Summary
Vroege detectie van apoptose kan aanwijzen risicogroepen celpopulaties in een verscheidenheid aan ziekten. Hier laten we zien een methode om een vroege apoptose-detectie eiwit (Annexine V) te koppelen aan een MRI-detecteerbare nanodeeltjes ijzeroxide (SPIO). Deze methode kan worden uitgebreid tot andere eiwitten van belang om MRI-detecteerbare moleculaire probes voor medische beeldvorming te genereren.
Abstract
Cellulaire apoptose is een opvallend kenmerk van veel ziekten, en deze geprogrammeerde celdood treedt meestal op vóór de klinische verschijnselen van de ziekte zijn evident. Een middel om apoptose te sporen in zijn vroegste, omkeerbare stappen zou kunnen veroorloven een pre-klinische 'venster' waarin preventieve of therapeutische maatregelen kunnen worden genomen om het hart te beschermen tegen blijvende schade. Wij geven hierbij een eenvoudige en robuuste wijze menselijke Annexine V (ANX) die gretig aan cellen bindt in de vroegste fase van reversibele apoptose, geconjugeerd aan superparamagnetische ijzeroxide (SPIO) nanodeeltjes, die als een MRI-detecteerbaar contrastmiddel. De vervoeging methode begint met een oxidatie van de SPIO nanodeeltjes, die carboxylgroepen oxideert de polysaccharide schelp van SPIO. Gezuiverd eiwit wordt dan ANX toegevoegd in de omgeving van een natriumboraat-oplossing om covalente interactie van ANX vergemakkelijken SPIO in een reducerende buffer. Een laatste stap reductie met natrium borohydride wordt uitgevoerd om de vermindering voltooien en de reactie wordt geblust. Geconjugeerde ANX wordt uit het mengsel door microcentrifuge filtratie. De grootte en zuiverheid van de ANX-SPIO product wordt gecontroleerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS). Deze methode vereist geen aanvulling op of wijziging van de polysaccharide SPIO shell, in tegenstelling tot cross-linked ijzeroxide deeltjes conjugatie methoden of biotine-gelabeld nanodeeltjes. Hierdoor is deze methode een eenvoudige, robuuste benadering kan worden uitgebreid tot andere conjugatie van eiwitten van interesse.
Protocol
Aangepast van eerdere studie 1.
1. Vervoeging van Annexine V SPIO
- Oxideren SPIO deeltjes (Ocean Nanotech Inc 5 mg / mL) gedurende 1 uur bij 20 ° C in het donker in oplossing met 0,15 M natriumperjodaat (NAIO 4) (4:1 gewicht: gewicht) 2.
- Incubeer de geoxideerde SPIO 12 uur met gezuiverde ANX eiwit (1:1,: gewicht) in 0,15 M natriumboraat (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) bij 20 ° C.
- Verminder het mengsel nog gedurende 1 uur met natriumboorhydride (NaBH4) onder de zuurkast en dan blussen met 0,15 M Tris-HCl.
- Scheid de vrije ANX van ANX-SPIO door centrifugeren bij 14.000 xg (75 um porie Microcon filter, Millipore, Billerica, MA).
- Een verfijning van de verbinding door het verwijderen van niet-gebonden verontreinigingen met behulp van een magnetische scheider apparaat (Ocean Nanotech, Inc.)
- Kwantificeer het filter retentaat (ANX-SPIO) eiwitniveausdoor Bradford eiwit assay en bewaar bij -80 ° C bij 2 mg / ml in 0,1 M Tris-HCl met 1% serum albumine en proteaseremmers (Halt Proteaseremmer, Thermo Scientific, 1-50 mg / mg ANX).
2. Dynamic Light Scattering
- Afzonderlijk verwatering van de SPIO en ANX-SPIO in PBS tot een optische dichtheid van 0,1 en analyseren door dynamische lichtverstrooiing in een Zetasizer Nano DLS machine (Malvern Inc, Worcestershire, Verenigd Koninkrijk) 3.
