Summary
La detección temprana de la apoptosis puede identificar en riesgo las poblaciones de células en una variedad de enfermedades. Aquí se demuestra un método para unir una de las primeras apoptosis de detección de la proteína (anexina V) a una nanopartícula de hierro óxido de la RM-detectable (SPIO). Este método puede extenderse a otras proteínas de interés para generar resonancia magnética detectables sondas de imagen molecular.
Abstract
La apoptosis celular es una característica prominente de muchas enfermedades, y esta muerte programada de las células normalmente se produce antes de las manifestaciones clínicas de la enfermedad son evidentes. Un medio para la detección de la apoptosis en sus primeras etapas, los reversibles que pagar un pre-clínica "ventana" durante el cual las medidas preventivas o terapéuticas que podrían adoptarse para proteger el corazón de un daño permanente. Se presenta aquí un método sencillo y robusto para conjugar humana anexina V (ANX), que se une ávidamente a las células en las primeras etapas, los reversibles de la apoptosis, que superparamagnéticas de óxido de hierro (SPIO) nanopartículas, que sirven como un agente de contraste para RM-detectable. El método de conjugación comienza con una oxidación de las nanopartículas Spio, que oxida grupos carboxilo en la cáscara de polisacárido SPIO. La proteína purificada ANX se añade a continuación en la configuración de una solución de borato de sodio para facilitar la interacción covalente de ANX con SPIO en un tampón de reducción. Una medida de reducción final con borohydrid de sodioe se lleva a cabo para completar la reducción y, a continuación la reacción se apaga. ANX no conjugado se elimina de la mezcla por filtración microcentrífuga. El tamaño y la pureza del producto ANX-SPIO es verificada por dispersión dinámica de luz (DAL). Este método no requiere además de, o la modificación de, el polisacárido SPIO cáscara, en oposición a reticulados métodos de óxido de hierro conjugación de partículas o nanopartículas marcado con biotina. Como resultado, este método representa un método sencillo, robusto que puede extenderse a la conjugación de otras proteínas de interés.
Protocol
Adaptado de un estudio previo.
1. La conjugación de Anexina V a SPIO
- Oxidar partículas Spio (Mar Nanotech Inc., 5 mg / ml) durante 1 hora a 20 ° C en la oscuridad en solución con 0,15 M de peryodato de sodio (NaIO 4) (04:01 peso: peso) 2.
- Incubar el SPIO oxidado durante 12 horas con la proteína purificada ANX (relación 1:1, el peso: peso) en 0,15 M de borato de sodio (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) a 20 ° C.
- Reducir la mezcla durante 1 hora más con borohidruro sódico (NaBH 4) bajo la campana de humos y después se apaga con 0,15 M de Tris-HCl.
- Separar la ANX libre de ANX-SPIO por centrifugación a 14.000 xg (75 micras de poro Microcon filtro, Millipore, Billerica, MA).
- Además refinar el compuesto mediante la eliminación de impurezas no unidas mediante un dispositivo separador magnético (Mar Nanotech, Inc.).
- Cuantificar el filtro retenido (ANX-SPIO) los niveles de proteínapor ensayo de proteínas Bradford y almacenar a -80 ° C a 2 mg / ml en 0,1 M Tris-HCl con 1% de suero de albúmina inhibidores de la proteasa y (inhibidor de la proteasa Alto, Thermo Scientific, 1-50 mg / ANX mg).
2. Dispersión de luz dinámica
- Separadamente diluir la SPIO y ANX SPIO-en PBS a una densidad óptica de 0,1 y analizar por dispersión dinámica de luz en una máquina Zetasizer nano DLS (Malvern Inc., Worcestershire, Reino Unido) 3.
- Obtener picos monomodales (idealmente) para el compuesto, con un tamaño de partícula promedio Z y el índice de polidispersidad (PDI). Comparar este tamaño al tamaño DLS-medida de la nanopartícula de óxido de hierro solo. ANX-DLS Spio resultados mostraron un diámetro de partícula hidrodinámico conjugado de 78 nm con un PDI de 0,13 1, lo que refleja un homogéneos Spio ANX especies 3.
