Summary
रोगों की एक किस्म में apoptosis का जल्दी पता लगाने पर जोखिम सेल आबादी की पहचान कर सकते हैं. यहाँ हम एक विधि लोहा एमआरआई detectable आक्साइड nanoparticle (SPIO) के लिए एक प्रारंभिक apoptosis को पहचान प्रोटीन (Annexin वी) लिंक प्रदर्शित करता है. इस विधि को एमआरआई detectable आणविक इमेजिंग जांच उत्पन्न करने के लिए ब्याज की अन्य प्रोटीन के लिए बढ़ाया जा सकता है.
Abstract
सेलुलर apoptosis कई बीमारियों की एक प्रमुख विशेषता है, और इस क्रमादेशित कोशिका मृत्यु आमतौर पर तब होता है से पहले रोग के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ स्पष्ट कर रहे हैं. जल्द से जल्द अपने, पलटवाँ चरणों में apoptosis का पता लगाने का मतलब एक पूर्व नैदानिक 'विंडो' के दौरान जो निवारक या उपचारात्मक उपायों के लिए स्थायी क्षति से हृदय की रक्षा के लिए ले जाया जा सकता है नहीं होगा. हम यहाँ एक सरल और मजबूत superparamagnetic लोहे के आक्साइड (SPIO) नैनोकणों, जो एक एमआरआई detectable विपरीत एजेंट के रूप में सेवा करने के लिए मानव Annexin (ANX) वी, जो उत्सुकतापूर्वक apoptosis की जल्द से जल्द, पलटवाँ चरणों में कोशिकाओं को बांधता संयुग्म विधि प्रस्तुत करते हैं. विकार विधि नैनोकणों SPIO, है जो polysaccharide खोल SPIO carboxyl समूहों ऑक्सीकरण ऑक्सीकरण के साथ शुरू होता है. शुद्ध ANX प्रोटीन तो एक सोडियम borate समाधान के एक कम करने के बफर में SPIO साथ ANX के सहसंयोजक बातचीत की सुविधा के लिए सेटिंग में जोड़ा जाता है. , सोडियम borohydrid के साथ एक अंतिम कमी कदमई कमी को पूरा किया जाता है, और तब प्रतिक्रिया बुझती है. Unconjugated ANX microcentrifuge निस्पंदन द्वारा मिश्रण से निकाल दिया जाता है. और ANX - SPIO उत्पाद का आकार और पवित्रता गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) द्वारा सत्यापित है. इस विधि के अलावा, या संशोधन की आवश्यकता नहीं है, polysaccharide SPIO खोल, के रूप में पार से जुड़े लोहे के आक्साइड के कण विकार तरीकों या बायोटिन लेबल नैनोकणों के लिए विरोध किया. एक परिणाम के रूप में, इस विधि का एक सरल, मजबूत दृष्टिकोण है कि ब्याज की अन्य प्रोटीन के संयोजन के लिए बढ़ाया जा सकता है का प्रतिनिधित्व करता है.
Protocol
पूर्व 1 अध्ययन से अनुकूलित है.
1. Annexin वी SPIO के लिए विकार
- समाधान में अंधेरे में 0.15 एम सोडियम (4 NaIO) periodate (वजन अनुपात वजन 04:01) के साथ 2: 1 घंटे के लिए SPIO (महासागर नैनोटेक, Inc, 5 मिलीग्राम / एमएल) 20 ° सी oxidize के कणों.
- 0.15 एम सोडियम borate (ना 2 बी 4 7 हे 10h 2 हे) में 20 डिग्री सेल्सियस पर: ANX प्रोटीन शुद्ध (वजन 1:1 अनुपात, वजन) के साथ 12 घंटे के लिए ऑक्सीकरण SPIO सेते हैं
- धूआं हुड के तहत सोडियम borohydride (4 NaBH) के साथ 1 घंटे के लिए आगे मिश्रण को कम करने और फिर 0.15 एम Tris - एचसीएल के साथ बुझाना.
- इस XG 14,000 (75 माइक्रोन ताकना Microcon फिल्टर, Millipore, Billerica, एमए) पर centrifugation द्वारा ANX - SPIO से मुक्त ANX अलग करें.
