Summary
De fibroblast explantaatkweek protocol uit menselijke huid stansbiopsieën is een technisch robuuste en eenvoudige manier om huidcellen te leiden binnen 4-8 weken voor het bankwezen van ongeveer 15-20 miljoen cellen bij een lage passage nummer.
Abstract
Weefsels en cellijnen afgeleid van een individu met de ziekte zijn ideaal bronnen ziektegerelateerde cellulaire fenotypes bestuderen. Patiënten afkomstige fibroblasten in dit protocol zijn met succes gebruikt bij de afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen tot modelziekte 1. Vroege passages van deze fibroblasten kunnen ook worden gebruikt voor cel-gebaseerde functionele assays voor specifieke biologische veranderingen, mechanismen 2 en volgende geneesmiddelen screeningsmethoden bestuderen. Het voordeel van het gepresenteerde protocol via enzymatische procedures zijn 1) de reproduceerbaarheid van de techniek van kleine hoeveelheden weefsel afkomstig van oudere patiënten, bijvoorbeeld patiënten die met de ziekte van Parkinson, 2) de technisch eenvoudige benadering via moeilijker methodologieën middels enzymatische behandelingen, en 3 ) de tijd houden: dit protocol duurt 15-20 minuten en kan direct na aankomst biopsie worden uitgevoerd. Enzymatische behandelingen kan tot 4 uur en hebben de problemen vanoverdigestion, vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende aanhechting van cellen wanneer ze niet goed behandeld. Dit protocol beschrijft de ontleding en de bereiding van een 4-mm menselijke huidbiopsie voor het afleiden van een fibroblast cultuur en heeft een zeer hoog slagingspercentage wat belangrijk is bij de behandeling van patiënten afkomstige weefselmonsters. In deze cultuur, keratinocyten migreren uit de biopsie weefsel binnen de eerste week na de bereiding. Fibroblasten weergegeven 7-10 dagen na de eerste uitloper van keratinocyten. DMEM hoge glucose media aangevuld met 20% FBS bevordert de groei van fibroblasten dan keratinocyten en fibroblasten zal de keratinocyten overwoekeren. Na 2 passages keratinocyten werden verdund uit wat resulteert in relatief homogene fibroblastculturen die de fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47) uitdrukt. Met deze aanpak kan 15-20000000 fibroblasten worden afgeleid in 4-8 weken voor mobiele bankieren. De huid dissectie duurt ongeveer 15-20 minuten, worden de cellen dan een keer per dag bewaaktonder de microscoop, en de media werden elke 2-3 dagen na hechting en uitgroei van cellen.
Protocol
De huid punch biopsie verkregen met behulp van standaard procedure 3 (bijvoorbeeld verkregen met 4mm ronde Visipunch instrument) moeten in volledige DMEM 20% FBS media worden bewaard op ijs. Nadat het monster is aangekomen in het laboratorium verwerken biopsie zo spoedig mogelijk.
1. Voorbereiding van de huid Punch biopsie
STEPS 1,1-1,3 IS BINNEN EEN bioveiligheid kast TE VOEREN
- Bereid vooraf Voeg 1 ml van 0.1% gelatine aan elk putje van een 6-wells plaat. Stel de plaat opzij voor 30-60 minuten. Zuig het gelatine-oplossing en voeg 800 ul compleet DMEM/20% FBS medium in elk putje. Ervoor te zorgen dat het gehele oppervlak van de put is bedekt met media.
- Keer de deksel van een steriele 10 cm weefselkweek schotel en voeg 1,5 ml DMEM / 20% FBS media naar het midden van het deksel en verspreid de media druppel met de punt van de serologische pipet.
- Met behulp van een steriele pincet, plaats tHij huidbiopsie stuk in de media op de schotel.
2. Dissectie van de huid Punch biopsie
STEPS 9 2,1-2,2 IS BINNEN EEN HORIZONTALE laminar flow HOOD TE VOEREN
- Plaats het onderste gedeelte van 10 cm schotel op omgekeerde deksel en breng de huidbiopsie de stereomicroscoop in de laminaire stroming kap.
- Ontleden van een 4-mm rond huidbiopsie in 12-15 gelijke grootte stukken met scherpe randen door te snijden stukken in gelijke helften met een scalpel om de biopsie op zijn plaats houden en de tweede scalpel te snijden met een rollende beweging in een richting. Stukken met rafelige randen bijdragen aan een slechte hechting / cel uitgroei.
3. Overdracht van Ontleed huidbiopsie Pieces in weefselkweekplaten
STEPS 3,1-3,6 IS BINNEN EEN bioveiligheid kast TE VOEREN
- Plaats het onderste gedeelte van de 10 cm weefselkweekschaalop de top van de omgekeerde deksel, en de overdracht schotel terug in de bioveiligheid kast.
- Met een puntige tang, plaats 2-3 biopsie stukken in elk putje van de bereide 6-wells plaat met 800 ul en niet op droog putjes. Gebruik tikken of schuivende beweging te krijgen van de stukken te hechten aan de bodem van de put. Een scalpel is nuttig om eventuele biopsie stukken uit de tang te verwijderen.
- Plaats de 6-well plaat in de 37 ° C incubator. Monitor dagelijks of er een film van media-coating de bodem van het putje van de eerste week, voeg -200 pl elke 2 dagen elk afgedampt media vervangen.
- Na een week, verhogen bedrag van media 2 ml compleet DMEM/20% FBS en media elke verandering 2-3 dagen.
