Summary
アポトーシスの早期発見は病気の様々なリスクの高い細胞集団を識別することができる。ここでは、MRIで検出可能な酸化鉄ナノ粒子（SPIO）に初期アポトーシス検出タンパク質（アネキシンV）にリンクする方法を示しています。このメソッドは、MRIで検出可能な分子イメージングプローブを生成するために関心のある他のタンパク質に延長することができる。
Abstract
細胞のアポトーシスは、多くの疾患の顕著な特徴であり、疾患の臨床症状が明らかになる前にこのプログラム細胞死は、通常発生します。その初期、可逆段階でアポトーシスを検出する手段が予防または治療措置が永久的な損傷から心臓を保護するために取ることができる、その間に前臨床試験 'ウィンドウを'余裕でしょう。我々はここにMRIで検出可能な造影剤として機能する超常磁性酸化鉄（SPIO）粒子に熱心にアポトーシスの最も初期の、可逆的な段階で細胞に結合するヒトアネキシンV（ANX）を、共役するためのシンプルかつ堅牢な方法を提示する。接合方法は、SPIOの多糖類のシェルにカルボキシル基を酸化しSPIOナノ粒子の酸化で始まります。 ANXタンパク質を精製した後の削減バッファにSPIOとANXの共有結合性相互作用を容易にするために、ホウ酸ナトリウム溶液の設定で追加されます。ナトリウムborohydrid最終的な還元工程eは削減を完了するために実行され、その後反応がクエンチされる。非抱合ANXは、遠心濾過により混合物から除去されます。 ANX-SPIO製品のサイズと純度は、動的光散乱（DLS）によって検証されます。このメソッドは、架橋された酸化鉄粒子の共役メソッドまたはビオチン標識ナノ粒子とは対照的に、への追加を必要とする、または多糖類SPIOシェルの変更はありません。結果として、このメソッドは、興味のある他のタンパク質の結合に延長することができる、シンプルで堅牢なアプローチを表しています。
Protocol
事前調査1から適応した。
1。 SPIOのアネキシンVの結合
- 2：0.15 M過ヨウ素酸ナトリウム（過ヨウ素4）（重量比4:1の重量）と溶液中で暗所で20℃で1時間SPIO粒子（オーシャンナノテク社は、5 mg / mL）を°Cを酸化させる。
- 20℃で0.15 Mホウ酸ナトリウムた（Na 2 B 4 O 7 10H 2 O）で：ANXタンパク質を（重量比1:1、重量）を精製して12時間酸化SPIOをインキュベート
- ヒュームフードの下水素化ホウ素ナトリウム（NaBH 4の ）で1時間さらに混合物を削減し、その後、0.15Mトリス-HClで急冷する。
- 14,000×gで（75μmの細孔マイクロコンフィルターミリポア、ビルリカ、MA）で遠心分離してANX-SPIOから無料でANXを分離します。
- さらに磁気分離装置（オーシャンナノテク、（株））を使用してバインドされていない不純物を除去することによって化合物を絞り込む。
- フィルター残留（ANX-SPIO）タンパク質レベルを定量化する-80 Bradfordタンパク質アッセイ、店舗によって2℃で1％血清アルブミンおよびプロテアーゼ阻害剤（HALTプロテアーゼインヒビター、サーモサイエンティフィック、1から50ミリグラム/ mgでANX）の0.1 Mトリス-HCl mg / mLの。
2。動的光散乱
- 別々に0.1の光学密度になるようにPBSでSPIOとANX-SPIOを希釈し、ゼータサイザーナノDLSマシン（マルバーン社、ウスターシャー州、イギリス）3動的光散乱により解析する。
- Z-平均粒径と多分散性指数（PDI）と、化合物の単峰性のピークを（理想的）を取得します。単独で酸化鉄ナノ粒子のDLS-測定サイズにこのサイズを比較します。 ANX-SPIO DLSの結果は、同種のANX-SPIO種3を反映して、0.13 1のPDIの78 nmの共役粒子流体力学的直径を示した。
3。細胞培養、培養中のアポトーシスの誘導、培養細胞のMRI
- 文化成体マウス骨髄間葉系のDMEMのTEM細胞（のMMSC）は、好ましくは、通路20から30まで4℃、10％FBSを添加し、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（インビトロジェン社）。
- DOX（Sigma社、0.9％生理食塩水に1 mMのは、メディアに1μMの濃度）を12に37℃で時間を変化させるために処理することにより、培養細胞にアポトーシスを誘導する。
- ANX-SPIO（下記の3.4で説明）とMRIやTUNEL染色後、顕微鏡を用いた（APO-BrdUTM TUNELアッセイキット、Molecular Probes社/ Invitrogen社、ユージーン、OR）、またはANX-FITCで染色した後のいずれかを使用して、培養中のアポトーシスの量を定量（Roche社、スイス）。
- 37℃15分℃のため、ANX-SPIO（特に指定のない限りは10mgタンパク質/ mLの培地）で、または無料のSPIO（5 mg）の当量で細胞を標識SPIOナノ粒子の拡散を防ぐために、1％アガロース、1 mLのPBSで4回と、オーバーレイを洗います。料理のMRI（後述）を実行します。あるいは、細胞を洗浄し、DOXとANX-SPIO標識後トリプシン処理し、細胞ができるようにエッペンドルフチューブにペレットを形成しています。
4 体外 MRI で
- in vitroで MRI分析のための標準的な膝の受信コイル1.5または3テスラGE SignaのEXCITEスキャナを使用しています。
- 寒天ファントムに培養皿やチューブを配置し、勾配エコー甘やかされて育ったグラデーションのシーケンスを使用してイメージ：繰り返し時間（TR）550ミリ秒、エコー時間（TE）を10 ms、フリップ角15°、マトリクス256×256、フィールドのビュー3センチメートル×3 cmのスライス厚1.3ミリメートル、平均回数（NEX）2、間隔0ミリメートル5。固定領域（例えば、0.8ミリメートル2）地域·オブ·インタレスト（ROIを）を使用して、T2 *信号損失のためのプレート上の細胞層を介して軸方向に画像。寒天ファントムからの制御ROIの信号を使用して背景を調整します。ファントムを周囲の空気の信号からバックグラウンドノイズを測定します。
