Summary
Некоторые штаммы мыши способны противостоять индукции экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) с белком миелина основной. Описанный здесь простой протокол иммунизации, что меняет и вызывает невосприимчивость паралитического заболевания в нескольких типичных EAE стойкие загрязнения мыши.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС) и был использован в качестве животной модели для изучения человеческих болезней демиелинизирующей, рассеянный склероз (РС). EAE характеризуется патологической инфильтрации мононуклеарных клеток в центральной нервной системе и клиническими проявлениями паралитического заболевания. Как и в MS, EAE также находится под генетическим контролем в том, что некоторые штаммы мыши восприимчивы к болезни индукции, а другие являются устойчивыми. Как правило, C57BL / 6 (H-2, б) мышей, иммунизированных белком миелина основной (МБП) не развиваются паралитические знаков. Это отсутствие реакции, конечно, не из-за дефектов в обработке антигена или антигенов в MBP, как экспериментальный протокол, описанный здесь был использован, чтобы вызвать серьезный EAE в C57BL / 6, а также других известных штаммов мыши. Кроме того, encephalitogenic Т-клеток клонов из C57BL / 6 и BALB / C мышей реагирует на MBP был успехполностью изолирован и распространяются.
Экспериментальный протокол предполагает использование сотовой приемной системы денежных переводов, в которых MBP-загрунтовать (200 мкг / мышь) C57BL / 6 донорских клеток лимфатических узлов выделяют и культивируют в течение пяти дней с антигеном расширить пул MBP конкретных Т-клеток. В конце периода культивирования, 50 млн. жизнеспособных клеток передаются в наивных сингенных получателям через хвостовую вену. Получатель мышей таким образом рассматриваться как правило, не развиваются EAE, тем самым подтвердив их устойчивый статус, и они могут оставаться нормальной на неопределенный срок. Через десять дней после передачи ячейки, получатель мышей заражали Фрейнда адъювантной (CFA), эмульгированных MBP в четырех местах в бока. Тяжелые EAE начинает развиваться у этих мышей от десяти до четырнадцати дней после заражения. Результаты показали, что индукция болезнь антигенной конкретные задачи, как, не относящимися к антигенам не вызывает клинических проявлений болезни. Примечательно, что титрования дозы антигена используется длявызов получателя мышах показали, что это может быть как 5 мкг / мышь. Кроме того, кинетические исследования о сроках антигенной проблемы показал, что задача, чтобы вызвать заболевание было эффективным, как уже 5 дней после заражения и антигенные тех пор, пока на 445 дней после антигенной проблемы. Эти данные убедительно указывают на участие "долгоживущих" Т клеточной популяции в поддержании невосприимчивость. Участие регуляторных Т-клеток (Tregs) в этой системе не определен.
Protocol
1. Подготовка CFA-эмульгированных антигена
- Растворите морскую свинку MBP (подготовлен в соответствии с методом Swanborg1 и хранится в лиофилизированной форме при 4 ° С) в фосфатный буферный раствор (PBS) в концентрации 2 мг / мл. Если синтезированных пептидов MBP (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 используются, готовить 2 мг / мл раствора. Составьте соответствующее количество раствора антигена (0,1 мл на мышь подлежащих иммунизации) в стеклянный шприц с Луер-лок.
- Составьте объем адъювантной H37Ra Фрейнда (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) равна раствора антигена в другой стеклянный шприц оснащен Луер-лок.
- Соедините два шприцы стеклянные с трехходовым краном. Смешать MBP решение с CFA, нажав на поршни и обратно. Продолжайте движение, пока не образуется эмульсия.
- Чтобы проверить, если образуется эмульсия, олл смеси в одном шприце. Отсоедините пустой шприц, потяните тОн поршень немного и выполнять падения остаточной эмульсии в стакан с чистой водой комнатной температуры. Если эмульсия падения остается неизменной на поверхности воды, эмульсии. Если эмульсия падение рассеивается, снова шприцы и продолжают перемешивание движения.
- Используйте 1 мл шприц для иммунизации процесс, чтобы обеспечить доставку точной дозы антигена. Для передачи антигена эмульсии пластиковый шприц, вынуть поршень и вставить пустой пластиковый шприц в отверстие трехходового крана, где предыдущие стеклянный шприц был отключен, как в п. 1.4.
- Наполните шприц к краю, нажав на поршень стеклянный шприц. Вставьте поршень пластиковый шприц обратно и отодвинуть избыток эмульсии до достижения 1,2 мл отметки на пластиковый шприц. Этот маневр уверяет, что не осталось пузырьков воздуха в ловушке внутри пластикового шприца.
