Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Syntese av en Published: July 31, 2012 doi: 10.3791/3775

Summary

Tidlig deteksjon av apoptose kan identifisere risikopersoner celle populasjoner i en rekke sykdommer. Her demonstrerer vi en metode for å koble en tidlig apoptose-deteksjon protein (Annexin V) til en MR-påvisbar jernoksid nanopartikler (SPIO). Denne metoden kan utvides til andre proteiner av interesse å generere MRI-sporbare Molecular Imaging sonder.

Abstract

Cellular apoptose er et fremtredende trekk ved mange sykdommer, og dette programmert celledød oppstår vanligvis før kliniske manifestasjoner av sykdommen er tydelig. En måte å oppdage apoptose i de tidligste stadiene, reversible ville ha råd til en pre-klinisk "vindu" hvor forebyggende eller terapeutisk tiltak kan treffes for å beskytte hjertet fra permanent skade. Vi presenterer her en enkel og robust metode for å konjugat menneskelig Annexin V (ANX), som ivrig binder seg til cellene i de tidligste, reversible stadier av apoptose, til superparamagnetiske jernoksid (SPIO) nanopartikler, som fungerer som en MR-detekterbar kontrastmiddel. Den konjugering metoden begynner med en oksidasjon av SPIO nanopartikler, som oksiderer karboksylgrupper på polysakkaridet skallet av SPIO. Renset ANX protein blir deretter lagt i innstillingen av en natrium borate løsning for å lette kovalente samspill av ANX med SPIO i en redusere buffer. En endelig reduksjon takt med natrium borohydride er utført for å fullføre reduksjon, og deretter reaksjonen er slukket. Ukonjugert ANX fjernes fra blandingen av mikrosentrifuge filtrering. Størrelsen og renhet ANX-SPIO produktet er bekreftet av dynamisk lysspredning (DLS). Denne metoden krever ikke tillegg til, eller modifisering av, polysakkaridet SPIO skallet, i motsetning til krysskoblede jernoksid partikkel konjugasjonsforsøkene metoder eller biotin-merket nanopartikler. Som et resultat, representerer denne metoden en enkel, robust tilnærming som kan utvides til konjugering av andre proteiner av interesse.

Protocol

Tilpasset fra tidligere studie 1.

1. Bøyning av Annexin V til SPIO

  1. Oksidere SPIO partikler (Ocean Nanotech Inc., 5 mg / ml) for 1 time ved 20 ° C i mørket i løsningen med 0,15 M natrium periodate (NaIO 4) (04:01 vekt: vekt ratio) 2.
  2. Inkuber oksidert SPIO for 12 t med renset ANX protein (1:1 ratio, vekt: vekt) i 0,15 M natrium borate (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) ved 20 ° C.
  3. Reduser blandingen videre i 1 time med natriumborhydrid (NaBH 4) under avtrekksskap og deretter slukke med 0,15 M Tris-HCl.
  4. Skill fri ANX fra ANX-SPIO ved sentrifugering på 14 000 xg (75 mikrometer pore Microcon filter, Millipore, Billerica, MA).
  5. Ytterligere forbedre forbindelsen ved å fjerne ubundne urenheter ved hjelp av en magnetisk separator enhet (Ocean Nanotech, Inc.).
  6. Kvantifisere filteret retentate (ANX-SPIO) protein nivåerav Bradford protein assay og oppbevar ved -80 ° C ved 2 mg / ml i 0,1 M Tris-HCl med 1% serum albumin og proteasehemmere (Halt proteasehemmer, Thermo Scientific, 1-50 mg / mg ANX).

2. Dynamisk lysspredning

  1. Separat fortynne SPIO og ANX-SPIO i PBS til en optisk tetthet på 0,1 og analysere ved dynamisk lysspredning i en Zetasizer Nano DLS maskin (Malvern Inc., Worcestershire, Storbritannia) tre.
  2. Skaff monomodal Peaks (ideelt sett) for det sammensatte, med en Z-gjennomsnittlig partikkelstørrelse og polydispersitet indeks (PDI). Sammenlign denne størrelsen til DLS-målte størrelsen på jernoksid nanopartikkel alene. ANX-SPIO DLS Resultatene viste en konjugatvaksine partikkel hydrodynamisk diameter på 78 nm med en PDI på 0,13 en, noe som reflekterer en homogen ANX-SPIO arter 3.

