Summary
Tidlig detektion af apoptose kan identificere udsatte cellepopulationer i en række forskellige sygdomme. Her viser vi en metode til at forbinde en tidlig apoptose-påvisning protein (Annexin V) til et MRI-detekterbart jernoxid nanopartikler (SPIO). Denne metode kan udvides til andre proteiner af interesse at generere MRI-detekterbare molekylær billeddannelse sonder.
Abstract
Cellulær apoptose er et fremtrædende træk ved mange sygdomme, og dette programmeret celledød forekommer typisk, før de kliniske manifestationer af sygdommen er tydelige. Et middel til at påvise apoptose i sine tidligste, reversible etaper vil give en præklinisk 'vindue' i løbet af hvilke forebyggende eller terapeutiske kunne træffes foranstaltninger for at beskytte hjertet fra permanente skader. Vi præsenterer heri en enkel og robust metode til at konjugere human Annexin V (ANX), som ivrigt binder til celler i de tidligste og reversible stadier af apoptose, at superparamagnetisk jernoxid (SPIO) nanopartikler, der tjener som et MRI-detekterbart kontrastmiddel. Konjugeringen Fremgangsmåden begynder med en oxidation af SPIO nanopartikler, som oxideres carboxylgrupper på polysaccharidet skallen af SPIO. Oprenset ANX protein tilsættes derefter i omgivelser med en natriumboratopløsning at lette kovalent interaktion ANX med SPIO i en reducerende buffer. En endelig reduktion skridt med natrium borohydride er udført for at fuldføre reduktionen, og hvorefter reaktionen standses. Ukonjugeret ANX fjernes fra blandingen ved mikrocentrifuge filtrering. Størrelsen og renheden af ANX-SPIO produkt bekræftes ved dynamisk lysspredning (DLS). Denne fremgangsmåde kræver ikke tilsætning til eller ændring af polysaccharidet SPIO skallen, i modsætning til tværbundne jernoxidpartikel konjugationsfremgangsmåder eller biotin-mærkede nanopartikler. Som et resultat er denne fremgangsmåde en enkel, robust fremgangsmåde, som kan udvides til konjugering til andre proteiner af interesse.
Protocol
Tilpasset fra tidligere undersøgelse 1.
1. Konjugering af Annexin V SPIO
- Oxidere SPIO partikler (Ocean Nanotech Inc., 5 mg / ml) i 1 time ved 20 ° C i mørke i opløsning med 0,15 M natriumperiodat (NalO4) (04:01 vægt: vægt-forhold) 2.
- Inkubér oxiderede SPIO i 12 timer med oprenset ANX protein (1:1, vægt: vægt) i 0,15 M natriumborat (Na2 B4 O 7 10H H2O) ved 20 ° C.
- Reducere blandingen i yderligere 1 time med natriumborhydrid (NaBH4) i stinkskabet og derefter slukke med 0,15 M Tris-HCI.
- Adskille frit ANX fra ANX-SPIO ved centrifugering ved 14.000 x g (75 um porestørrelse Microcon filter, Millipore, Billerica, MA).
- Yderligere at forfine forbindelsen ved at fjerne ubundne urenheder under anvendelse af en magnetisk separator enhed (Ocean Nanotech, Inc.).
- Kvantificere filteret retentatet (ANX-SPIO) proteinniveauerved Bradford-proteinassay og opbevares ved -80 ° C ved 2 mg / ml i 0,1 M Tris-HCI med 1% serumalbumin og proteaseinhibitorer (Halt Protease Inhibitor, Thermo Scientific, 1-50 mg / mg ANX).
2. Dynamisk lysspredning
- Separat fortyndes SPIO og ANX-SPIO i PBS til en optisk densitet på 0,1 og analysere ved dynamisk lysspredning i en Zetasizer Nano DLS-maskine (Malvern Inc., Worcestershire, England) 3.