- Verkrijgen monomodale pieken (ideaal) voor de verbinding met een Z-gemiddelde deeltjesgrootte en polydispersiteitsindex (PDI). Vergelijk deze grootte van de DLS-gemeten grootte van de ijzeroxide nanodeeltjes alleen. ANX-SPIO DLS resultaten toonden een conjugaat deeltje hydrodynamische diameter van 78 nm met een PDI van 0,13 1, als gevolg van een homogene ANX-SPIO soorten 3.
3. Cultuur van de Cel, inductie van apoptose in Cultuur, en MRI van de gekweekte cellen
- Cultuur volwassen muis beenmerg mesenchymale stem cellen (mMSCs) in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (Invitrogen, Inc), bij voorkeur 20 tot 30 april passage.
- Apoptose in kweekcellen door behandeling van verschillende tijden bij 37 ° C met DOX (Sigma, 1 mM in 0,9% natriumchloride, 1 pM concentratie media) 12.
- Kwantificeren van de hoeveelheid van apoptose in de cultuur met behulp van MRI met ANX-SPIO (beschreven in 3.4) of met behulp van microscopie na TUNEL kleuring (APO-BrdUTM TUNEL Assay Kit, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) of na vlek met ANX-FITC (Roche, Zwitserland).
- Label de cellen met ANX-SPIO (10 mg proteïne / ml medium behalve als aangegeven) of met een equivalentgewicht van vrije SPIO (5 mg) gedurende 15 min bij 37 ° C. Was 4 maal met PBS en overlay met 1 ml 1% agarose om verspreiding van de SPIO nanodeeltjes voorkomen. Voer MRI van de gerechten (hieronder beschreven). U kunt ook de cellen wassen en trypsinize na DOX en ANX-SPIO etikettering, dan kan de cellenvormen pellets in Eppendorf-buizen.
4. In Vitro MRI
- Gebruik een 1,5 of 3 Tesla GE Signa EXCITE scanner met standaard knie-ontvanger spoel voor in-vitro-MRI-analyse.
- Plaats de cultuur gerechten of buizen in een agar fantoom, en het beeld met behulp van een gradiënt-echo verwend gradiënt volgorde: Herhaling Tijd (TR) 550 ms, Echo Tijd (TE) 10 ms, flip hoek van 15 °, matrix 256 x 256, in de praktijk of-view 3 cm x 3 cm, slice dikte van 1,3 mm, aantal gemiddelden (NEX) 2, afstand 0 mm 5. Afbeelding axiaal door de cel laag op de plaat voor T2 * signaalverlies met gebieden of interest (ROI) van een vast gebied (bijvoorbeeld 0,8 mm2). Pas voor de achtergrond met behulp van controle ROI signaal van de agar fantoom. Meet de achtergrondgeluiden van het signaal van de lucht rond het fantoom.
- Bereken de MRI Contrast-to-Noise Ratio (CNR: [SI sample ROI-SI-controle ROI] / [SD van SI van achtergrondgeluid], waarbij SI is het signaal intensiteit, enSD is de standaardafwijking) werd berekend voor elke cultuur schotel.
5. Representatieve resultaten
Meting van T2 * signaal verlies in vitro vereist een homogene agar fantoom en het ontbreken van luchtbellen, welk signaal leegte artefact zal creëren. Dit artefact is moeilijk te onderscheiden van echte T2 * signaal verlies van SPIO, en is van cruciaal belang voor interpreteerbare resultaten. Zie figuur 1 voor een voorbeeld van een lucht-artefact als echte ijzeroxide T2 * signaal verlies.
Voor in vitro kweekschaal imaging, een geëigende hoeveelheden agargel elk kweekschaal, zodat voldoende axiale MRI segmenten, die ongeveer 1 mm dik worden gemaakt voldoende beeld de gehele plaat. Figuur 2 illustreert de verwachte signaal MRI individueel kweekplaten in agar. Meestal is een signaal variatie op de randen van de plaat, zodat de analyse van gebieden interest moet voorkomen dat deze oneffenheden.
Figuur 1. ANX-SPIO detecteert apoptose in gekweekte neonatale cardiomyocyten van de rat. Figuur 1A toont een foto van gepelleteerde neonatale cardiomyocyten behandeld met controle-oplossing (links buis), ANX-SPIO (middenstang) en DOX + ANX-SPIO (rechts buis) . Let op de bruine kleur van de DOX + ANX-SPIO behandelde cellen, als gevolg van verhoogde retentie van de ANX-SPIO compound in apoptotische cellen. Figuur 1B In vitro MRI-beelden tonen de intense T2 * signaal verlies van de DOX + ANX-SPIO cellen. Tevens wordt een luchtbel gezien tussen de 4 en 5 e Eppendorf buizen (zwarte signaal inhoud), wat vergelijkbaar is met het signaal leegte van ANX-SPIO, en die analyse CNR beïnvloeden.
Figuur 2. ANX-SPIObinding is specifiek voor apoptotische cellen in cultuur. Figuur 2A toont aan apoptotische rat neonatale cardiomyocyten op de cultuur gerechten, onderworpen aan een ANX-FLUOS vlekken of ANX-SPIO vlekken, met lage en hoge concentraties (links en rechts, respectievelijk) van ANX-SPIO. Let op de verschillende T2 * signaal verlies (zwart-signaal) van apoptotische cellen die werden behandeld met fluorescerende ANX (ANX-FLUOS) en een laag niveau ten opzichte van een hoog niveau van ANX-SPIO. De verhoogde T2 * signaal verlies aan de rechterkant is geassocieerd met een duidelijk verminderd ANX-FLUOS signaal, dat is off wedstrijden door hogere ASX-SPIO concentraties. Figuur 2B illustreert de competitieve binding van ANX-SPIO versus ANX-FLUOS signaal en de dissociatie constante K i. De X-as geeft de annexine eiwitconcentratie log schaal.
Movie 1. Klik hier om extra te bekijkenfilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven werkwijze voor conjugatie aan het koppelen SPIO Annexine V gebruik van de zijketen amine groepen Annexine en carboxyl groepen van het SPIO nanodeeltjes. Door specifieke oxidatiereductie stappen kan covalente binding van deze verbindingen worden bereikt, en het resulterende gefunctionaliseerde nanodeeltjes kunnen worden geïsoleerd. Deze methode kan algemeen andere eiwitten en nanodeeltjes van belang.
De meest kritische stappen zijn oxidatie en reductieomstandigheden, in de juiste temperatuur en voorzichtig mengen uitgevoerd. Lage opbrengst als gevolg van incomplete oxidatie of reductie, waardoor vrij rest Annexine V die wordt verwijderd tijdens de filtratie. Wanneer toegepast op andere eiwitten van belang kan optimale afwijken van de hierboven beschreven. Echter, zodra deze optimale omstandigheden worden gedefinieerd, gefiltreerd vrij eiwit kan dalen tot een verwaarloosbare hoeveelheid en dus microcentrifuge filtratie may overbodig geworden. In feite kan dan filtratie verminderen eindverbinding opbrengst door specifieke binding aan het filter zelf. Als dit gebeurt, pre-filteren 1% albumine door het filter vermindert specifieke binding van het geconjugeerde verbinding met het filter en verbetering van de opbrengst. DLS analyse van de uiteindelijke verbinding en ook eiwitten metingen van het filtraat wordt te bepalen of restant vrij eiwit aanwezig is.
De aanwezigheid van vrije SPIO in de uiteindelijke verbinding ook een mogelijke verontreiniging. Daartoe werd DLS gebruikt om zuiverheid te controleren. Een monomodale piek DLS draagt bij tot een enkelvoudige ijzeroxide soorten. Gratis SPIO produceert alleen al is een duidelijke piek bij DLS 46Nm en was niet in ANX-SPIO preparaten.
Verschillende opties voor bioconjugation beschikbaar 6-12 dat de alternatieve vervoegen van mechanismen, zoals biotine-streptavidine interactie of eiwit in dienst verknoping van op maat nanoparticles. De werkwijze die hierin is een robuuste breed toepasbaar benadering voor conjugatie van magnetische nanodeeltjes om eiwitten van belang, zonder het gebruik van speciale nanodeeltjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