- [SIサンプルROI-SI制御ROI] / SIは信号強度で、[バックグラウンドノイズのSIのSD]と：MRIコントラスト対ノイズ比（CNRを計算するSDは標準偏差である）各培養皿を算出した。
5。代表的な結果
in vitroでの T2 *信号損失の測定は、同種の寒天ファントムおよびシグナルボイドアーティファクトを作成する気泡の欠如を必要とします。このアーティファクトはSPIOの本物のT2 *信号損失と区別することは困難であり、解釈結果に非常に重要です。空気のアーティファクトと同様に本物の酸化鉄T2 *信号損失の例については、 図1を参照してください。
in vitroでの培養皿イメージングのために、厚さ約1 mmである十分な軸方向のMRIスライスは、適切に画像全体の料理をさせることができるように、各培養皿に寒天ゲルの適切な量を適用します。 図2は、予想されるMRI信号を示しています寒天内の個々の培養プレートから。プレートの端でいくつかの信号変化は、int型の領域のように分析、典型的にありますerestは、これらの不均一な領域を避ける必要があります。
図1：ANX-SPIOは、培養新生児ラット心筋細胞のアポトーシスを検出します。 図1Aは、制御ソリューション（左チューブ）ANX-SPIO（中間管）、およびDOX + ANX-SPIO（右チューブ）で処理してペレット化した新生児の心筋細胞の写真を示しています。 。アポトーシス細胞におけるANX-SPIO化合物の増加の保持を反映して、DOX + ANX-SPIO処理した細胞の褐色がかった色に注意してください。 図1B は 、in vitro MRI画像では、DOXの強烈なT2 *信号損失+ ANX-SPIO細胞を示しています。また、気泡は、4 番目と信号ANX-SPIOのvoid、およびCNRの分析に影響を与えることに似ています第 5 回エッペンドルフチューブ（小さ な黒信号ボイド）の間に見られている。
図2：ANX-SPIO結合は、培養中のアポトーシス細胞に特異的である。 図2Aは、ANX-SPIOの低および高濃度（それぞれ、左と右）ANX-FLUOS染色またはANX-SPIO染色のいずれかに受け、培養皿上でアポトーシスラット新生児心筋細胞を、示しています。蛍光ANX（ANX-FLUOS）とANX-SPIOの高レベルと低レベルで処理したアポトーシス細胞の異なったT2 *信号損失（黒信号）に注意してください。右側に増加したT2 *信号の損失は、より高いASX-SPIOの濃度ではオフに出場された著しく減少ANX-FLUOS信号に関連付けられています。 図2Bは、ANX-SPIO対ANX-FLUOS信号と解離の競合的結合を示しています定数は、i K。 X軸は対数スケールでのアネキシン蛋白質濃度を示しています。
ムービー1。 補足表示するには、ここをクリック映画。
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Discussion
アネキシンVにSPIOをリンクするための説明した接合方法は、アネキシンとSPIOナノ粒子のカルボキシル部分の側鎖アミン基を利用しています。特定の酸化還元工程を経て、これらの化合物の共有結合を達成することができ、得られた官能性ナノ粒子を単離することができる。このメソッドは、興味のある他のタンパク質とナノ粒子に一般化することができる。
最も重要な手順は、酸化還元条件である適切な温度にして穏やかに混合しながら行った。低収率は、ろ過工程中に除去される残留遊離アネキシンVは、その結果、不完全な酸化または還元から発生する可能性があります。興味のある他のタンパク質に適用した場合、最適な条件は、上記のものと異なる場合があります。しかし、一度それらの最適な条件が定義されている、フィルタリングフリータンパク質はごくわずかに減少し、したがって、遠心ろ過メートルがありますAYは不要になります。確かに、過剰ろ過はフィルター自体への非特異的結合のために最終的な化合物の収率を減らすことができます。この問題が発生した場合、フィルタを介してアルブミン1％を事前にフィルタリングフィルタに共役化合物の非特異的結合を低減し、歩留まりを向上させます。最終化合物のDLS解析、および同様にろ液のタンパク質濃度の測定は、残留遊離タンパク質が存在するかどうか判断するのに役立ちます。
最終化合物の遊離SPIOの存在はまた、潜在的な汚染物質である。この目的のために、DLSは、純度を確認するために採用した。 DLSにより、単峰性のピークは特異酸化鉄種を確保するために役立ちます。フリーSPIOだけでは46nmで異なるDLSのピークを生成し、ANX-SPIO製剤は存在しませんでした。
バイオコンジュゲーションにはいくつかのオプションは、このようなカスタマイズされたNAのビオチン-ストレプトアビジン相互作用またはタンパク質の架橋結合させるなどの代替メカニズムを採用して利用できる6月12日です。noparticles。本明細書に示される方法は、特殊なナノ粒子を使用せずに、目的のタンパク質への磁性ナノ粒子の結合のための堅牢な、広く適用されるアプローチを示しています。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
国立衛生研究所、NHLBI（RD、PY、PS）。
米国心臓協会（JL）。
スタンフォード大学、VPUEグラント（JL）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
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