3. Cell Culture, Induksjon av apoptose i kultur, og MR av dyrkede celler

  1. Kultur voksen benmarg fra mus mesenchymale sTEM celler (mMSCs) i DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen, Inc.), fortrinnsvis ved passering 20 til 30 april.
  2. Indusere apoptose i kulturen cellene ved å behandle for varierende tider ved 37 ° C med DOX (Sigma, 1 mm i 0,9% saltvann, 1 mM konsentrasjon i media) 12.
  3. Kvantifisere mengden av apoptose i kultur ved hjelp av enten MR med ANX-SPIO (beskrevet i 3.4 nedenfor) eller ved hjelp av mikroskopi etter Tunel Pletten (APO-BrdUTM Tunel Assay Kit, molekylære prober / Invitrogen, Eugene, OR) eller etter flekken med ANX-FITC (Roche, Sveits).
  4. Merk cellene med ANX-SPIO (10 mg protein / ml medium unntak som nevnt), eller med en tilsvarende vekt av gratis SPIO (5 mg), for 15 minutter ved 37 ° C. Vask 4 ganger med PBS og klæ med 1 ml 1% agarose å hindre spredning av SPIO nanopartikler. Utfør MR av rettene (beskrevet nedenfor). Alternativt vaske cellene og trypsinize etter DOX og ANX-SPIO merking, så la cellene tildanne pellets i Eppendorf rør.

4. In Vitro MR

  1. Bruk en 1,5 eller 3 Tesla GE Signa EXCITE skanner med standard kne mottaker spole for in vitro MR analyse.
  2. Plasser kultur retter eller rør inn en agar Phantom, og bilde ved hjelp av en gradient-ekko bortskjemt gradient sekvens: Repetisjon Tid (TR) 550 ms, Echo Tid (TE) 10 ms, flip vinkel 15 °, matrix 256 256 x, felt- of-view 3 cm x 3 cm, skive tykkelse 1,3 mm, antall gjennomsnitt (NEX) 2, avstand 0 mm 5. Bilde aksialt gjennom cellen lag på tallerkenen for T2 * signaltap, bruker regioner-of-interesse (Rois) av en fast område (for eksempel 0,8 mm 2). Juster for bakgrunnen med kontroll ROI signal fra agar fantom. Mål bakgrunnsstøy fra signalet av luften rundt fantom.
  3. Beregn MR Kontrast-til-støy-forhold (CNR: [SI sample ROI-SI kontroll ROI] / [SD av SI bakgrunnsstøy], hvor SI er signal intensitet, ogSD er standardavviket) ble beregnet for hver kultur parabolen.

5. Representative Resultater

Måling av T2 * signaltap in vitro krever en homogen agar fantom og mangel på luftbobler, noe som vil skape signal ugyldig gjenstand. Denne gjenstanden er vanskelig å skille fra ekte T2 * signal tap av SPIO, og er kritisk til tolkbare resultater. Se Figur 1 for et eksempel på en luft gjenstand samt ekte jernoksid T2 * signaltap.

For in vitro kultur fatet bildebehandling, bruk en passende mengde agar gel til hver kultur tallerken, slik at tilstrekkelige aksiale MR skiver, som er ca 1 mm tykk, kan gjøres til adekvat bilde hele fatet. Figur 2 illustrerer den forventede MR signalet fra enkelte kultur plater i agar. Det er typisk noe signal variasjon på kantene av platen, så analyse av regionene i interest bør unngå disse ujevne områder.

Figur 1
Figur 1. ANX-SPIO oppdager apoptose i dyrkede neonatale rotte cardiomyocytes. Figur 1a viser et bilde av pelleterte neonatale cardiomyocytes behandlet med kontroll løsning (venstre tube), ANX-SPIO (midten tube), og DOX + ANX-SPIO (høyre tube) . Legg merke til brunaktig farge på DOX + ANX-SPIO behandlet celler, noe som reflekterer økt oppbevaring av ANX-SPIO sammensatte i apoptotiske celler. Figur 1B In vitro MR-bilder viser den intense T2 * signal tap av DOX + ANX-SPIO celler. Dessuten er en luftboble sett mellom 4. og 5. Eppendorf rør (liten svart signal void), som ligner på signalet ugyldig av ANX-SPIO, og som kan påvirke analysen av CNR.

