Summary
Früherkennung von Apoptose gefährdeten Zellpopulationen in einer Vielzahl von Krankheiten zu identifizieren. Hier zeigen wir ein Verfahren, um eine der frühen Apoptose-Detektion Protein (Annexin V) mit einem MRI-nachweisbare Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO) zu verbinden. Diese Methode kann auch auf andere Proteine von Interesse zu MRT-nachweisbar molekulare Bildgebung Sonden erzeugen verlängert werden.
Abstract
Zellulärer Apoptose ist ein hervorstechendes Merkmal von vielen Krankheiten, und das den programmierten Zelltod tritt in der Regel vor der klinischen Manifestation der Erkrankung offensichtlich sind. Ein Mittel, um Apoptose in ihren frühesten, reversiblen Stadium zu erkennen wäre leisten einen vorklinischen "Fenster", in der präventiven oder therapeutischen Maßnahmen ergriffen, um das Herz vor bleibenden Schäden schützen könnte. Hier stellen wir ein einfaches und robustes Verfahren für die menschliche Annexin V (ANX), die eifrig an Zellen bindet, in den ersten, reversiblen Stadium der Apoptose, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO)-Nanopartikel, die als MRI-Kontrastmittel nachweisbaren dienen konjugieren. Die Methode der Konjugation beginnt mit einer Oxidation der SPIO-Nanopartikel, die Carboxylgruppen oxidiert auf dem Polysaccharid Schale der SPIO. Gereinigtes ANX Protein wird dann in der Einstellung eines Natrium-Borat-Lösung, um eine kovalente Wechselwirkung mit ANX SPIO erleichtern in einer reduzierenden Puffer zugesetzt. Ein abschliessender Reduktionsschritt mit Natrium borohydridE wird durchgeführt, um die Reduktion abgeschlossen ist, und dann wird die Reaktion gestoppt. Unkonjugiertes ANX wird aus der Mischung von Mikrozentrifuge Filtration entfernt. Die Größe und Reinheit der ANX-SPIO Produkt zeichnet sich durch dynamische Lichtstreuung (DLS) verifiziert. Diese Methode erfordert keine zusätzlich oder Modifikation, das Polysaccharid SPIO-Shell, um vernetztes Eisenoxid-Partikel-Konjugation Methoden oder Biotin-markierten Nanopartikeln dagegen. Im Ergebnis stellt diese Methode einen einfachen, robusten Ansatz, der Konjugation von anderen Proteinen von Interesse verlängert werden kann.
Protocol
Übernommen aus vorherigen Studien ein.
1. Konjugation von Annexin V SPIO
- Oxidieren SPIO Teilchen (Ocean Nanotech Inc., 5 mg / ml) für 1 Stunde bei 20 ° C im Dunkeln in Lösung mit 0,15 M Natriumchlorid (NaIO 4) (4:1 Gewicht: Gewicht-Verhältnis) 2.
- Inkubieren des oxidierten SPIO für 12 Stunden mit gereinigtem ANX Protein (im Verhältnis 1:1, Gewicht: Gewicht) in 0,15 M Natriumborat (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) bei 20 ° C
- Reduzieren der Mischung weiter für 1 Stunde mit Natriumborhydrid (NaBH 4) unter dem Abzug und dann Löschen mit 0,15 M Tris-HCl.
- Trennen Sie den kostenlosen ANX von ANX-SPIO durch Zentrifugation bei 14.000 xg (75 um Pore Microcon Filter, Millipore, Billerica, MA).
- Weiter verfeinern, die Verbindung durch Entfernen ungebundener Verunreinigungen mit Hilfe eines Magnet-Separator-Gerät (Ocean Nanotech, Inc.).
- Quantifizieren Sie den Filter Retentat (ANX-SPIO) Protein-Spiegelvon Bradford-Protein-Assay und lagern bei -80 ° C bei 2 mg / ml in 0,1 M Tris-HCl mit 1% Serumalbumin und Protease-Inhibitoren (Halt Protease-Inhibitor, Thermo Scientific, 1-50 mg / mg ANX).
2. Dynamische Lichtstreuung
- Getrennt verdünnen SPIO und AX-SPIO in PBS zu einer optischen Dichte von 0,1 und Analyse durch dynamische Lichtstreuung in einem Zetasizer Nano DLS Maschine (Malvern Inc., Worcester, UK) 3.
- Erhalten monomodale Peaks (im Idealfall) für die Verbindung mit einer Z-mittlere Teilchengröße und der Polydispersitätsindex (PDI). Vergleichen Sie diese Größe auf die DLS-gemessene Größe der Eisenoxid-Nanopartikel allein. AX-SPIO DLS Ergebnisse zeigten ein Konjugat Teilchen hydrodynamischen Durchmesser von 78 nm mit einem PDI von 0,13 1, reflektierenden ein homogenes AX-SPIO Spezies 3.
3. Cell Culture, Induktion von Apoptose in Kultur und MRT von kultivierten Zellen
- Kultur erwachsenen Maus Knochenmark mesenchymale sTEM-Zellen (MMSCs) in DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Inc.), vorzugsweise in der Passage 20-30 April.
- Apoptose in den kultivierten Zellen durch Behandeln für unterschiedliche Zeiten bei 37 ° C mit DOX (Sigma, 1 mM in 0,9% Kochsalzlösung, 1 nM-Konzentration in den Medien) 12.
- Quantifizierung der Menge an Apoptose in Kultur entweder mit MRT mit ANX-SPIO (beschrieben in 3.4 unten) oder über Mikroskopie nach TUNEL-Färbung (APO-BrdUTM TUNEL Assay Kit, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) oder nach der Färbung mit ANX-FITC (Roche, Schweiz).
- Kennzeichnen der Zellen mit AX-SPIO (10 mg Protein / ml Medium nicht anders angegeben), oder ein gleichwertiges Gewicht der freien SPIO (5 mg), 15 min bei 37 ° C 4 x waschen mit PBS und Überlagerung mit 1 ml 1% Agarose um die Diffusion der SPIO Nanopartikel zu verhindern. Führen MRT der Schalen (unten beschrieben). Alternativ, waschen Sie die Zellen und trypsinieren nach DOX und ANX-Kennzeichnung SPIO, dann lassen sich die Zellen zubilden Pellets in Eppendorf-Röhrchen.
4. In-vitro-MRT
- Verwenden Sie einen 1,5 oder 3 Tesla GE Signa EXCITE Scanner mit Standard-Knie-Empfangsspule für In-vitro-MRT-Analyse.
- Legen Sie die Kulturschalen oder Rohre in einem Agar-Phantom und Bild unter Verwendung eines Gradienten-Echo-verwöhnte Gradientensequenz: Repetitionszeit (TR) 550 ms, Echozeit (TE) 10 ms, Flip-Winkel 15 °, Matrix 256 x 256, Feld- of-View 3 cm x 3 cm, Schichtdicke 1,3 mm, Anzahl der Mittelungen (NEX) 2, 0 mm Abstand 5. Bild axial durch die Zellschicht auf der Platte für T2 * Signalverlust, mit Regionen-von-Interesse (ROI) von einem festen Bereich (zum Beispiel 0,8 mm 2). Stellen Sie für den Hintergrund mit Kontrolle ROI Signal von der Agar-Phantom. Messen des Hintergrundrauschens von dem Signal der umgebenden Luft Phantom.
- Berechnen Sie die MRT-Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR: [SI Probe ROI-SI-Steuerung ROI] / [SD von SI von Hintergrundgeräuschen], wobei SI ist Signalintensität undSD ist die Standardabweichung) wurde für jede Kulturschale berechnet.
5. Repräsentative Ergebnisse
Die Messung der T2 * Signalverlust in vitro erfordert eine homogene Agar Phantom und das Fehlen von Luftblasen, die Signal nichtig Artefakt schaffen wird. Dieses Artefakt ist schwierig, aus echtem T2 *-Signal Verlust von SPIO zu unterscheiden, und ist entscheidend für interpretierbare Ergebnisse. Bitte siehe Abbildung 1 für ein Beispiel eines Luft-Artefakt als auch echte Eisenoxid T2 * Signalverlust.
Für In-vitro-Kulturschale Bildgebung, legen Sie eine entsprechende Volumen der Agar-Gel zu jedem Kulturschale, so dass eine ausreichende axiale MRT-Scheiben, die etwa 1 mm dick sind, angemessen zu Bild die ganze Schale gemacht werden können. Abbildung 2 zeigt die erwartete MRT-Signal aus einzelnen Platten Kultur in Agar. Es ist typischerweise ein Signalverlauf an den Kanten der Platte, so Analyse von Regionen von intERest sollten es vermeiden, diese Unebenheiten.