3. Cultivo celular, la inducción de la apoptosis en cultivos, y la resonancia magnética de las células cultivadas
- Cultura ratón adulto de médula ósea mesenquimales scélulas TEM (MMSCs) en DMEM suplementado con FBS al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Inc.), preferiblemente en pasaje 4 20-30.
- Inducir la apoptosis en las células de cultivo mediante el tratamiento de diferentes tiempos a 37 ° C con DOX (Sigma, 1 mM en solución salina al 0,9%, 1 mM de concentración en los medios de comunicación) 12.
- Cuantificar la cantidad de apoptosis en cultivos utilizando resonancia magnética con ANX-SPIO (descrito en el punto 3.4 más adelante) o utilizando un microscopio después de la tinción de TUNEL (APO-BrdUTM Kit de ensayo de TUNEL, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) o después de la tinción con ANX-FITC (Roche, Suiza).
- Etiquete las células con ANX-SPIO (10 mg de proteína / ml de medio excepto como se indica), o con un peso equivalente de libre SPIO (5 mg), durante 15 min a 37 ° C. Lavar 4 veces con PBS, y de superposición con 1 ml de agarosa al 1% para evitar la difusión de las nanopartículas Spio. Realizar resonancia magnética de los platos (descrito más adelante). Alternativamente, se lavan las células y después trypsinize DOX y etiquetado ANX-SPIO, a continuación, permitir que las célulasformar gránulos en tubos Eppendorf.
4. In vitro RM
- Use un 1,5 o 3 Tesla GE Signa Excite escáner con la batería estándar de rodilla para el receptor in vitro análisis de resonancia magnética.
- Coloque las placas de cultivo o tubos en un fantasma de agar, y la imagen utilizando una secuencia de eco de gradiente gradiente de mal estado: tiempo de repetición (TR) 550 ms, tiempo de eco (TE) de 10 ms, ángulo de inclinación de 15 °, matriz de 256 x 256, sobre el terreno de vista de 3 cm x 3 cm, grosor de corte de 1,3 mm, el número de promedios (NEX) 2, el espaciado de 0 5 mm. Imagen axialmente a través de la capa de células sobre la placa para la pérdida de señal * T2, utilizando regiones de interés (ROIs) de un área fija (por ejemplo, 0,8 mm 2). Ajustar para obtener el fondo usando la señal de control de retorno de la inversión el fantasma de agar. Medir el ruido de fondo de la señal del aire que rodea al fantasma.
- Calcular la resonancia magnética con contraste-ruido (CNR: [SI-SI retorno de la inversión de la muestra de control de retorno de la inversión] / [SD de SI de ruido de fondo], en la SI es la intensidad de la señal, ySD es la desviación estándar) fue calculada para cada placa de cultivo.
5. Los resultados representativos
Medición de la pérdida de la señal T2 * in vitro requiere un fantasma de agar homogénea y la falta de burbujas de aire, lo que creará artefactos de señal sin efecto. Este artefacto es difícil de distinguir de la verdadera pérdida de la señal T2 * de SPIO, y es fundamental para los resultados interpretables. Por favor, vea la Figura 1 para un ejemplo de un artefacto de aire, así como óxido de hierro auténtica T2 * la pérdida de señal.
Para la formación de imágenes in vitro placa de cultivo, aplicar un volumen apropiado de gel de agar para cada placa de cultivo, de modo que suficientes cortes axiales de resonancia magnética, que son aproximadamente 1 mm de espesor, se pueden hacer de manera adecuada la imagen de la placa entera. Figura 2 ilustra la señal de resonancia magnética esperado a partir de placas de cultivo individuales en agar. Normalmente hay alguna variación de la señal en los bordes de la placa, de modo análisis de las regiones de interest deben evitar estas zonas irregulares.
