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Medicine

Pele da biópsia Explant Cultura para Derivação de primárias fibroblastos humanos

doi: 10.3791/3779 Published: July 7, 2013

Summary

O protocolo de cultura de explantes de fibroblastos de soco biópsias da pele humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar células da pele dentro de 4-8 semanas para o banco de cerca de 15-20 milhões de células em um número baixo passagem.

Abstract

Tecidos e linhas celulares derivadas de um indivíduo com doença são fontes ideais para estudar fenótipos celulares relacionados com a doença. Fibroblastos derivados paciente neste protocolo têm sido utilizados com sucesso na derivação de células-tronco pluripotentes induzidas à doença modelo 1. Passagens precoce desses fibroblastos também pode ser usado para ensaios funcionais baseados em células a estudar vias específicas de doenças, os mecanismos 2 e subsequentes abordagens de rastreio de drogas. A vantagem do protocolo apresentado sobre procedimentos enzimáticos são: 1) a reprodutibilidade da técnica a partir de pequenas quantidades de tecido derivadas de pacientes idosos, por exemplo, os pacientes afectados com a doença de Parkinson, 2) Abordagem tecnicamente simples sobre metodologias desafiantes mais tratamentos enzimáticos, e 3 ) a consideração do tempo: este protocolo leva 15-20 minutos e pode ser realizada imediatamente após a biópsia chegada. Tratamentos enzimáticos pode demorar até 4 horas e têm os problemas deoverdigestion, a redução da viabilidade das células e subsequente fixação das células, quando não tratadas correctamente. Este protocolo descreve a dissecção e a preparação de uma pele humana, de 4 mm de biópsia para derivação de uma cultura de fibroblastos e tem uma elevada taxa de sucesso o que é importante quando se lida com amostras de tecido derivadas de doente. Nesta cultura, os queratinócitos migram para fora do tecido da biópsia dentro da primeira semana após a preparação. Fibroblastos aparecem 7-10 dias após a primeira conseqüência dos queratinócitos. DMEM elevado de glucose suplementado com FBS a 20% favorece o crescimento de fibroblastos de mais de queratinócitos e fibroblastos que crescesse os queratinócitos. Após duas passagens de queratinócitos foram diluídos para fora, resultando em culturas de fibroblastos relativamente homogéneas que expressa o marcador de fibroblastos SERPINH1 (HSP-47). Usando essa abordagem, 15-20 milhões de fibroblastos podem ser obtidas em 4-8 semanas para a banca celular. A dissecção da pele leva cerca de 15-20 min, as células são então monitorizados uma vez por diasob o microscópio, ea mídia é trocada a cada 2-3 dias após o apego e crescimento das células.

Protocol

O perfurador de biópsia de pele obtida usando o procedimento padrão 3 (por exemplo, obtidos com instrumento redondo 4mm Visipunch) deve ser mantido em DMEM completo de 20% de FBS em meio de gelo. Assim que a amostra chegou no laboratório, o processo de biópsia o mais rapidamente possível.

1. Preparação da Pele da biópsia

PASSOS 1,1-1,3 devem ser realizados DENTRO DE UM GABINETE DE BIOSSEGURANÇA

  1. Prepara-se por avanço: Adicione 1 ml de gelatina a 0,1% a cada poço de uma placa de 6 poços. Colocou o prato de lado por 30-60 min. Aspirar a solução de gelatina e adicionar 800 mL de DMEM/20% de FBS completa meios a cada poço. Assegure-se que toda a superfície do poço é coberto com meios de comunicação.
  2. Inverter a tampa de uma estéril 10 centímetros prato de cultura de tecido e adicionar 1,5 ml de DMEM / 20% de FBS meios para o meio da tampa e espalhar-se a queda de meios de comunicação com a ponta da pipeta serológica.
  3. Usando uma pinça estéril, colocar tele biópsia da pele peça na mídia sobre o prato.

2. Dissecção da pele da biópsia

PASSOS 9 2,1-2,2 devem ser realizados DENTRO DE UM HORIZONTAL fluxo laminar HOOD

  1. Coloque a parte inferior da placa de 10 cm na tampa invertida, e transferir a biópsia da pele para o microscópio de dissecação na câmara de fluxo laminar.
  2. Dissecar uma rodada de biópsia de pele de 4 mm em 12-15 pedaços uniformemente porte, com bordas afiadas, cortando pedaços em metades iguais com um bisturi para realizar a biópsia no local eo segundo bisturi para cortar com um movimento de rolamento em uma direção. Peças com bordas irregulares contribuem para a má fixação / célula conseqüência.

3. Transferência de pele dissecado Biópsia Pieces em placas de cultura de tecido

PASSOS 3,1-3,6 devem ser realizados DENTRO DE UM GABINETE DE BIOSSEGURANÇA

  1. Coloque a porção inferior do prato de 10 centímetros de tecido de culturana parte superior da tampa invertida, e um prato de transferência de volta para o armário de biossegurança.
  2. Usando uma pinça de pontas, lugar 2-3 pedaços de biópsias em cada poço da placa de 6 poços contendo 800 ul preparada e não em poços secos. Use batendo ou movimento deslizante para conseguir as peças para fixar a parte inferior do poço. Um bisturi é útil para remover os pedaços de biópsia de fórceps.
  3. Colocar a placa de 6 poços em 37 ° C incubadora. Monitorar diariamente para garantir que há um filme de revestimento de meios de comunicação o fundo do poço, para a primeira semana, adicionar ~ 200 ul a cada 2 dias para substituir quaisquer meios evaporada.
  4. Após uma semana, aumentar a quantidade de material em 2 ml de completa DMEM/20% de FBS e meios de mudança a cada 2-3 dias.
  5. Uma vez que os fibroblastos são confluentes em cada poço para o ponto em que os fibroblastos são atingindo as bordas da placa de 6 poços bem, Trypsinize e passagem em 2X frascos T75 (passagem 1). Os pedaços de tecido pode ser transferido assim. Eles não vão ligar e ser lavado out durante a próxima mudança de mídia.
  6. Uma vez que os fibroblastos são confluentes, transferi-los para 3X T175 frascos de passagem (2), congelar em completa media DMEM acrescido de 10% DMSO a 1x10 6 células / ml por frasco.

4. Caracterização dos fibroblastos através Imunocoloração

  1. Fibroblastos de cultura em 8 de slides câmara bem revestidas com gelatina.
  2. Quando as células estão a 80% de confluência, o meio aspirado a partir de cada poço.
  3. Fixar as células em 4% de paraformaldeído durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  4. Lavar os poços três vezes com 1X PBS.
  5. Permeabilizar as células com 150 uL de 0,3% de Triton X-100 (em PBS) durante 5 min à temperatura ambiente.
  6. Lavar os poços três vezes com 1X PBS.
  7. Adicionar 200 ul de solução de bloqueio (PBS + 5% de soro normal de cabra (Vector, S-1000)) durante 1 hora à temperatura ambiente.
  8. Prepara-se uma diluição de 1:250 de anti-SERPHIN-1 (anti-coelho, o MAB, Sigma, S5950-200 ul) em solução de bloqueio.
  9. Aspirate a solução de bloqueio e adicionar 150 ul da diluição de 1:250 AntiSERPINH-1. Incubar em 1-2 horas à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
  10. Lavar os poços três vezes com 1X PBS.
  11. Preparar um anticorpo monoclonal de cabra anti-coelho a 1:200 (Alexa Fluor de cabra anti-coelho IgG (H + L), Invitrogen, A11008) em solução de bloqueio.
  12. Adicionar 150 ul de 1:200 de anticorpo monoclonal de cabra anti-coelho a cada poço. Incubar durante 1 hora, no escuro, à temperatura ambiente.
  13. Lavar os poços uma vez com 1xPBS.
  14. Aspirar o PBS, e retire cuidadosamente as câmaras para revelar apenas o slide.
  15. Montar o slide com 2-3 gotas de meio de montagem contendo DAPI (Vector, H-1200).
  16. Analisar o deslizar sob um microscópio fluorescente.