Abbildung 1. ANX-SPIO erkennt Apoptose in kultivierten neonatalen Kardiomyozyten der Ratte. 1A zeigt ein Foto von pelletiert neonatalen Kardiomyozyten mit Control-Lösung (links Rohr), ANX-SPIO (Mitte Rohr), und DOX + ANX-SPIO (rechts Rohr) behandelt . Notieren Sie sich die bräunliche Farbe des DOX + ANX-SPIO behandelten Zellen, was auf erhöhte Retention des ANX-SPIO Verbindung in apoptotischen Zellen. 1B In-vitro-MRT-Bilder zeigen die intensiven T2 *-Signal Verlust der DOX + ANX-SPIO-Zellen. Auch wird eine Luftblase zwischen dem 4. und 5. Eppendorf-Röhrchen (kleine schwarze Signal void), die ähnlich wie die Leere des Signals ANX-SPIO, und die Analyse kann CNR beeinflussen ist zu sehen.
Abbildung 2. ANX-SPIOBindung ist spezifisch für apoptotische Zellen in Kultur. 2A zeigt apoptotische Ratte neonatalen Kardiomyozyten auf Kulturschalen, unterzogen, um entweder ANX-FLUOS Färbung oder ANX-SPIO-Färbung, mit niedrigen und hohen Konzentrationen (links bzw. rechts) von ANX-SPIO. Beachten Sie die unterschiedlichen T2 * Signalverlust (schwarz-Signal) von apoptotischen Zellen, die mit fluoreszierenden ANX (ANX-FLUOS) und das niedrige Niveau im Vergleich zu hohen ANX-SPIO behandelt wurden. Die erhöhte T2 * Signalverlust auf der rechten Seite ist mit einem deutlich reduzierten ANX-FLUOS Signal, das wurde bestritten hat, durch höhere ASX-SPIO Konzentrationen assoziiert. 2B zeigt die kompetitive Bindung von ANX-SPIO gegen ANX-FLUOS Signal und der Dissoziation Konstante, K i. Die X-Achse bezeichnet die Annexin Proteinkonzentration im logarithmischen Maßstab.
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Discussion
Die beschriebene Methode der Konjugation zum Verbinden SPIO Annexin V nutzt die Seitenkette Amingruppen von Annexin und die Carboxylgruppen der SPIO Nanopartikel. Durch gezielte Oxidations-Reduktions-Schritte können kovalente Verknüpfung dieser Verbindungen erreicht werden, und die resultierende funktionalisierte Nanopartikel können isoliert werden. Dieses Verfahren kann verallgemeinert werden, um andere Proteine und Nanopartikel in der Umgebung.
Die wichtigsten Schritte sind die Oxidation und Reduktion Bedingungen, die in den entsprechenden Temperaturen und unter leichtem Rühren durchgeführt. Geringe Ausbeute kann durch unvollständige Oxidation oder Reduktion, die im restlichen freien Annexin V, die während der Filtration entfernt Ergebnissen führen. Im Vergleich zu anderen Proteinen von Interesse angewendet wird, kann optimalen Bedingungen von den oben beschriebenen abweichen. Sobald jedoch die optimalen Bedingungen definiert sind, filtriert Protein kann auf einen vernachlässigbaren Betrag zu verringern, und somit die Mikro-Filtration may überflüssig geworden. Tatsächlich kann überschüssige Filtration reduzieren endgültige Verbindung Ertrag durch unspezifische Bindung an die Filter selbst. Wenn dies der Fall ist, Vorfilterprozedur 1% Albumin durch den Filter wird unspezifische Bindung der konjugierten Verbindung mit dem Filter zu reduzieren und die Ausbeute. DLS-Untersuchungen der letzten Verbindung, und auch Proteinkonzentration Messungen des Filtrats, wird dazu beitragen, festzustellen, ob restlichen freien Protein vorhanden ist.
Das Vorhandensein von freien SPIO in der letzten Verbindung ist auch ein potentieller Kontaminanten. Zu diesem Zweck wurde DLS eingesetzt, um Reinheit zu überprüfen. Ein Höhepunkt monomodale durch DLS hilft, eine singuläre Eisenoxid Arten zu gewährleisten. Kostenlose SPIO allein erzeugt eine deutliche Spitze bei 46 nm DLS und war nicht im ANX-SPIO Vorbereitungen.
Verschiedene Optionen zur Biokonjugation sind 6-12, die die alternativen Konjugieren Mechanismen, wie zB Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung oder Protein eingesetzt Vernetzung gestaltet napartikel. Die hier vorgestellte Methode stellt eine robuste, breit anwendbares Konzept für die Konjugation von magnetischen Nanopartikeln um Proteine von Interesse, ohne die Verwendung von speziellen Nanopartikeln.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
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