Figura 1. ANX-SPIO detecta la apoptosis en cultivos de cardiomiocitos de ratas neonatales. Figura 1A muestra una foto de granulados cardiomiocitos neonatales tratados con solución de control (tubo izquierdo), ANX-SPIO (tubo de media), y DOX + ANX-SPIO (tubo de la derecha) . Tenga en cuenta el color marrón de la DOX + ANX-Spio las células tratadas, lo que refleja una mayor retención del compuesto ANX-SPIO en las células apoptóticas. Figura 1B in vitro de imágenes de resonancia magnética muestran la intensa pérdida de la señal T2 * de los DOX + ANX-Spio células. Además, una burbuja de aire se ve entre la 4 ª y 5 ª tubos Eppendorf (vacío pequeña señal de negro), que es similar a la señal de vacío ANX-SPIO, y que puede afectar el análisis de CNR.
Figura 2. ANX-SPIOunión es específica para las células apoptóticas en la cultura. Figura 2A muestra de apoptosis cardiomiocitos de rata neonatal en placas de cultivo, sometidos a cualquiera de ANX-Fluos manchas o ANX-SPIO tinción, con concentraciones bajas y altas (izquierda y derecha, respectivamente) de Ans-SPIO. Tenga en cuenta los diferentes T2 * la pérdida de señal (señal de negro) de las células apoptóticas que fueron tratados con fluorescentes ANX (ANX-Fluos) y niveles bajos en comparación con los altos niveles de ANX-SPIO. El aumento de la pérdida de T2 * señal a la derecha está asociada con una marcada reducción ANX-Fluos señal, que se ha competido por fuera superior Spio ASX-concentraciones. Figura 2B ilustra la unión competitiva de ANX-SPIO versus señal ANX-Fluos y la disociación del constante, K i. El eje X indica la concentración de proteína Anexina en escala logarítmica.
Película 1. Haga clic aquí para ver el suplementariopelícula.
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Discussion
El método de conjugación descrito para ligarse SPIO de Anexina V explota los grupos amino de cadena lateral de Anexina y los restos carboxilo de la nanopartícula SPIO. A través de específicas de oxidación-reducción pasos, unión covalente de estos compuestos se puede lograr, y la nanopartícula funcionalizado resultante puede ser aislado. Este método puede ser generalizado a otras proteínas y nanopartículas de interés.
Los pasos más importantes son las condiciones de oxidación y reducción, llevadas a cabo en las temperaturas adecuadas y con la mezcla suave. Bajo rendimiento puede ser consecuencia de la oxidación incompleta o reducción, lo que resulta en residual libre Annexin V que se elimina durante la etapa de filtración. Cuando se aplica a otras proteínas de interés, las condiciones óptimas pueden variar de las descritas anteriormente. Sin embargo, una vez que esas condiciones óptimas se definen, la proteína se filtró libre puede disminuir a una cantidad despreciable, y por lo tanto, m microcentrífuga filtraciónay se vuelven superfluas. En efecto, el exceso de filtración puede reducir el rendimiento compuesto final debido a la unión no específica a la propia filtro. Si esto ocurre, de pre-filtrado 1% de albúmina a través del filtro será reducir la unión no específica del compuesto conjugado con el filtro y mejorar el rendimiento. DLS análisis del compuesto final, y así como mediciones de la concentración de proteína del filtrado, ayudará a determinar si la proteína residual libre está presente.
La presencia de SPIO libre en el compuesto final es también un contaminante potencial. Para este fin, el DSL fue empleado para comprobar la pureza. Un pico monomodal a través de DLS contribuye a garantizar una especie de hierro de óxido singulares. Gratis SPIO por sí sola produce un pico de DLS distinto en 46nm y no estuvo presente en ANX-Spio preparativos.
Existen varias opciones para bioconjugación están disponibles 6-12 que emplean los mecanismos alternativos conjugación, tales como biotina-estreptavidina interacción proteína o reticulación de personalizar ndnoparticles. El método presentado en este documento representa un enfoque sólido, de amplia aplicación para la conjugación de nanopartículas magnéticas a las proteínas de interés, sin el uso de nanopartículas especializadas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los Institutos Nacionales de Salud, NHLBI (RD, Paraguay, PS).
Asociación Americana del Corazón (JL).
La Universidad de Stanford, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
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