Summary
El explante protocolo de cultivo de fibroblastos humanos de biopsias punch de piel es una manera técnicamente robusta y sencilla de obtener células de la piel dentro de 4-8 semanas para la banca de unos 15-20 millones de células en un número bajo pasaje.
Abstract
Los tejidos y líneas celulares derivadas de un individuo con la enfermedad son fuentes ideales para estudiar los fenotipos celulares relacionados con la enfermedad. Fibroblastos derivados de los pacientes en este protocolo se han utilizado con éxito en la obtención de células madre pluripotentes inducidas a la enfermedad modelo 1. Los primeros pasajes de estos fibroblastos también se pueden utilizar para los ensayos funcionales basados en células para estudiar las vías específicas de la enfermedad, los mecanismos y 2 posteriores enfoques de detección de drogas. La ventaja de la presentada protocolo a través de procedimientos enzimáticos son 1) la reproducibilidad de la técnica a partir de pequeñas cantidades de tejido derivados de pacientes de más edad, por ejemplo, pacientes afectados con la enfermedad de Parkinson, 2) el enfoque técnicamente simple a través de metodologías más desafiantes utilizando tratamientos enzimáticos, y 3 ) la consideración de tiempo: este protocolo toma 15-20 minutos y se puede realizar inmediatamente después de la biopsia de llegada. Tratamientos enzimáticos pueden tardar hasta 4 horas y tienen los problemas deoverdigestion, la reducción de la viabilidad celular y la posterior unión de las células cuando no se manejan adecuadamente. Este protocolo describe la disección y preparación de una piel humana biopsia de 4 mm para la derivación de un cultivo de fibroblastos y tiene una muy alta tasa de éxito que es importante cuando se trata de muestras de tejidos derivados del paciente. En esta cultura, los queratinocitos migran fuera del tejido de la biopsia en la primera semana después de su preparación. Los fibroblastos aparecen 7-10 días después de la primera derivación de los queratinocitos. Medio DMEM rico en glucosa suplementado con 20% de FBS favorece el crecimiento de los fibroblastos sobre los queratinocitos y los fibroblastos se cubran los queratinocitos. Después de 2 pasajes queratinocitos se han diluido a lo que resulta en cultivos de fibroblastos relativamente homogéneos que expresa el marcador de fibroblastos SERPINH1 (HSP-47). Con este enfoque, 15-20000000 fibroblastos pueden derivar en 4-8 semanas para la banca móvil. La disección de la piel dura aproximadamente 15-20 minutos, las células se siguen de cerca una vez al díabajo el microscopio, y los medios de comunicación se cambió cada 2-3 días después de la unión y el crecimiento externo de las células.
Protocol
La biopsia de piel punzón obtuvo utilizando el procedimiento estándar de 3 (por ejemplo, obtenidas con 4 mm ronda instrumento Visipunch) debe mantenerse en DMEM completo 20% FBS en hielo. Una vez que la muestra ha llegado en el laboratorio, el proceso de la biopsia tan pronto como sea posible.
1. Preparación de la piel de biopsia en sacabocados
PASOS 01.01 a 01.03 se van a realizar DENTRO DE UN CENTRO DE GABINETE
- Preparar de antemano: Añadir 1 ml de gelatina al 0,1% a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Ajuste el plato a un lado durante 30-60 min. Aspirar la solución de gelatina y añadir 800 l de completa DMEM/20% FBS a cada pocillo. Asegúrese de que toda la superficie del pozo está cubierto con los medios de comunicación.
- Invertir la tapa de una placa de 10 cm de cultivo de tejido estéril y añadir 1,5 ml de DMEM / FBS 20% para el centro de la tapa y hacia fuera de la caída de los medios de comunicación con la punta de la pipeta serológica.
- Usando unas pinzas esterilizadas, lugar tél biopsia de piel pieza en los medios de comunicación en el plato.
2. La disección de la piel biopsia en sacabocados
PASOS 9 2.1 a 2.2 se han de realizar dentro de una campana de flujo laminar HORIZONTAL
- Coloque la parte inferior de la placa de 10 cm en la tapa invertida, y la transferencia de la biopsia de la piel para el microscopio de disección en la campana de flujo laminar.
- Diseccionar una biopsia de piel redondo de 4 mm en 12-15 piezas de tamaño uniforme con bordes afilados por el corte de piezas en mitades iguales usando un bisturí para sostener la biopsia en el lugar y el segundo bisturí para cortar con un movimiento de balanceo en una dirección. Piezas con bordes irregulares contribuyen a la mala unión / célula consecuencia.
3. Transferencia de la piel disecado Biopsia Piezas en placas de cultivo de tejidos
PASOS 3.1 a 3.6 se han de realizar DENTRO DE UN CENTRO DE GABINETE
- Coloque la parte inferior de la placa de cultivo de 10 cm de tejidoen la parte superior de la tapa invertida, y el plato de transferencia de nuevo en a la cabina de bioseguridad.
- Usando unas pinzas puntiagudas, lugar de 2-3 piezas de biopsia en cada pocillo de la placa de 6 pocillos preparado que contiene 800 l, y no en los pozos secos. Utilice golpeando o deslizando el movimiento para conseguir las piezas para fijar al fondo del pozo. Un bisturí es útil para eliminar cualquier piezas de biopsia de los fórceps.
- Coloque la placa de 6 pocillos en el 37 ° C incubadora. Controle diariamente para asegurarse de que no es una película de recubrimiento medios del fondo del pozo para la primera semana, añadir ~ 200 l cada 2 días para cambio del soporte se evaporó.