Figur 2
Figur 2. ANX-SPIObinding er spesifikt for apoptotiske celler i kultur. Figur 2A viser apoptotiske rotte neonatale cardiomyocytes på kultur retter, utsatt til enten ANX-FLUOS flekker eller ANX-SPIO flekker, med lave og høye konsentrasjoner (venstre og høyre, henholdsvis) av ANX-SPIO. Legg merke til ulike T2 * signaltap (svart signal) av apoptotiske celler som ble behandlet med fluorescerende ANX (ANX-FLUOS) og lave nivåer versus høye nivåer av ANX-SPIO. Den økte T2 * signal tap på høyre er forbundet med en betydelig redusert ANX-FLUOS signal, som har blitt konkurrert ut av høyere ASX-SPIO konsentrasjoner. Figur 2B illustrerer konkurransedyktig bindingen av ANX-SPIO versus ANX-FLUOS signal og dissosiasjon konstant, K jeg. The X-aksen angir Annexin protein konsentrasjon i loggen skala.

Movie 1. Klikk her for å vise supplerendefilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrives konjugering metode for å koble SPIO til Annexin V utnytter sidekjettingen amin grupper av Annexin og karboksylgrupper moieties av SPIO nanopartikler. Gjennom konkrete oksidasjon-reduksjon trinn, kan kovalent kobling av disse forbindelsene kan oppnås, og den resulterende functionalized nanopartikler kan isoleres. Denne metoden kan generaliseres til andre proteiner og nanopartikler av interesse.

De mest kritiske trinnene er de oksidasjon og reduksjon forhold, utført i de aktuelle temperaturene og med forsiktig miksing. Lav avkastning kan skyldes ufullstendig oksidasjon eller reduksjon, noe som resulterer i gjenværende gratis Annexin V som er fjernet under filtrering trinnet. Da gjaldt andre proteiner av interesse, kan optimale forhold variere fra det som er beskrevet ovenfor. Men når disse optimale forhold er definert, det filtrerte frie proteinet kan reduseres til et ubetydelig beløp, og derfor mikrosentrifuge filtrering mja blir overflødig. Faktisk kan overskytende filtrering redusere endelig sammensatte avkastning på grunn av ikke-spesifikk binding til filteret selv. Hvis dette skjer, pre-filtrering 1% albumin gjennom filteret vil redusere uspesifikk binding av konjugert sammensatte til filteret og forbedre avkastningen. DLS analyse av den endelige sammensatte, og vel så Proteinkonsentrasjon målinger av filtratet, vil bidra til å avgjøre om gjenværende gratis protein er til stede.

Tilstedeværelsen av fritt SPIO i finalen forbindelsen er også en potensiell forurensning. For dette formål ble DLS ansatt for å kontrollere renhet. En monomodal topp med DLS bidrar til å sikre et entall jernoksid arter. Gratis SPIO produserer alene en distinkt DLS topp på 46nm og var ikke til stede i ANX-SPIO preparater.

Flere alternativer for bioconjugation finnes 6-12 som benytter de alternative conjugating mekanismer, slik som biotin-streptavidin interaksjon eller protein cross-linking av skreddersydde nanoparticles. Metoden som presenteres her representerer en robust, allment gjeldende tilnærming for konjugering av magnetiske nanopartikler til proteiner av interesse, uten bruk av spesialiserte nanopartikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).

American Heart Association (JL).

Stanford University, VPUE Grant (JL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superparamagnetic iron oxide Ocean Nanotech, Inc. ICK-40-005
Doxorubicin Sigma D1515-10MG
SuperMag Separator Ocean Nanotech, Inc. N/A
Zetasizer Nano DLS machine Malvern, Inc N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
  2. Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
  3. Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
  4. Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
  5. Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
  6. Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
  7. van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
  8. Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
  9. Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
  10. Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
  11. Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
  12. Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).

Tags

Molecular Biology Biomedical Engineering konjugasjon annexin jernoksid nanopartikler MR molekylær avbildning
Syntese av en<em&gt; In vivo</em&gt; MR-påvisbare Apoptose Probe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J., Simpson, P. C., Yang, P.More

Lam, J., Simpson, P. C., Yang, P. C., Dash, R. Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe. J. Vis. Exp. (65), e3775, doi:10.3791/3775 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter