סינון יתר עשויה להפחית התשואה מתחם הסופי בשל מחייב ספציפי של המסנן עצמו. במקרה כזה, לפני סינון 1% אלבומין דרך המסנן תפחית מחייב ספציפי של המתחם מצומדות כדי סינון לשפר את התשואה. DLS ניתוח של המתחם האחרון, גם מדידות ריכוז החלבון של תסנין, יסייע לקבוע אם חלבון ללא שארית הוא ההווה.
הנוכחות של SPIO חינם במתחם האחרון הוא גם זיהום פוטנציאלי. לשם כך, DLS הועסק כדי לבדוק טוהר. השיא monomodal ידי DLS מסייעת להבטיח תחמוצת מין יחיד ברזל. חינם SPIO לבד מייצר שיא DLS ברורה על 46nm ולא היה נוכח ANX-SPIO ההכנות.
מספר אפשרויות bioconjugation הם 6-12 זמין אשר מפעילים את מנגנוני צמודים חלופיים, כגון אינטראקציה, ביוטין streptavidin או חלבון cross-linking של na אישיתnoparticles. השיטה המוצגת כאן מייצג גישה חזק, ישים נרחב נטיה של חלקיקים מגנטיים לחלבונים של עניין, ללא שימוש חלקיקים מיוחדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
המכונים הלאומיים לבריאות, NHLBI (RD, PY, PS).
איגוד הלב האמריקני (JL).
סטנפורד, VPUE גרנט (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
