推导人类纤维原细胞的皮肤穿刺活检植文化

Summary

成纤维细胞植体培养协议，从人体皮肤打孔活检是一种技术上的强大和简单的方法来获取皮肤细胞银行约15-20万个细胞在低通道数的4-8周内。

Abstract

组织和细胞系来自个人与疾病的理想来源，以研究疾病相关的细胞表型。已成功应用于病人在本协议中的成纤维细胞在诱导多能干细胞疾病模型的推导。这些成纤维细胞的早期通道也可以用于基于细胞的功能分析研究特定的疾病的途径，机制²和随后的药物筛选方法。超过酶的程序提交的协议的优点1）再现性的技术从来自年龄较大的病人， 例如，患者的影响与帕金森氏病，2）在更具挑战性的的方法在技术上简单的方法使用酶处理的组织的小金额，和3 ）的时间代价：这个协议需要15-20分钟，可以立即进行活检后到达。酶处理可能需要长达4个小时，并有问题过量，降低细胞活力和随后附着的细胞时，没有妥善处理。本协议描述的解剖和准备一个4毫米的推导成纤维细胞培养人体皮肤活检，并具有非常高的成功率，处理病人源性组织样品时，这是非常重要的。在这种文化中，角质形成细胞活检组织内迁移出后的第一周准备。后的第一个产物，角质细胞，成纤维细胞出现7-10天。与20％FBS高糖DMEM培养基，有利于在角质形成细胞和成纤维细胞，成纤维细胞生长长满角质细胞。已稀释后第2代角质形成细胞产生相对均匀的成纤维细胞培养成纤维细胞的标记SERPINH1（HSP-47）表达。使用这种方法，所产生15-20万成纤维细胞可以在4-8周后细胞银行。皮肤剥离大约需要15-20分钟，细胞，然后每天一次监测在显微镜下，和媒体改变附件和细胞的产物，后每隔2-3天。

Protocol

皮肤穿刺活检获得使用标准程序（ 例如采用4mm圆Visipunch仪器获得）应保持在完全DMEM 20％FBS媒体冰上。一旦样品在实验室里，已经到达处理活检尽快。

1。制备皮肤穿刺活检

步骤1.1-1.3的内部进行生物安全柜

1. 预先准备：0.1％明胶的6孔板的各孔中加入1毫升。设置板预留30-60分钟。吸出的明胶溶液，然后向每孔中加入800μl的完整的DMEM/20％FBS的媒体。确保井的整个表面上覆盖有介质。
2. 一个无菌的10厘米的组织培养皿的盖，倒置的盖子的中间，并添加1.5毫升的DMEM / 20％FBS媒体和传播媒体与血清吸管的尖端下降。
3. 使用无菌镊子，它放在他的皮肤活检片在媒体上的菜。

2。解剖皮肤穿刺活检

步骤9 2.1-2.2的水平层流罩内进行

1. 将菜倒盖10厘米，底部和转移的皮肤活检解剖显微镜在层流罩。
2. 解剖一个4毫米的圆形皮肤活检成12-15均匀大小的块边缘锋利切割片相等的两半，用一个手术刀举行活检到位，第二手术刀切在一个方向滚动运动。件与衣衫褴褛的边缘不畅附件/的细胞生长。

3。解剖皮肤活检件传输到组织培养板

步骤3.1-3.6内执 ​​行生物安全柜

1. 将10厘米的组织培养皿的底部回顶部倒盖，和输送盘的生物安全柜。
2. 使用尖头镊子，准备含800微升，而不是干井6孔板，每孔2-3活检件。使用窃听或滑动件附加到井的底部。手术刀是有用的，以消除任何活检件镊子。
3. 将6孔板，在37℃培养箱中。每天监视，以确保有介质涂层的膜的底部的第一个星期以及加〜200微升每2天更换任何蒸发的介质。
4. 一周后，完整的DMEM/20％FBS和变介质，每隔2-3天〜2毫升的介质数量增加。
5. 一旦成纤维细胞融合的各孔中的点到2X的T75烧瓶（通道1），成纤维细胞，达到良好，胰蛋白酶消化并通过6孔板的边缘。可以转移的组织块。他们不会重视和冲ØUT在未来媒体的变化。
6. 成纤维细胞融合后，将它们传输到3X T175烧瓶（通道2），在完全DMEM介质冻结加10％DMSO中，在1×10 ⁶细胞/ ^ml，每小瓶。

