Summary
Fibroblast explant kultur-protokol fra menneskers hud hudbiopsier er en teknisk robust og enkel måde at udlede hudceller inden for 4-8 uger for opsparing af omkring 15-20 millioner celler på et lavt antal passager.
Abstract
Væv og cellelinier afledt fra et individ med sygdommen er ideelle kilder til at studere sygdomsrelaterede cellulære fænotyper. Patient-afledte fibroblaster i denne protokol er med held blevet anvendt i afledningen af induceret pluripotente stamceller til model sygdom 1.. Tidlige passager af disse fibroblaster kan også anvendes til cellebaserede funktionelle assays til undersøgelse af specifikke sygdomstilstande veje, mekanismer 2 og efterfølgende medikamentscreeningsanalyse tilgange. Fordelen ved den præsenterede protokollen over enzymatiske procedurer er 1) reproducerbarheden af teknikken fra små mængder væv afledt fra ældre patienter, fx patienter ramt med Parkinsons sygdom, 2) den teknisk enkel metode igennem mere udfordrende metoder anvender enzymatiske behandlinger, og 3 ) tiden overvejelse: denne protokol tager 15-20 minutter og kan udføres umiddelbart efter biopsi ankomst. Enzymatiske behandlinger kan tage op til 4 timer og har problemer medoverdigestion, reduktion af cellelevedygtighed og efterfølgende vedhæftning af celler, når det ikke håndteres korrekt. Denne protokol beskriver dissektion og fremstilling af en 4 mm menneskehud biopsi til afledning af en fibroblast kultur og har en meget høj succesrate hvilket er vigtigt, når der beskæftiger sig med patient-afledte vævsprøver. I denne kultur, migrere keratinocytter ud af biopsi væv i den første uge efter fremstilling. Fibroblaster vises 7-10 dage efter den første udvækst af keratinocytter. DMEM høj glucose medier suppleret med 20% FBS favoriserer væksten af fibroblaster i keratinocytter og fibroblaster vil overvokse keratinocytter. Efter 2 passager keratinocytter er blevet udvandet ud resulterer i relativt homogene fibroblastkulturer der udtrykker fibroblast markør SERPINH1 (HSP-47). Ved hjælp af denne metode kan 15-20.000.000 fibroblaster udledes i 4-8 uger for celle banking. Huden dissektion tager omkring 15-20 min, celler overvåges derefter en gang om dagenunder mikroskopet, medier og skiftes hver 2-3 dage efter fastgørelse og udvækst af celler.
Protocol
Huden Punch biopsi opnået ved hjælp af standard procedure 3 (f.eks opnået med 4mm rund Visipunch instrument) bør holdes i fuldstændig DMEM 20% FBS medier på is. Når prøven er kommet i laboratoriet, behandle biopsi snarest muligt.
1.. Forberedelse af Skin Punch biopsi
TRIN 1,1-1,3 skal udføres INSIDE A BIOSIKKERHED CABINET
- Forberede sig på forhånd: Tilsæt 1 ml 0,1% Gelatine til hver brønd i en 6-brønds plade. Sæt pladen bort i 30-60 min. Aspirer gelatineopløsning og tilsættes 800 ul komplet DMEM/20% FBS medier til hver brønd. Sikre, at hele overfladen af brønden er dækket med medier.
- Invert låget af en steril 10 cm vævsdyrkningsskål og tilsættes 1,5 ml DMEM / 20% FBS medier til midten af låget og spredt ud medierne dråbe med spidsen af den serologiske pipette.
- Ved hjælp af en steril pincet, place tHan hudbiopsi brik i medierne på skålen.
2.. Dissektion af Skin Punch biopsi
TRIN 9 2.1-2.2 skal udføres INSIDE en horisontal laminar flow HOOD
- Anbring den nederste del af 10 cm skål omvendt låg, og overføre hudbiopsi til dissektionsmikroskop i laminar flow hætte.
- Dissekere en 4 mm runde hudbiopsi i 12-15 lige store stykker med skarpe kanter ved at skære stykker i lige store halvdele ved hjælp af en skalpel til at holde biopsi på plads, og den anden skalpel at skære med en rullende bevægelse i én retning. Stykker med ujævne kanter bidrager til dårlig vedhæftning / celleudvækst.
3.. Overførsel af Dissekeret hudbiopsi Pieces i vævsdyrkningsplader
TRIN 3,1-3,6 skal udføres INSIDE A BIOSIKKERHED CABINET
- Anbring den nederste del af 10 cm vævsdyrkningsskålpå toppen af den omvendte låg, og overførsel skålen tilbage i til biosikkerhed kabinettet.
- Med en spids pincet, place 2-3 biopsi stykker i hver brønd af den fremstillede 6-brønds plade indeholdende 800 ul og ikke på tørre brønde. Brug aflytning eller glidende bevægelse for at få brikkerne til at vedhæfte til bunden af brønden. En skalpel er nyttigt at fjerne eventuelle biopsi stykker fra tangen.
- Placer 6-brønds plade i 37 ° C inkubator. Overvåge daglige at sikre, at der er en film af medier belægning bunden af brønden i den første uge, tilsæt ~ 200 pi hver 2 dage til at erstatte eventuelle fordampede medier.
- Efter en uge, øge mængden af medier til 2 ml komplet DMEM/20% FBS og ændre medier hver 2-3 dage.