- Opnåelse monomodale toppe (ideelt set) for forbindelsen, med en Z-gennemsnitlig partikelstørrelse og polydispersitetsindeks (PDI). Sammenligne denne størrelse med DLS-målte størrelse af jernoxid nanopartikel alene. ANX-SPIO DLS Resultaterne viste en konjugat partikel hydrodynamisk diameter på 78 nm med en PDI på 0,13 1, hvilket afspejler en homogen ANX-SPIO arter 3.
3. Cell Culture, induktion af apoptose i kultur, og MRI af dyrkede celler
- Kultur voksen museknoglemarv mesenchymale stem-celler (mMSCs) i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen, Inc.), fortrinsvis ved passage April 20-30.
- Inducere apoptose i dyrkning af celler ved behandling i varierende tidsrum ved 37 ° C med DOX (Sigma, 1 mM i 0,9% saltvand, 1 uM koncentration i mediet) 12.
- Kvantificere mængden af apoptose i kultur ved hjælp af enten MRI med ANX-SPIO (beskrevet i 3,4 nedenfor) eller ved hjælp af mikroskopi efter TUNEL farvning (APO-BrdUTM TUNEL Assay Kit, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) eller efter pletter med ANX-FITC (Roche, Schweiz).
- Mærke cellerne med ANX-SPIO (10 mg protein / ml medium, bortset fra som bemærket), eller med en ækvivalentvægt på fri SPIO (5 mg), i 15 minutter ved 37 ° C. Vask 4 gange med PBS, og overlejring med 1 ml 1% agarose for at forhindre diffusion af SPIO nanopartikler. Udfør MRI af pladerne (beskrevet nedenfor). Alternativt vaskes cellerne og Trypsinisér efter DOX og ANX-SPIO mærkning derefter tillade cellerne atdannelse af pellets i Eppendorf-rør.
4. In vitro MRI
- Brug en 1,5 eller 3 Tesla GE Signa EXCITE scanner med standard knæ modtagerspole for in vitro-MRI-analyse.
- Placer dyrkningsskålene eller rør i en agar fantom, og billedet ved hjælp af en gradient-ekko forkælet gradient rækkefølge: Gentagelse Time (TR) 550 ms, Echo Time (TE) 10 ms, flipvinkel 15 °, matrix 256 x 256, felt- of-view 3 cm x 3 cm, snittykkelse 1,3 mm, antal gennemsnit (NEX) 2, afstand 0 mm 5. Billede aksialt gennem cellen lag på pladen T2 * signaltab, under anvendelse regioner af interesse (ROI'er) af et fast område (for eksempel 0,8 mm 2). Juster til baggrund ved hjælp af kontrol investeringsafkast signal fra agar fantom. Måle baggrundsstøj fra signalet af den omgivende luft fantom.
- Beregn MRI Kontrast-til-støjforhold (CNR: [SI prøve ROI-SI-kontrol investeringsafkast] / [SD af SI af baggrundsstøj], hvor SI er signalintensitet, ogSD er standardafvigelsen) blev beregnet for hver dyrkningsskål.
5. Repræsentative resultater
Måling af T2 * signaltab in vitro kræver en homogen agar fantom og manglen af luftbobler, hvilket vil skabe signal ugyldige artefakt. Dette artefakt er vanskelig at skelne fra ægte T2 * signal tab af SPIO, og er afgørende for fortolkelige resultater. Se figur 1 for et eksempel på en luft artefakt samt ægte jernoxid T2 * signaltab.
Til in vitro dyrkningsskål billeddannelse anvende en passende volumen af agargel hver dyrkningsskål, således at tilstrækkelig aksial MRI skiver, som er cirka 1 mm tykt, kan foretages passende afbilde hele skålen. Figur 2 illustrerer den forventede MRI-signalet fra individuelle dyrkningsplader i agar. Der er typisk et signal variation ved kanterne af pladen, så analyse af regioner intpåløbne renter bør undgå disse ujævne områder.