- Удалите пластиковый шприц с трехходовым краном. Аттач # 26 иглы для шприц. Надавите на поршень в 1 мл знак, так что теперь эмульсия заполняет пустоту объем иглы.
2. Иммунизация мышей-доноров
Примечание: Самки мышей C57BL / 6, как правило, вводят антиген эмульсии в четырех местах в бочках, после методы, первоначально разработанные группой McFarlin по 3 при Национальных институтах здравоохранения. Для опытного следователя, один человек может выполнять все задачи. Для начинающих, помощь может быть предложено, чтобы один человек держит мышь, а другой человек делает инъекции. Кроме того, мышь может быть анестезии для инъекций.
- Держите мышь крепко кожи шеи и удерживать хвост между 4-й и 5-й пальцы так, что грудная клетка и живот легко доступны.
- Поместите иглу 1 мл шприц на сайте в грудной клетке чуть выше правой подмышечной впадине (Моиспользования) и ввести 0,05 мл антигена эмульсии подкожно. Немного выпуклость беловатый CFA можно увидеть через бледную кожу. Повторите то же самое для сайта в грудной клетке чуть выше левой подмышкой.
- Отпустите хвост и взяться правой ноги (левой кнопки мыши), включите его и держите его между 4-й и 5-й пальцы. Найдите место чуть ниже ребра случае правый фланг и ввести 0,05 мл антигена эмульсии.
- Отпустите правую ногу, поверните мышь в другую сторону и удерживайте левую ногу (указателя мыши) между 4-й и 5-го пальцев. Найдите место чуть ниже ребра случае в левый фланг и ввести 0,05 мл антигена эмульсии.
- Изменения в новой иглой после введения 10 мышей, или если игла становится притупляется.
3. Выделение клеток лимфатических узлов для тканевых культур от 7 до 10 дней после иммунизации
- Семь до 10 дней после иммунизации, пожертвовать мышейи удалить дренаж лимфатических узлов. Предпочтительный способ эвтаназии СО 2 вдоха. После того, как жертва, лежал мыши на спине на вскрытие доску с конечностями протянул и крепится к плате с контактами. Мыши смоченной спрей 70% этанола.
- Вырезать отверстие в коже продольно в середине от нижней части живота до подбородка стерильными ножницами и щипцами.
- Разрежьте живот кожу от области паха до каждой ногой. Пил назад и придавить кожу, обнажая паховых лимфатических узлов.
- Разрежьте кожу вдоль передних (левый и правый), так что кожа может быть очищены назад и скованы, чтобы разоблачить подмышечные лимфатические узлы возле подмышек.
- С двумя парами щипцы работать вместе, оторваться соединительной ткани, покрывающие и вокруг паховых лимфатических узлов. Когда соединительной ткани удаляются, поместите одну пару щипцов в лимфатических узлах и оторваться от тела. Поместителимфатических узлов в 35 мм блюдо Петри наполняется стерильным PBS.
- Потяните от соединительной ткани, покрывающие две подмышечные лимфатические узлы, используя две пары щипцов. Изолировать лимфатических узлов и поместить их в чашку Петри. Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить кровеносные сосуды пересечения области, как кровотечение делает выявления лимфатических узлов очень трудно.
- После того как все лимфатические узлы собирают, переместите чашку Петри с капюшоном биобезопасности. Перерыв и дразнить в лимфатических узлах, кроме с двумя парами щипцы, шлифовальные друг против друга. Кроме того, в лимфатических узлах можно разбить с помощью плоского конца поршень 3 мл пластиковый шприц давит на лимфатические узлы на дне чашки Петри.
- Передайте дразнили лимфатических узлов клеточной суспензии через нейлоновую сетку для удаления оболочки и мусора.
- Макияж клетки лимфатических узлах подвески до 50 мл стерильные PBS. Центрифуга на 1000 оборотов в минуту в течение 10 мин. Ресуспендируют гранул в культуральной среде. У жизнеспособной влокоть рассчитывать и регулировать концентрацию до 4 х 10 6 клеток / мл. UseRPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ MEM пируват натрия, 0,1 ммоль MEM без незаменимых аминокислот, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ буфера Hepes и 5 х 10 -5 М 2-ME. Предварительно теплой культуры до ресуспендирования клеток.
- Культуры клеток в 24-луночных культуры с объемом 2 мл на лунку (конечная концентрация ячейки 8 х 10 6 клеток / лунку). Добавить антигена в каждую лунку в конечной концентрации 100 мкг / мл. Место культуры пластины в 37 ° C инкубатор с 5% CO 2. Инкубируйте клетки в течение 5 дней.