4。表征的成纤维细胞，通过免疫组织化学染色

1. 8井室幻灯片培养成纤维细胞表面涂上明胶。
2. 当细胞在80％汇合时，从每个孔中吸出培养基。
3. 为10分钟，在室温下在4％的多聚甲醛固定细胞。
4. 用1X PBS清洗孔3次。
5. 通透的细胞用150微升0.3％的Triton X-100（在PBS中）在室温下5分钟。
6. 用1X PBS清洗孔3次。
7. 加入200微升的封闭溶液（PBS + 5％正常山羊血清（向量，S-1000）），在室温下进行1小时。
8. 准备一个反SERPHIN-1（反兔，人与生物圈计划，适马，S5950-200微升）封闭液1:250稀释。
9. 一spirate封闭溶液，并加入150微升的1:250稀释的AntiSERPINH-1。在室温下孵育1-2小时，或在4℃下过夜。
10. 用1X PBS清洗孔3次。
11. 准备一个1:200（的Alexa Fluor山羊抗兔IgG（H + L），Invitrogen公司，A11008）的山羊抗兔单克隆抗体在封闭液。
12. 向每孔中加入150μl的1:200的羊抗兔单克隆抗体。孵育1小时后，在黑暗中，在室温下。
13. 洗井一次1XPBS。
14. 吸出PBS，并小心地抬起室揭示只是幻灯片。
15. 安装用2-3滴的安装介质含DAPI（矢量，H-1200）的幻灯片。
16. 分析在荧光显微镜下滑动。

Representative Results

角质形成细胞生长的活检件只要48小时后，解剖。第一成纤维细胞的生长，可以观察到约1个星期后处理。一旦井已达到汇合，成纤维细胞传代两个通道达到三个150公分瓶（T150）和细胞冷冻保存。我们用此方法15-20万细胞生成。成纤维细胞是阳性的反SERPINH1（也被称为热休克蛋白47）（ 图1），这是定位于内质网的胶原特异性分子伴侣。 HSP47的皮肤成纤维细胞胶原的生物合成（黑田等人 ，2004）中起着至关重要的作用。

时间线

天	期望
第3天 - 第7天	附件和角质形成细胞的产物	第7天 - 第14天	成纤维细胞的产物，
第25天 - 第35天	应覆盖成纤维细胞的6孔板和应为成150厘米烧瓶75厘米烧瓶中，通过第二次传代到
第30天第50天	完整的DMEM培养基加上10％DMSO冻结约15-20神达细胞1Mio细胞/瓶

图1。DAPI复染的反SERPHIN1患者成纤维文化与免疫组化。

Discussion

这个协议中，可以得到相对纯培养的皮肤成纤维细胞。成纤维细胞特征的形态学特征拉长，纺锤状细胞体，圆形至椭圆形细胞核，和成纤维细胞生长汇合时，对齐和捆绑。媒体支持如角质形成细胞需要额外补充和生长因子的，或有丝分裂活性，而其他的细胞群中，这允许相对较纯的成纤维细胞培养的成纤维细胞的生长。

随后成纤维细胞传代与胰蛋白酶在1:3至1:5的比例。文化扩展到所需数量的4-8个星期内的成纤维细胞（15-20万）。

使用这种技术，我们的实验室已经来自超过70成纤维细胞系成功。我们已经测试每一行支原体污染，到生长培养基中添加抗生素，以避免其他的细菌污染。对于第i植体培养nitial，我们发现，20％FBS在媒体支持的生长，但是，在以后的通路10％FBS的就足够了。有时候，我们观察到大概是由于含有角质形成细胞的表皮的皮肤和去除切割角度从皮肤片的成纤维细胞的直接产物。

类似的技术用盖玻片按住皮片在我们手中的⁴效果较差。由于内运动的盖玻片的培养皿中，即使非常小心处理的皮片没有正确连接。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380
Table A. Table of specific reagents and equipments.
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163
Table B. Reagents.