Skin stansbiopsi Explantationsersättning Kultur för Derivering av primära humana fibroblaster

Summary

Den fibroblaster Explantation kultur protokollet från humana biopsier huden punch är en tekniskt robust och enkelt sätt att härleda hudceller inom 4-8 veckor för bank på ca 15-20 miljoner celler på en låg passage nummer.

Abstract

Vävnader och cellinjer som härrör från en individ med sjukdomen är perfekta källor för att studera sjukdomsrelaterade cellulära fenotyper. Patient-härledda fibroblaster i detta protokoll har framgångsrikt använts vid härledningen av inducerade pluripotenta stamceller till modellen sjukdom ^1. Tidiga passager av dessa fibroblaster kan också användas för cellbaserade funktionella analyser för att studera specifika sjukdomsmekanismer, mekanismer ² och efterföljande terapier strategier screening. Fördelen med den presenterade protokoll över enzymatiska förfaranden 1) reproducerbarhet av tekniken från små mängder av vävnad som härrör från äldre patienter, t.ex. patienter som drabbats med Parkinsons sjukdom, 2) den tekniskt enkel metod över mer utmanande metoder använder enzymatiska behandlingar, och 3 ) den tid beaktas: detta protokoll tar 15-20 minuter och kan utföras omedelbart efter biopsi ankomst. Enzymatiska behandlingar kan ta upp till fyra timmar och har problemen medoverdigestion, minskning av cellernas livskraft och efterföljande fastsättning av celler när de inte hanteras på rätt sätt. Detta protokoll beskriver dissekering och beredningen av ett 4-mm human hudbiopsi för härledning av en fibroblast kultur och har en mycket stor framgång, som är viktigt när det handlar om patienter-härledde vävnadsprover. I denna kultur, keratinocyter migrerar ut från biopsivävnad inom den första veckan efter beredning. Fibroblaster visas 7-10 dagar efter första utväxt av keratinocyter. DMEM höga glukos-medium kompletterat med 20% FBS gynnar tillväxten av fibroblaster över keratinocyter och fibroblaster kommer växa över de keratinocyter. Efter 2 passager keratinocyter har spätts ut vilket resulterar i relativt homogena fibroblastkulturer som uttrycker SERPINH1 fibroblast markör (HSP-47). Med denna metod kan ca 15-20 miljoner fibroblaster härledas i 4-8 veckor för cell banking. Huden dissektion tar ca 15-20 min, celler övervakas därefter en gång om dagenunder mikroskop, och media byts var 2-3 dagar efter fastsättning och utväxt av celler.

Protocol

Huden stansbiopsi erhålls genom standardiserade procedur ³ (t.ex. erhållas med 4mm rund Visipunch instrument) bör hållas i fullständigt DMEM 20% FBS media på is. När provets anlänt i laboratoriet, bearbeta biopsi så snart som möjligt.

Ett. Beredning av Skin stansbiopsi

STEG 1,1-1,3 SKA utföras inne i en biosäkerhet skåp

1. Förbered i förväg: Lägg 1 ml av 0,1% gelatin till varje brunn i en 6-brunnar. Ställ plåten åt sidan för 30-60 min. Aspirera gelatinlösning och tillsätt 800 pl komplett DMEM/20% FBS media till varje brunn. Se till att hela ytan av brunnen är täckt med media.
2. Invertera locket av en steril 10 cm vävnadsodlingsskål och tillsätt 1,5 ml DMEM / 20% FBS media till mitten av locket och sprida ut media droppe med spetsen på serologisk pipett.
3. Använd en steril pincett, plats than hudbiopsi bit i media på skålen.

2. Dissektion av Skin stansbiopsi

STEG 9 2,1-2,2 ska utföras inuti en horisontell laminärflödeshuv

1. Placera den nedre delen av 10 cm skålen på inverterat lock och överföra hudbiopsi till dissektionsmikroskop i dragskåp med laminärt flöde.
2. Dissekera en 4-mm biopsi rund hud i 12-15 lika stora bitar med vassa kanter genom att skära bitar i lika halvor med hjälp av en skalpell för att hålla biopsi på plats och den andra skalpell för att skära med en rullande rörelse i en riktning. Pieces med trasiga kanter bidrar till dålig fastsättning / cell utväxt.

Tre. Överföring av dissekerade hudbiopsi Pieces in vävnadskulturplattor

Steg är 3,1-3,6 SKA utföras inne i en biosäkerhet skåp

1. Placera den nedre delen av 10 cm vävnadsodlingsskålpå toppen av den inverterade locket, och överföra skålen tillbaka in till biosäkerhet skåpet.
2. Med ett spetsigt pincett, placera 2-3 biopsi bitar i varje brunn av det beredda 6-brunnar innehåller 800 ul och inte på torra brunnar. Använd knacka eller glidande rörelse för att få bitarna att fästa till botten av brunnen. En skalpell är användbar för att ta bort eventuella biopsi bitar från tången.
3. Placera 6-brunnar i 37 ° C inkubator. Övervaka dagligen för att se till att det finns en film av media beläggning i botten av brunnen för den första veckan, lägga ~ 200 l varje 2 dagar att ersätta avdunstat media.
4. Efter en vecka, öka mängden av media till 2 ml fullständigt DMEM/20% FBS och media byts ut var 2-3 dagar.
5. När fibroblaster är sammanflytande i varje brunn till den punkt där fibroblaster nå kanterna av brunnen, trypsinize och passagen 6-brunnar i 2X T75 kolvar (passage 1). Vävnaden bitar kan överföras också. De kommer inte bifoga och tvättas oUT under nästa media förändring.
6. När fibroblaster är sammanflytande, överföra dem till 3X T175 kolvar (passage 2), frysa i fullständig DMEM media plus 10% DMSO vid 1x10 ⁶ celler / ml per flaska.