- इसके अलावा अपार दोष दूर एक चुंबकीय विभाजक डिवाइस (महासागर नैनोटेक, इंक) का उपयोग करके परिसर को परिष्कृत करें.
- फिल्टर (ANX SPIO) प्रोटीन का स्तर यों retentateब्रैडफोर्ड प्रोटीन और -80 पर परख दुकान डिग्री सेल्सियस 2 में 1% सीरम albumin और protease inhibitors (हाल्ट protease अवरोध करनेवाला, थर्मो वैज्ञानिक, 1-50 मिलीग्राम / मिलीग्राम ANX के) के साथ मिलीग्राम / एमएल 0.1 एम Tris - एचसीएल में.
2. गतिशील लाइट छितराया
- अलग 0.1 के एक ऑप्टिकल घनत्व और SPIO - पीबीएस में ANX - SPIO पतला और एक Zetasizer नैनो DLS (Malvern इंक, Worcestershire, ब्रिटेन) मशीन 3 में गतिशील प्रकाश बिखरने द्वारा विश्लेषण.
- यौगिक के लिए monomodal चोटियों (आदर्श) एक कण Z औसत आकार और polydispersity सूचकांक (PDI) के साथ, प्राप्त करते हैं. लोहे के आक्साइड nanoparticle की अकेले DLS मापा आकार इस आकार की तुलना करें. के DLS परिणाम ANX - SPIO 1 .13 की एक PDI के साथ 78 एनएम के एक संयुग्म कण hydrodynamic व्यास दिखाया, एक समरूप ANX - SPIO के 3 प्रजातियां को दर्शाती है.
3. सेल संस्कृति, संस्कृति में apoptosis की प्रेरण, और संवर्धित कोशिकाओं का एमआरआई
- संस्कृति वयस्क माउस अस्थि मज्जा mesenchymal हैमंदिर DMEM में कोशिकाओं (mMSCs) के 10% FBS और 20-30 1 पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन बीतने पर अधिमानतः (Invitrogen इंक%), 4 के साथ पूरक.
- Dox (सिग्मा, 0.9% खारा में 1 मिमी, मीडिया में 1 माइक्रोन एकाग्रता) 12 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर अलग समय के लिए इलाज से संस्कृति की कोशिकाओं में apoptosis को उत्पन्न.
- संस्कृति में apoptosis की राशि मात्रा ठहराना या तो एमआरआई ANX - SPIO (नीचे 3.4 में वर्णित) के साथ या TUNEL दाग के बाद माइक्रोस्कोपी (एपीओ BrdUTM TUNEL परख किट का उपयोग कर के, आण्विक जांच / Invitrogen, यूजीन, या) या बाद FITC ANX के साथ दाग का उपयोग (Roche, स्विट्जरलैंड).
- (10 मिलीग्राम के रूप में उल्लेख के अलावा मध्यम प्रोटीन / एमएल) ANX SPIO, या मुक्त SPIO (5 मिलीग्राम) के एक बराबर वजन के साथ के साथ कोशिकाओं 15 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस के लिए, लेबल 1% agarose 1 एमएल के लिए SPIO नैनोकणों के प्रसार को रोकने के साथ धो PBS के साथ 4 बार, और उपरिशायी. एमआरआई (नीचे वर्णित) बर्तन का प्रदर्शन करते हैं. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को धोने और Dox और लेबलिंग ANX - SPIO के बाद trypsinize, तब कक्षों के लिए अनुमति देते हैंEppendorf ट्यूबों में छर्रों के रूप में.
4. इन विट्रो एमआरआई
- एक 1.5 या 3 Tesla इन विट्रो एमआरआई विश्लेषण में के लिए मानक घुटने रिसीवर का तार के साथ जीई Signa उत्तेजित स्कैनर का उपयोग करें.