4. Сбор культивируемых клетках лимфатических узлов 5 дней после начала культур
- Смешать клеток в каждой лунке с помощью пипетки вверх и вниз с Пастера стеклянную пипетку или маленький объем пипетки. Урожай клеток в 50 мл центрифужные пробирки.
- Центрифуга клеток при 1000 оборотов в минуту в течение 10 мин. Resusзависеть осадок клеток в небольшом объеме PBS.
- Граф клеток и регулировать жизнеспособной концентрации клеток до 2,5 х 10 8 клеток / мл стерильной PBS. Нарисуйте клеток в шприц снабжен № 26 иглы.
- Поместите тепла лампы в клетку получателя мыши, чтобы расширяться в хвостовую вену.
- Использование мыши держатель, расширить хвост мыши через щель в держателе. Потяните расширить хвост. Найдите вены.
- Вводите 0,2 мл / мышь суспензии клеток, равное 5 х 10 7 клеток.
5. Антигенная Проблема Получатель Мыши 20 дней после передачи сотового и развития симптомов заболевания
- Проблема мышей получатель не показывает признаков заболевания с антигеном. Процедуры же, как и раздел 2 «Иммунизация мышей-доноров".
- Соблюдайте развития паралитического заболевания от 7 до 10 дней после антигенной проблемы.
- Болезнь начинается со слабости в хвосте. Болезнь оценивается как 1когда хвост становится вялым. Болезнь классифицируется как 2, когда мышь парализована в одной задней конечности. Болезнь классифицируется 3, когда обе задние конечности парализованы и мышь тащит обеих задних конечностей при сканировании вперед. Болезнь классифицируется 4, когда мышь теряет использования как передние конечности, в результате чего мыши совершенно неподвижно. Болезнь оценивается 5, когда указатель мыши находится умирающий, и тело сворачивается. Смерть как болезнь набрал 6 класса 4.
- MBP конкретных EAE индуцированные в C57BL / 6 мышей после этого протокола является монофазный. Мыши могут оправиться от болезни, но не спонтанно рецидивов.
6. Представитель Результаты
Мыши, которые получили загрунтовать и в пробирке расширенной донорских клеток лимфатических узлов не развиваются симптомы заболевания EAE, отражая их устойчивость к болезням индукции. Тем не менее, тяжелые заболевания разработаны после антигенной проблемы (см. таблицу), что свидетельствует о способности антигенной проблемыв изменении сопротивления механизма. Две особенности антигенного задачей отмеченные дозы антигена и кинетики задача, чтобы вызвать заболевание. Очень низкие дозы антигена необходимо, как показано в табл. Удивительно, что у мышей, получавших донорские клетки в прошлом году все еще может развиться тяжелые болезни, когда вызов с антигеном (табл. IV). Эти два наблюдения убедительно свидетельствуют участия "долгоживущих" Т-клеток в поддержании EAE сопротивления. Этот протокол применяется для многих EAE штаммов мыши 4.
Рисунок 1. Блок-схема эксперимента для индукции EAE в известных штаммов мыши.
| Клинические EAE После передачи приемных | |||||||
| Напрягать | Антиген | падение | Av. болезнь класса (Диапазон) | Av. День начала (Диапазон) | Падение | Av. болезнь класса (Диапазон) | Av. День начала (Диапазон) |
| SJL | MBP | 21/21 | 4.0 (3-5) | 8.0 (6-10) | ND | ND | ND |
| C57BL / 6 | MBP | 0/10 | - | - | 7/7 | 3.85 (3-5) | 9.28 (9-10) |
| BALB / с | MBP | 0/7 | - | - | 5/5 | 3.2 (3-4) | 7.0 (7) |
| C3H/HeJ MBP | 0/7 | - | - | 4/4 | 3.2 (3-4) | 8.0 (8) | |
| C57BL / 6 | MBP 60-80 | 0/4 | - | - | 4/4 | 2.75 (2-4) | 10.2 (9-11) |
Таблица I. Индукция MBP-опосредованной EAE в C57BL / 6 мышей. Приемные передачи загрунтовать и в пробирке расширенной клетки донора не вызывает EAE в C57Bl / 6 мышей. Антигенная после заражения клетки передачи оказанных мыши восприимчивы к болезням индукции. Av., В среднем. Н.Д., не было сделано.