Figur 1. ANX-SPIO detekterer apoptose i dyrkede neonatale rotte cardiomyocytter. Figur 1A viser et billede af pelleterede neonatale cardiomyocytter behandlet med kontrol-opløsning (til venstre rør), ANX-SPIO (midterrøret) og DOX + ANX-SPIO (højre rør) . Bemærk brunlig farve af DOX + ANX-SPIO behandlede celler, som afspejler forøget retention af ANX-SPIO forbindelse i apoptotiske celler. Figur 1B In vitro MRI-billeder viser intense T2 * signaltab af DOX + ANX-SPIO celler. Desuden er en luftboble ses mellem 4. og 5. Eppendorf-rør (lille sort signal hulrum), som svarer til signalet tomrum af ANX-SPIO, og som kan påvirke analysen af CNR.
Figur 2. ANX-SPIObindingen er specifik for apoptotiske celler i kultur. Figur 2A viser apoptotiske neonatal rotte cardiomyocytes på dyrkningsskåle, udsat for enten ANX-FLUOS farvning eller ANX-SPIO farvning med lave og høje koncentrationer (venstre og højre, henholdsvis) af ANX-SPIO. Bemærk de forskellige T2 * signaltab (sort signal) af apoptotiske celler, der blev behandlet med fluorescerende ANX (ANX-FLUOS) og lave niveauer versus høje niveauer af ANX-SPIO. Den forøgede T2 * signaltab på højre er forbundet med en markant reduceret ANX-FLUOS signal, som er blevet konkurreret slukkes ved en højere ASX-SPIO koncentrationer. Figur 2B illustrerer kompetitiv binding af ANX-SPIO versus ANX-FLUOS signal og dissociering konstant Ki. X-aksen angiver Annexin proteinkoncentrationen i logaritmisk skala.
Movie 1. Klik her for at se supplerendefilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne konjugation fremgangsmåde til at forbinde SPIO til Annexin V udnytter sidekæde amingrupper af Annexin og carboxylgrupperne i den SPIO nanopartikel. Via specifikke oxidations-reduktions-trin, kan kovalent binding af disse forbindelser kan opnås, og den resulterende funktionaliserede nanopartikel kan isoleres. Denne metode kan generaliseres til andre proteiner og nanopartikler af interesse.
De mest kritiske trin er oxidation og reduktion forhold, der udføres i de relevante temperaturer og med forsigtig blanding. Lave udbytte kan skyldes ufuldstændig oxidation eller reduktion, hvilket resulterer i overskydende fri Annexin V, der fjernes under filtreringstrinnet. Når den anvendes til andre proteiner af interesse, kan de optimale betingelser variere fra de ovenfor beskrevne. Imidlertid, når disse optimale betingelser er defineret, filtreres fri proteinet kan falde til en ubetydelig værdi, og derfor mikrocentrifuge filtrering may blevet overflødige. Faktisk kan overskydende filtrering reducere slutforbindelsen udbytte på grund af ikke-specifik binding til selve filteret. Hvis dette sker, præfiltrering 1% albumin gennem filteret vil reducere uspecifik binding af den konjugerede forbindelse til filteret og forbedre udbyttet. DLS-analyse af den endelige forbindelse, og såvel som protein måling af filtratet, vil hjælpe med at bestemme, om tilbageværende fri protein er til stede.
Tilstedeværelsen af frit SPIO i slutforbindelsen er også en potentiel kontaminant. Til dette formål blev DLS ansat til at kontrollere renhed. En monomodal top ved DLS hjælper til at sikre en særegen jernoxidpartikler arter. Fri SPIO alene frembringer en særskilt DLS top ved 46nm og var ikke til stede i ANX-SPIO præparater.
Flere muligheder for bioconjugation findes 6-12 at anvende de alternative konjugerende mekanismer, såsom biotin-streptavidin interaktion eller protein krydsbinding af kundetilpassede nanoparticles. Fremgangsmåden præsenteret heri betegner en robust, bredt anvendelig fremgangsmåde til konjugering af magnetiske nanopartikler til proteiner af interesse, uden brug af specialværktøj nanopartikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