- संस्कृति व्यंजन: दोहराव समय (टी.आर.) 550 MS, इको समय (ते) 10 एमएस, फ्लिप 15 कोण रहेंगे, मैट्रिक्स 256 256 x, क्षेत्र या एक अगर प्रेत में ट्यूब, और एक ढाल गूंज खराब ढाल अनुक्रम का उपयोग कर छवि रखें के दृश्य 3 सेमी x 3 सेमी, टुकड़ा मोटाई 1.3 मिमी, औसत की संख्या (नेक्स) 2, रिक्ति 0 5 मिमी. छवि अक्षीय रूप से प्लेट पर टी 2 * संकेत हानि, ब्याज क्षेत्रों का उपयोग कर एक निश्चित क्षेत्र (ROIs) (उदाहरण के लिए, 0.8 मिमी 2) के लिए सेल परत के माध्यम से. अगर प्रेत से नियंत्रण आरओआई संकेत का उपयोग पृष्ठभूमि के लिए समायोजित करें. प्रेत आसपास हवा के संकेत से पृष्ठभूमि शोर को मापने.
- [एसआई नमूना आरओआई एसआई नियंत्रण आरओआई] / और, जहां एसआई संकेत तीव्रता है [एसआई की पृष्ठभूमि शोर के एसडी]: एमआरआई कंट्रास्ट शोर अनुपात (CNR की गणनाएसडी मानक विचलन है) प्रत्येक संस्कृति पकवान के लिए गणना की गई.
5. प्रतिनिधि परिणाम
इन विट्रो में टी 2 * संकेत हानि के मापन एक सजातीय अगर प्रेत और हवाई बुलबुले की कमी है, जो संकेत शून्य विरूपण साक्ष्य बनाने की आवश्यकता है. इस artifact के वास्तविक टी 2 * SPIO का संकेत हानि से भेद करना मुश्किल है, और व्याख्या परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है. एक हवा artifact के एक उदाहरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से असली लोहे के आक्साइड टी 2 * संकेत हानि के लिए चित्रा 1 देखें.
के लिए इन विट्रो संस्कृति पकवान इमेजिंग में, प्रत्येक संस्कृति पकवान अगर जेल के एक उचित मात्रा में लागू करने के लिए, ताकि पर्याप्त अक्षीय एमआरआई स्लाइस, जो लगभग 1 मिमी मोटी पर्याप्त रूप से पूरा पकवान छवि के लिए बनाया जा सकता है चित्रा 2 उम्मीद एमआरआई संकेत दिखाता है. अगर में अलग - अलग संस्कृति प्लेटों से. वहां आम तौर पर थाली के किनारों पर कुछ संकेत परिवर्तन, ताकि int के क्षेत्रों के विश्लेषणerest इन असमान क्षेत्रों से बचना चाहिए.
चित्रा 1 ANX - SPIO सुसंस्कृत नवजात चूहे cardiomyocytes में apoptosis का पता लगाता है चित्र 1A नियंत्रण समाधान (बाएँ ट्यूब), ANX SPIO (मध्य ट्यूब), और Dox + ANX SPIO को सही ट्यूब के साथ इलाज pelleted नवजात cardiomyocytes की एक तस्वीर दिखाता है . Dox का भूरा रंग + ANX - SPIO का इलाज किया कोशिकाओं, प्रतिधारण apoptotic कोशिकाओं के में यौगिक ANX के - SPIO की वृद्धि को दर्शाती है नोट: इन विट्रो एमआरआई छवियों में चित्रा 1 बी तीव्र के Dox + ANX - SPIO कोशिकाओं टी 2 * संकेत नुकसान दिखा. इसके अलावा, एक हवाई बुलबुले 4 वें और 5 वीं Eppendorf (छोटे काले संकेत शून्य) ट्यूब, जो संकेत ANX - SPIO शून्य, और जो CNR के विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं के लिए इसी तरह की है के बीच देखा जाता है.