| Клинические EAE после антигенной проблемы | ||||
| Грунтовка антигена | Проблема антигена | Падение | Av. болезнь класса (Диапазон) | Av. День начала (Диапазон) |
| MBP-CFA | CFA только | 0/3 | - | - |
| MBP-CFA | ОВА-CFA | 0/3 | - | - |
| MBP-CFA | MBP-CFA | 3/3 | 4.0 (4.0) | 7.7 (7-9) |
Таблица II. Специфика антигенной проблемы. Мыши-реципиенты были оспорены с грунтовки антигена, а также других не имеет значения антигенов. Только грунтовки антиген индуцированной тяжелой болезни. OVA: курица овальбумина. Av., В среднем.
| Клинические EAE после антигенной проблемы | |||
| Проблема антиген дозы (мкг / мышь) | Падение | Av. болезнь класса (Диапазон) | Av. День начала (Диапазон) |
| 200 | 4/4 | 3.75 (3-4) | 8.25 (7-9) |
| 100 | 4/4 | 3.67 (3-4) | 7.5 (7-8) |
| 50 | 4/4 | 3.25 (3-4) | 8.25 (7-10) |
| 25 | 4/4 | 3.0 (3.0) | 8.25 (8-9) |
| 10 | 4/4 | 3.0 (3.0) | 8.76 (8-9) |
| 5 | 4/4 | 2.5 (2-3) | 9.75 (9-10) |
| 1 | 2/4 | 1.0 (1.0) | |
| 0 | 0/4 | - | - |
Таблица III. Дозы антигена вызов, необходимых для индукции заболевания. Различные концентрации MBP использоваться, чтобы бросить вызов получателя мышей были протестированы. Av., В среднем.
| Клинические EAE после антигенной проблемы | ||||
| Проблема антигена | День Вызова | Падение | Av. Болезнь класса (Диапазон) | Av. День начала (Диапазон) |
| MBP-CFA | 5 | 3/4 | 1.33 (1-2) | 9.67 (9-10) |
| MBP-CFA | 10 4/4 | 3.0 (3.0) | 8.25 (7-9) | |
| MBP-CFA | 15 | 4/4 | 3.75 (3-4) | 7.25 (7-8) |
| MBP-CFA | 25 | 4/4 | 4.0 (4.0) | 8.0 (7-9) |
| MBP-CFA | 35 | 4/4 | 3.5 (3-4) | 7.5 (7-8) |
| MBP-CFA | 60 | 4/4 | 3.75 (3-4) | 9.0 (8-10) |
| -------------------------- | ||||
| MBP-CFA | 343 | 3/3 | 3.0 (3.0) | 10.33 (10-11) |
| MBP-CFA | 445 | 3/3 | 3.0 (3.0) | 7.0 (7.0) |
Таблица IV. Кинетика антигенный вызов. Мыши-реципиенты были оспорены в различные точки времени после принятияив переноса. Av., В среднем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования EAE у мышей часто используют neuroantigens, основного белка миелина (ОБМ), proteolipid белок (ПЛП) или миелин олигодендроцитов белка (МНГ). Более ранние исследования в основном используется MBP. ПЛП стимулирует сильные и последовательные ответы SJL мышей. Совсем недавно, MOG является общим neuroantigen используется потому, B6 мыши восприимчивы к болезни индукции с этим антигеном. Многие из этих генов целевых линий мышей находятся на B6 генетического фона. Интересно, В6 мыши восприимчивы к EAE индукции MOG, но устойчивы к болезням индукции MBP.