4. Karakterisering fibroblaster genom Immunfärgning

1. Kultur fibroblaster i 8 väl kammare bild belagd med gelatin.
2. När cellerna är vid 80% konfluens, aspirera mediet från varje brunn.
3. Fix celler i 4% paraformaldehyd under tio minuter vid rumstemperatur.
4. Tvätta brunnarna tre gånger med 1X PBS.
5. Permeabilisera cellerna med 150 | il 0,3% Triton X-100 (i PBS) under 5 minuter vid rumstemperatur.
6. Tvätta brunnarna tre gånger med 1X PBS.
7. Lägg 200 pl blockeringslösning (PBS + 5% normalt getserum (Vector, S-1000)) under 1 timme vid rumstemperatur.
8. Bered en 1:250 utspädning av anti-SERPHIN-1 (anti-kanin, MAB, Sigma, S5950-200 ^) i blockerande lösningen.
9. ETTspirate den blockerande lösningen och tillsätt 150 pl av 1:250 utspädning av AntiSERPINH-1. Inkubera vid 1-2 h vid rumstemperatur, eller vid 4 ° C över natten.
10. Tvätta brunnarna tre gånger med 1X PBS.
11. Bered en 1:200 get-anti-kanin-monoklonal antikropp (Alexa Fluor get anti-kanin IgG (H + L), Invitrogen, A11008) i blockeringslösning.
12. Tillsätt 150 | il 1:200 get-anti-kanin-monoklonal antikropp till varje brunn. Inkubera under en timme, i mörker, vid rumstemperatur.
13. Tvätta brunnarna en gång med 1xPBS.
14. Aspirera PBS, och lyft försiktigt kamrarna för att avslöja bara bilden.
15. Montera Slide med 2-3 droppar monteringsmedium innehåller DAPI (Vector, H-1200).
16. Analysera glider under ett fluorescerande mikroskop.

Representative Results

Keratinocyter växer ur biopsi bitar så snart som 48 timmar efter dissektion. Första fibroblaster utväxt kan observeras om en vecka efter bearbetning. När brunnarna har nått sammanflytande, är fibroblaster passerats för två ytterligare passager för att nå tre 150 cm kolvar (T150) och celler kryobevarades. Vi skapar med denna metod ca 15-20 miljoner celler. Fibroblasterna är positiva för anti-SERPINH1 (även känd som HSP-47) (Figur 1), som är en kollagen-specifik molekylär chaperon lokaliserad i det endoplasmatiska retiklet. HSP47 spelar en viktig roll i kollagenbiosyntes i huden fibroblaster (Kuroda et al, 2004).

TID LINE

Dag	Expectation
Dag 3 - Dag 7	Fastsättning och utväxt av keratinocyter	Dag 7 - Dag 14	Utväxt av fibroblaster
Dag 25-dag 35	Fibroblaster bör omfatta 6-brunnar och bör vara för passage in 75cm kolvar, passage en andra gång till 150cm kolvar
Dag 30-Day 50	Frysa ner som 1Mio celler / flaska ca 15-20 miljoner celler i fullständig DMEM media plus 10% DMSO

Figur 1. Anti-SERPHIN1 immunohistokemi av tålmodig-derived fibroblaster kultur med DAPI motfärgning.

Discussion

Med detta protokoll kan relativt rena kulturer av hudfibroblaster erhållas. Fibroblasterna har karakteristiska morfologiska drag av långsträckta, spindel-liknande cell organ, runda till ovala cellkärnor, och fibroblaster växer i linje och i buntar när sammanflytande. Medierna stöder tillväxten av fibroblaster medan andra cellpopulationer ex keratinocyter behöver ytterligare tillskott och tillväxtfaktorer, eller är mitotiskt mindre aktiva, gör detta för relativt rena fibroblastkulturer.

Fibroblasterna därefter passeras med trypsin vid en 1:03 till 1:05 ratio. Kulturen expanderas till den önskade mängden av fibroblaster (15-20 miljoner) inom 4-8 veckor.

Med hjälp av denna teknik, har vårt laboratorium härstammar över 70 fibroblastlinjer framgångsrikt. Vi har testat varje rad för kontaminering från mykoplasma och tillsätta antibiotika till tillväxt media för att undvika andra bakteriell kontamination. För den i:nitial Explantation kultur fann vi att 20% FBS i media stöder tillväxten, men i senare passager 10% FBS är tillräcklig. Ibland, observerar vi en direkt utväxt av fibroblaster från huden bitar förmodligen på grund av den skärande vinkel av hud och avlägsnande av epidermis som innehåller keratinocyter.

En liknande teknik med ett täckglas för att hålla ner huden bitarna var mindre effektiva i våra händer ^4. På grund av förflyttning av täckglas inom odlingsskålen-även när hanteras med stor försiktighet-huden bitarna inte fäster ordentligt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380
Table A. Table of specific reagents and equipments.
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163
Table B. Reagents.