चित्रा 2 ANX - SPIO.बाध्यकारी संस्कृति में apoptotic कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है चित्रा 2A व्यंजन संस्कृति पर apoptotic चूहा नवजात cardiomyocytes, या तो धुंधला ANX FLUOS या ANX - SPIO धुंधला के अधीन की ANX - SPIO कम और उच्च सांद्रता (छोड़ दिया और सही क्रमशः) के साथ, यह दर्शाता है. नोट विभिन्न टी 2 * apoptotic कोशिकाओं कि फ्लोरोसेंट (ANX FLUOS) ANX और ANX SPIO की उच्च स्तर की तुलना में कम स्तर के साथ इलाज किया गया के संकेत हानि (काला संकेत). वृद्धि की टी 2 * सही संकेत नुकसान पर एक स्पष्ट रूप से कम संकेत ANX FLUOS, जो उच्च हिट SPIO सांद्रता के द्वारा किया गया है प्रतिस्पर्धा के साथ जुड़ा हुआ है. चित्रा 2B ANX बनाम SPIO ANX - FLUOS संकेत और पृथक्करण की प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी दिखाता है स्थिर, मैं कश्मीर. X-अक्ष लॉग पैमाने में Annexin प्रोटीन एकाग्रता अर्थ.
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Discussion
वर्णित Annexin वि SPIO जोड़ने के लिए संयुग्मन विधि Annexin की ओर श्रृंखला amine समूहों और SPIO nanoparticle की carboxyl moieties के कारनामे. विशिष्ट ऑक्सीकरण में कमी कदम के माध्यम से, इन यौगिकों के सहसंयोजक उठाना, प्राप्त किया जा सकता है और जिसके परिणामस्वरूप functionalized nanoparticle के अलग किया जा सकता है. यह विधि अन्य प्रोटीन और ब्याज के नैनोकणों के लिए सामान्यीकृत हो सकता है.
सबसे महत्वपूर्ण कदम ऑक्सीकरण और कमी की स्थिति, उचित तापमान में और कोमल मिश्रण के साथ बाहर किए गए हैं. कम उपज से अधूरा ऑक्सीकरण या कमी है, जो अवशिष्ट मुक्त Annexin वी कि निस्पंदन कदम के दौरान हटा दिया जाता है में परिणाम हो सकता है. जब ब्याज की अन्य प्रोटीन के लिए लागू है, इष्टतम शर्तों के ऊपर वर्णित उन से भिन्न हो सकते हैं. हालांकि, एक बार उन इष्टतम परिस्थितियों में परिभाषित कर रहे हैं, फ़िल्टर मुक्त प्रोटीन एक नगण्य राशि को कम, और हो सकता है इसलिए, microcentrifuge छानने का काम कर रहा हूँप्र ज़रूरत से ज़्यादा हो जाते हैं. दरअसल, अतिरिक्त छानने का काम अंतिम यौगिक की वजह से ही फिल्टर nonspecific बंधन उपज को कम कर सकते हैं. यदि ऐसा होता है, पूर्व फिल्टर के माध्यम से 1 albumin% फ़िल्टरिंग फिल्टर संयुग्मित परिसर के nonspecific बाध्यकारी को कम करने और उपज में सुधार होगा. अंतिम परिसर का विश्लेषण DLS, और प्रोटीन छानना की एकाग्रता माप के रूप में अच्छी तरह से मदद करेंगे, निर्धारित करती है कि अवशिष्ट मुक्त प्रोटीन मौजूद है.
अंतिम परिसर में नि: शुल्क SPIO की उपस्थिति भी एक संभावित contaminant है. यह अंत करने के लिए, DLS शुद्धता की जांच के लिए नियुक्त किया गया था. DLS के द्वारा monomodal चोटी एक विलक्षण लोहे के आक्साइड प्रजातियों को सुनिश्चित करने में मदद करता है. नि: शुल्क SPIO अकेले 46nm पर एक अलग DLS के चोटी के उत्पादन और ANX - SPIO तैयारी में मौजूद नहीं था.
Bioconjugation के लिए कई विकल्प उपलब्ध 6-12 कि बायोटिन-streptavidin बातचीत या प्रोटीन के रूप में वैकल्पिक तंत्र, conjugating रोजगार अनुकूलित न पार से जोड़नेnoparticles. यहाँ प्रस्तुत विधि विशेष नैनोकणों के उपयोग के बिना ब्याज के प्रोटीन के लिए चुंबकीय नैनोकणों के संयोजन के लिए एक मजबूत, व्यापक रूप से लागू दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
(आरडी, PY, पी एस) के राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य NHLBI.
अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (जीएल).
स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय, VPUE अनुदान (जीएल).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
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