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Representative Results

Queratinócitos crescendo fora das peças de biópsia, assim como 48 horas após a dissecção. Primeiro fibroblastos excrescência pode ser observada cerca de uma semana após o processamento. Uma vez que os poços de ter atingido a confluência, os fibroblastos são passadas por mais duas passagens para chegar a três frascos de 150 centímetros (T150) e as células são criopreservadas. Nós geramos com este método 15-20 milhões de células. Os fibroblastos são positivos para anti-SERPINH1 (também conhecido como a HSP-47) (Figura 1), que é um colagénio chaperona molecular específica localizada no retículo endoplasmático. Hsp47 desempenha um papel essencial na biossíntese do colagénio em fibroblastos da pele (Kuroda, et ai, 2004).

LINHA DO TEMPO

Dia Expectativa
Dia 3 - Dia 7 Apego e crescimento de queratinócitos Dia 7 - Dia 14 Conseqüência de fibroblastos
Dia 25 Dia 35 Os fibroblastos deve cobrir a placa de 6 poços e devem ser passadas para 75 centímetros para frascos, de passagem uma segunda vez em frascos 150 centímetros
Dia 30 Dia 50 Congelar para baixo como 1Mio células / frasco sobre células Mio 15-20 em completa media DMEM acrescido de 10% DMSO


Figura 1. Imunohistoquímica anti-SERPHIN1 de cultura de fibroblastos derivados de paciente com DAPI contracoloração.

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Discussion

Com este protocolo, as culturas relativamente puras de fibroblastos da pele pode ser obtido. Os fibroblastos têm características morfológicas características de corpos de células fusiformes alongadas, redondas com núcleos de células ovais, e os fibroblastos crescem alinhados e em feixes quando confluentes. Os meios de suporte do crescimento de fibroblastos ao passo que outras populações de células, por exemplo queratinócitos necessitam de suplementos adicionais e factores de crescimento, ou são mitoticamente menos activo, isso permite a cultura de fibroblastos relativamente puros.

Os fibroblastos são subsequentemente passadas com tripsina em uma proporção de 1:3 a 1:05. A cultura foi expandida para a quantidade desejada de fibroblastos (15-20 MM) dentro de 4-8 semanas.

Usando esta técnica, o nosso laboratório tem derivado mais de 70 linhas de fibroblastos com sucesso. Nós testamos cada linha de contaminação por micoplasma e adicionar antibióticos aos meios de crescimento para evitar outras contaminações bacterianas. Para o icultura de explantes nitial verificou-se que 20% de FBS em meio suporta o crescimento, no entanto, mais tarde, 10% de FBS passagens é suficiente. Ocasionalmente, observa-se um crescimento de fibroblastos directa a partir dos pedaços de pele, presumivelmente, devido ao ângulo de corte da pele e a remoção da epiderme, que contém os queratinócitos.

Uma técnica similar, usando uma lamela para segurar os pedaços de pele foi menos eficaz em nossas mãos 4. Devido ao movimento da lamela dentro da cultura prato, mesmo quando tratado com muito cuidado, os pedaços de pele não atribuiu corretamente.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O desenvolvimento deste protocolo foi financiado pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM, TR1-01246) e Parkinson Alliance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Leica S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish VWR 25382-166
6-well Tissue Culture plate VWR 73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex VWR 21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes VWR 21008-940
2 mL Serological Pipettes VWR 89130-894
5 mL Serological Pipettes VWR 89130-896
10 mL Serological Pipettes VWR 89130-898
Pasteur Pipettes VWR 14672-380

Table A. Table of specific reagents and equipments.

1X DMEM: High Glucose Invitrogen/Gibco 11960-069
20% Fetal Bovine Serum Invitrogen/Gibco 26140-079
1X L-Glutamine Invitrogen/Gibco 25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids Invitrogen/Gibco 11140-076
1X Penicillin/Streptomycin Invitrogen/Gibco 15140-163

Table B. Reagents.

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References

  1. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
  2. Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
  3. Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
  4. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
  5. Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. 241-246 (2004).
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Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).More

Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).

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