- Når fibroblaster er sammenflydende i hver brønd til det punkt, hvor fibroblasterne er ved at nå kanten af brønden, Trypsinisér og passage 6-brønds plade i 2X T75 kolber (passage 1). De vævsstykkerne kan overføres så godt. De vil ikke vedhæfte og blive vasket out under den næste medie ændringen.
- Når fibroblaster er sammenflydende, overføre dem til 3X T175 kolber (passage 2), fryse i fuldstændig DMEM medier plus 10% DMSO ved 1x10 6 celler / ml per hætteglas.
4.. Karakterisering fibroblaster gennem Immunfarvning
- Kultur fibroblaster i 8 godt kammer slide overtrukket med gelatine.
- Når cellerne er ved 80% konfluens aspireres mediet fra hver brønd.
- Lave celler i 4% paraformaldehyd i ti minutter ved stuetemperatur.
- Brøndene vaskes 3 gange med 1X PBS.
- Permeabilisere cellerne med 150 ul 0,3% Triton X-100 (i PBS) i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Brøndene vaskes 3 gange med 1X PBS.
- Tilsæt 200 pi blokerende opløsning (PBS + 5% normalt gedeserum (Vector, S-1000)) i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered en 1:250 fortynding af anti-SERPHIN-1 (Anti-kanin, mAB, Sigma, S5950-200 ul) i blokerende opløsning.
- Aspirate den blokerende opløsning, og der tilsættes 150 ul af 1:250 fortynding af AntiSERPINH-1. Inkuber ved 1-2 timer ved stuetemperatur, eller ved 4 ° C natten over.
- Brøndene vaskes 3 gange med 1X PBS.
- Forbered en 1:200 gede-anti-kanin-monoklonalt antistof (Alexa Fluor Gede-anti-kanin-IgG (H + L), Invitrogen, A11008) i blokerende opløsning.
- Tilsæt 150 ul 1:200 gede-anti-kanin-monoklonalt antistof til hver brønd. Der inkuberes i 1 time, i mørke ved stuetemperatur.
- Vask brøndene en gang med 1XPBS.
- Aspirer PBS, og løft forsigtigt kamrene ud til at afsløre bare diaset.
- Monter slide med et 2-3 dråber indeholdende DAPI (Vector, H-1200).
- Analyser dias under et fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Keratinocytter vokser ud af biopsi stykker, så snart 48 timer efter dissektion. Første fibroblaster udvækst kan ses omkring en uge efter behandlingen. Når brøndene har nået konfluens, er fibroblaster passeres til to flere passager for at nå tre 150 cm kolber (T150), og celler kryokonserveres. Vi generere med denne metode 15-20.000.000 celler. Fibroblasterne er positive for anti-SERPINH1 (også kendt som HSP-47) (figur 1), som er et kollagen-specifik molekylær chaperone lokaliseret i det endoplasmatiske reticulum. HSP47 spiller en væsentlig rolle i collagen biosyntese i hudfibroblaster (Kuroda et al, 2004).
TIME LINE
| Dag | Forventning | ||
| Dag 3 - Dag 7 | Attachment og udvækst af keratinocytter | Dag 7 - Dag 14 | Udvækst af fibroblaster |
| Dag 25 dage 35 | Fibroblaster bør dække 6-brønds plade og bør være for passeret i 75cm kolber, passage anden gang komme ind 150cm kolber | ||
| Dag 30 Dag 50 | Frys ned som 1Mio celler / hætteglas omkring 15-20 mio celler i fuldstændig DMEM medier plus 10% DMSO |
Figur 1.. Anti-SERPHIN1 immunohistokemi patient-afledt fibroblast kultur med DAPI kontrastfarvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med denne protokol, kan relativt rene kulturer af hudfibroblaster opnås. Fibroblasterne har karakteristiske morfologiske træk aflange spindel-lignende celle organer, runde til ovale cellekerner, og fibroblasterne vokser afstemt og i bundter når sammenflydende. Medierne understøtter væksten af fibroblaster, mens andre cellepopulationer f.eks keratinocytter brug for ekstra kosttilskud og vækstfaktorer, eller mitotisk mindre aktive, giver dette for relativt rene fibroblastkulturer.
Fibroblasterne efterfølgende passeres med trypsin ved et 1:03 til 1:05-forhold. Kulturen er udvidet til den ønskede mængde fibroblaster (15-20 millioner) inden for 4-8 uger.
Brug af denne teknik, har vores laboratorium afledt over 70 fibroblastlinier succes. Vi har testet hver linie for forurening med mycoplasma og tilsætte antibiotika til vækstmedier for at undgå andre bakteriel forurening. For Initial eksplantat kultur, vi fandt, at 20% FBS i medierne understøtter væksten, men i senere passager 10% FBS er tilstrækkelig. Lejlighedsvis, vi observerer en direkte udvækst af fibroblaster fra huden stykker sandsynligvis pga. skærevinklen af huden og fjernelse af overhuden, der indeholder keratinocytter.
En lignende teknik med et dækglas for at holde huden stykker var mindre effektive i vores hænder 4.. På grund af flytning af dækglasset inden dyrkningsskålens-even, når de håndteres med stor omhu-huden stykker ikke vedhæfte ordentligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Udviklingen af denne protokol blev finansieret af California Institute for regenerativ medicin (CIRM, TR1-01246) og Parkinsons Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
|||
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
|||
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