- Después de una semana, aumentar la concentración de los medios de comunicación a 2 ml de FBS completa DMEM/20% y el cambio de medio cada 2-3 días.
- Una vez que los fibroblastos son confluentes en cada pocillo para el punto en el que los fibroblastos están llegando a los bordes de la placa de 6 pocillos así, Trypsinize y el paso en 2X T75 frascos (paso 1). Los trozos de tejido se pueden transferir también. No van a poner y se lavan out durante el siguiente cambio de los medios de comunicación.
- Una vez que los fibroblastos son confluentes, transferirlos a 3X frascos T175 (paso 2), congelación completa en medio DMEM más 10% DMSO a 1x10 6 células / ml por vial.
4. Caracterización de los fibroblastos a través Inmunotinción
- Fibroblastos Cultura en 8 así diapositiva cámara recubiertos con gelatina.
- Cuando las células son a 80% de confluencia, se aspira el medio de cada pocillo.
- Fijar las células en paraformaldehído al 4% durante diez minutos a temperatura ambiente.
- Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1X.
- Permeabilizar las células con 150 l de 0,3% de Triton X-100 (en PBS) durante 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1X.
- Añadir 200 l de solución de bloqueo (PBS + 5% de suero normal de cabra (Vector, S-1000)) durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Preparar una dilución 1:250 de anti-Serphin-1 (anti-conejo, MAB, Sigma, S5950-200 l) en solución de bloqueo.
- LaSpirate la solución de bloqueo y añadir 150 l de la dilución 1:250 de AntiSERPINH-1. Incubar a 1-2 horas a temperatura ambiente, o a 4 º C durante la noche.
- Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1X.
- Preparar un anticuerpo monoclonal de cabra anti-conejo 1:200 (Alexa Fluor de cabra anti-conejo IgG (H + L), Invitrogen, A11008) en solución de bloqueo.
- Añadir 150 l de 1:200 de anticuerpo monoclonal de cabra anti-conejo a cada pocillo. Incubar durante 1 h, en la oscuridad, a temperatura ambiente.
- Lave los pocillos una vez con 1xPBS.
- Aspirar el PBS, y levantar con cuidado las cámaras para revelar sólo la diapositiva.
- Montar la válvula con un 2-3 gotas de medio de montaje que contiene DAPI (Vector, H-1200).
- Analizar la diapositiva bajo un microscopio de fluorescencia.
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Representative Results
Los queratinocitos que crecen fuera de las piezas de biopsia tan pronto como 48 horas después de la disección. Primero fibroblastos consecuencia se puede observar alrededor de una semana después de su transformación. Una vez que los pozos han alcanzado la confluencia, los fibroblastos se pasan por dos pasos más para llegar a tres frascos 150 cm (T150) y las células son criopreservados. Generamos con este método desde 15 hasta 20 millones células. Los fibroblastos son positivos para anti-SERPINH1 (también conocido como HSP-47) (Figura 1), que es un colágeno específico de chaperona molecular localizada en el retículo endoplásmico. HSP47 desempeña un papel esencial en la biosíntesis de colágeno en fibroblastos de la piel (Kuroda, et al, 2004).
LÍNEA DE TIEMPO
| Día | Expectativa | ||
| Día 3 - Día 7 | El apego y la extensión de los queratinocitos | Día 7 - Día 14 | Consecuencia de fibroblastos |
| Día 25 Día 35 | Los fibroblastos deben cubrir la placa de 6 pocillos y deben ser para pases en frascos de 75 cm, el paso por segunda vez en matraces de 150 cm | ||
| Día 30 Día 50 | Congele hasta que 1Mio células / vial sobre las células Mio 15-20 en medio DMEM completo más un 10% de DMSO |
Figura 1. Inmunohistoquímica anti-SERPHIN1 de cultivo de fibroblastos derivados del paciente con DAPI counterstaining.
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Discussion
Con este protocolo, se pueden obtener las culturas relativamente puras de fibroblastos de la piel. Los fibroblastos tienen rasgos morfológicos característicos de cuerpos de células fusiformes alargadas, redondas para núcleos de las células ovales, y los fibroblastos crecen alineados y en haces cuando confluente. Los medios de comunicación favorece el crecimiento de los fibroblastos, mientras que otras poblaciones celulares por ejemplo, queratinocitos necesitan complementos adicionales y factores de crecimiento, o mitosis son menos activos, esto permite cultivos de fibroblastos relativamente puros.
Los fibroblastos son posteriormente se pasaron con tripsina a una relación de 1:3 a 1:05. El cultivo se expandió a la cantidad deseada de fibroblastos (15-20 millones) dentro de 4-8 semanas.
Usando esta técnica, nuestro laboratorio ha derivado más de 70 líneas de fibroblastos con éxito. Hemos probado todas las líneas de contaminación por micoplasma y agregar antibióticos al medio de crecimiento para evitar otro tipo de contaminación bacteriana. Para la icultivo de explantes nitial se encontró que 20% de FBS en los medios de comunicación soporta el crecimiento, sin embargo, más tarde en pasos de 10% de FBS es suficiente. De vez en cuando, se observa una consecuencia directa de los fibroblastos de las piezas de piel presumiblemente debido a el ángulo de corte de la piel y la eliminación de la epidermis que contiene queratinocitos.
Una técnica similar utilizando un cubreobjetos para sujetar las piezas de piel fue menos eficaz en nuestras manos 4. Debido al movimiento del cubreobjetos dentro de la cultura plato-incluso cuando se maneja con gran cuidado-las piezas de piel no se adhieren adecuadamente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El desarrollo de este protocolo fue financiado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM, TR1-01246) y de Parkinson Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
|||
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
|||
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