- Zodra fibroblasten confluent in elk putje tot het punt waar de fibroblasten bereiken van de randen van de put, en trypsinize passage 6-well plaat in 2X T75 kolven (passage 1). De stukken weefsel kunnen worden overgedragen ook. Ze zullen niet hechten en worden gewassen out tijdens de volgende media veranderen.
- Zodra fibroblasten zijn samenvloeiing, overbrengen naar 3X T175 kolven (passage 2), bevriezing van de volledige DMEM media plus 10% DMSO bij 1x10 6 cellen / ml per flacon.
4. Karakterisering van de fibroblasten door Immunokleuring
- Cultuur fibroblasten in 8 goed kamer dia gecoat met gelatine.
- Wanneer cellen bij 80% confluentie, zuig het medium uit elk putje.
- Fix cellen in 4% paraformaldehyde gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.
- Was de putjes 3 keer met 1X PBS.
- Permeabel de cellen met 150 ul 0,3% Triton X-100 (in PBS) gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Was de putjes 3 keer met 1X PBS.
- Voeg 200 gl blokkerende oplossing (PBS + 5% normaal geit serum (Vector, S-1000)) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Bereid een 1:250 verdunning van anti-SERPHIN-1 (anti-konijn, mAB, Sigma, S5950-200 ul) in blokkeeroplossing.
- EenSpirate de blockingbuffer en voeg 150 ul van de verdunning van 1:250 van AntiSERPINH-1. Incubeer 1-2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C overnacht.
- Was de putjes 3 keer met 1X PBS.
- Bereid een 1:200 geit-anti-konijn monoklonaal antilichaam (Alexa Fluor geit anti-konijn IgG (H + L), Invitrogen, A11008) in blockingbuffer.
- Voeg 150 ul van 1:200 geit-anti-konijn monoklonaal antilichaam aan elk putje. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur.
- Wassen wells eenmaal met 1 x PBS.
- Zuig het PBS, en til de kamers af om alleen de dia te onthullen.
- Monteer de dia met een 2-3 druppels montage medium met DAPI (Vector, H-1200).
- Analyseer de dia onder een fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Keratinocyten groeien uit de biopsie stukken zo spoedig 48 uur na dissectie. Eerste fibroblasten uitgroei kan worden waargenomen ongeveer een week na verwerking. Zodra de putjes confluentie hebben bereikt, worden fibroblasten gepasseerd voor twee passages op drie 150 cm kolven (T150) te bereiken en de cellen worden ingevroren. We genereren deze werkwijze 15-20.000.000 cellen. De fibroblasten zijn positief voor anti-SERPINH1 (ook bekend als HSP-47) (figuur 1), die een collageen-specifieke moleculaire chaperone in het endoplasmatisch reticulum. HSP47 speelt een essentiële rol in de biosynthese van collageen in de huid fibroblasten (Kuroda et al., 2004).
TIME LINE
| Dag | Verwachting | ||
| Dag 3 - Dag 7 | Gehechtheid en uitgroei van keratinocyten | Dag 7 - Dag 14 | Uitvloeisel van fibroblasten |
| Dag 25-Day 35 | Fibroblasten moet de 6-well plaat te dekken en moeten zijn voor passage in 75cm kolven, passage een tweede keer in 150cm kolven | ||
| Dag 30-Day 50 | Bevriezen af als 1Mio cellen / flesje ongeveer 15-20 miljoen cellen in compleet DMEM media plus 10% DMSO |
Figuur 1. Anti-SERPHIN1 immunohistochemie van patiënten afkomstige fibroblast cultuur met DAPI tegenkleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met dit protocol, kan relatief zuivere culturen van de huid fibroblasten worden verkregen. De fibroblasten hebben karakteristieke morfologische kenmerken van langwerpige, spindel-achtige cellichamen, rond tot ovaal celkernen, en de fibroblasten groeien uitgelijnd en in bundels bij samenvloeiing. De media ondersteunt de groei van fibroblasten terwijl andere celpopulaties zoals keratinocyten nodig extra toeslagen en groeifactoren, of zijn mitotically minder actief, dit zorgt voor relatief zuiver fibroblastculturen.
De fibroblasten worden vervolgens gepasseerd met trypsine in een 1:03-01:05 verhouding. De cultuur wordt uitgebreid met de gewenste hoeveelheid fibroblasten (15-20 miljoen) binnen 4-8 weken.
Met behulp van deze techniek, heeft ons laboratorium afgeleid dan 70 fibroblast lijnen succesvol. We hebben elke lijn te laten testen op besmetting met mycoplasma en antibiotica toe te voegen aan de groei van media om andere bacteriële besmetting te voorkomen. Voor de iNITIËLE explantaatkweek vonden we dat 20% FBS in de media ondersteunt de groei, maar in latere doorgangen 10% FBS voldoende. Soms, zien we een directe uitgroei van fibroblasten uit de huid stukken waarschijnlijk door de snijhoek van de huid en het verwijderen van de epidermis die keratinocyten bevat.
Een soortgelijke techniek met behulp van een dekglaasje op de huid stukken ingedrukt was minder effectief in onze handen 4. Als gevolg van de beweging van het dekglaasje binnen cultuur schotel-zelfs wanneer behandeld met grote zorg-de huid stukken niet goed hechten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ontwikkeling van dit protocol werd gefinancierd door het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM, TR1-01246) en Parkinson Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
|||
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
|||
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