Большая часть предыдущих усилий в выяснении механизмов EAE сосредоточена на индукции механизмов заболевания, воздействие цитокинов и восстановлению посредничестве регуляторных Т-клеток 5-7. Как известный EAE устойчивы мыши могут подорвать индукции заболевания, с другой стороны, не были широко исследованы. Это может быть связано с трудностями количественного иnresponsiveness. Арнон 8 в 1981 году впервые показали, что лечение B6 мышей с циклофосфамидом оказали эти мыши восприимчивы к EAE индуцированные MBP. Другие показали, что лечение анти-гамма-интерферона успешно индуцированных заболеваний B6 и BALB / C мышей 9,10. Следует отметить, что эти исследования всех целевых без антиген специфических маркеров. С другой стороны, протокол, описанный здесь основное внимание уделяется различным аспектам EAE сопротивления. Вот только антиген используется в проблему можно преодолеть невосприимчивость EAE и позволяет индукции заболевания. Этот протокол включает в себя как EAE фаза сопротивления с приемными передачи загрунтовать клетки донора T и восприимчивость фазы с антигенной проблемы (табл. I). Эксперименты могут быть направлены на изучение внутренних факторов, которые поддерживают EAE сопротивление, а также факторы, изменить эту невосприимчивость. Сначала было показано, что мыши устойчивы EAE смогли установить аутоиммунных реакций при иммунизациис MBP 4. Позже было показано, что encephalitogenic Т-клеток существуют в этих мышах 2. Некоторые недавние исследования показали, что 11,12 лечения B10.S мышей с анти-CD25 антител до вакцинации мышей proteolipid белок (ПЛП) превратили мышей из устойчивых к восприимчивым, подразумевая, роль регуляторных Т-клеток (Tregs) в поддержание EAE сопротивления. Однако, это не тот случай, когда C57BL / 6 мышей так же лечение и иммунизированных MBP 13. Большинство мышей остаются безучастными. Таким образом, EAE сопротивление может быть многофакторным. Он предположил, что, в случае C57BL / 6 мышей в ответ на MBP, тимуса выбор удалил наиболее MBP-реактивных Т-клеток, что частоты MBP-реактивных Т-клеток на периферии очень низкие. Это ниже порога низкой частоты сделает мыши не в состоянии реагировать на иммунизацию с MBP. Задача дозы, через неизвестных механизмов, в состоянии преодолеть проблемы частоты и мount аутоиммунный ответ. Дальнейшие исследования возможных механизмов будет включать в себя роли ИЛ-6 12 при антигенной проблемы, влияющие на восприимчивость encephalitogenic к ингибированию Tregs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет раскрытия финансовой информации.
Acknowledgments
При частичной поддержке грантов от Национального института здоровья (R01 NS37253 и N01 NS055167) и Национальное общество рассеянного склероза (RG 3288-A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guinea pig spinal cords |  Rockland Immunochemicals |
GP-T065 | frozen |
| Freund’s Adjuvant, complete H37Ra | Difco Laboratories | 231131 | |
| Multifit interchange-able syringe | BD Biosciences |
512133 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. |
10-040-CM | |
| OVA | Sigma-Aldrich |
A5503 | |
| Mice | Jackson Laboratory | B6 mice: 0000664 | Bar Harbor, Maine |
References
- Swanborg, R. H. Experimental allergic encephalomyelitis. Methods in Enzymology. Sabato, G. D. 162, Academic Press. New York, NY. 413-421 (1988).
- Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage. J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).
- McCarron, R., McFarlin, D. E. Adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J, PL/J, and (SJL/J x PL/J)F1 mice. Influence of I-A haplotypes on encephalitogenic epitope of myelin basic protein. J. Immunol. 141, 1143-1149 (1988).
- Shaw, M. K., Kim, C., Ho, K. -L., Lisak, R. P., Tse, H. Y. A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains. J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).
- Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. S., Wekerle, H. Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis. Nat. Med. 15, 626-632 (2009).
- Anderson, A. C., Reddy, J., Nazareno, R., Sobel, R. A., Nicholson, L. B., Kuchroo, V. K. IL-10 plays an important role in the homeostatic regulation of the autoreactive reperteroire in naïve mice. J. Immunol. 173, 828-834 (2004).
- Anderton, S. M. Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed. Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).
- Arnon, R. Experimental allergic encephalomyelitis - susceptibility and suppression. Immunol. Rev. 55, 5 (1981).
- Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., Carton, H. Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-g. J. Immunol. 140, 1506-1510 (1988).
- Arbomson-Leeman, S., Alexander, J., Bronson, R., Corroll, J., Southwood, S., Dorf, M. Experimental autoimmune encephalomyelitis-resistant mice have highly encephalitogenic myelin basic protein (MBP)-specific T cell clones that recognize a MBP peptide with high affinity for MHC class II. J. Immunol. 154, 388-398 (1995).
- Reddy, J., Illes, Z., Zhang, X., Encinas, J., Nicholson, L., Sobel, R. A., Wucherpfennig, K. W., Kuchroo, V. K. Myelin proteolipid protein-specific CD4+CD25+ regulatory cells mediate genetic resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15434-15439 (2004).
- Korn, T., Reddy, J., Gao, W., Bettelli, E., Awasthi, A., Petersen, T. R., Backstrom, B. T. Myelin- specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature Med. 13, 423-431 (2007).
- Shaw, M. K., Li, J., Ho, P. P., Hao, H., Lisak, R. P., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific adoptive experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Longevity of donor T cells and lack of disease relapses. Neuroimmunology Research Focus. Broglie, P. V. , Nova Science Publisher. New York. 175-191 (2007).
