Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

doi: 10.3791/3779 Published: July 7, 2013

Summary

Insan derisi punch biyopsi gelen fibroblast eksplant kültür protokolü düşük bir geçit numaradan milyon 15-20 hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde cilt hücrelerini elde etmek teknik olarak sağlam ve basit bir yoludur.

Abstract

Hastalığı olan bir bireyden elde edilen dokular ve hücre çizgileri, hastalıkla ilişkili hücre fenotipleri çalışma yapmak için ideal kaynaklarıdır. Bu protokolde Hasta elde edilen fibroblast başarılı modeli hastalığı 1 ile uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetme kullanılmaktadır. Bu fibroblastlar erken geçişleri de belirli bir hastalık yolları mekanizmaları 2 ve daha sonraki ilaç tarama yaklaşımı incelemek için hücre bazlı fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Enzimatik prosedürler üzerinde Sunulan protokol avantajı 1) enzimatik tedaviler kullanarak yaşlı hastalar, Parkinson hastalığı, 2 ile etkilenen hastalarda) daha zor metodolojileri fazla teknik olarak basit bir yaklaşım türetilen doku küçük miktarlarda tekniğinin yeniden üretimde kıtlık ve 3 vardır ) zaman göz: Bu protokol 15-20 dakika sürer ve biyopsi geldikten sonra hemen yapılabilir. Enzimatik tedaviler 4 saat kadar sürebilir ve sorunları olabilirhücre canlılığı ve doğru kullanılmadığında hücrelerin sonraki ekin Overdigestion, azaltılması. Bu protokol, 4 mm insan derisi bir fibroblast kültür türetme için biyopsi diseksiyon ve hazırlık açıklar ve hasta kaynaklı doku örnekleri ile uğraşırken önemli olan çok yüksek başarı oranına sahiptir. Bu kültürde, keratinositler hazırlandıktan sonra ilk hafta içinde biyopsi doku dışına göç. Fibroblast keratinositlerin ilk akıbet sonra 7-10 gün görünür. % 20 FBS ile takviye DMEM yüksek glukoz medya keratinositlerin ve fibroblastların üzerinde fibroblast büyüme keratinositleri büyümek olacak yanadır. 2 pasajlar sonra keratinositler fibroblast işaretleyici SERPINH1 (HSP-47) ifade nispeten homojen fibroblast kültürlerinde neden dışarı seyreltilmiş edilmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, da 15-20 milyon fibroblast hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde elde edilebilir. Cilt diseksiyonu 15-20 dakika sürer, hücreler daha sonra günde bir kez izlenirmikroskop altında, ve medya 2-3 günde bağlanma ve hücre akıbet sonra değiştirilir.

Protocol

Punch biyopsi, Standart Prosedür 3'e (örneğin 4 mm yuvarlak Visipunch cihazı ile elde edilmiş) kullanılarak elde edilen cilt buz üzerinde tam DMEM% 20 FBS ortamı içinde tutulmalıdır. Bir kez örnek laboratuarda geldi, en kısa zamanda biyopsi işlemek.

1. Cilt Punch Biyopsi hazırlanması

ADIMLAR 1,1-1,3 A BİYOGÜVENLİK CABINET İÇ YAPILACAK OLAN

  1. Önceden hazırlayın: 6-kuyulu plakanın her kuyuya% 0.1 jelatin 1 ml ilave edilir. 30-60 dakika için bir kenara plaka ayarlayın. Jelatin çözüm aspire ve her bir kuyunun tam DMEM/20% FBS medya 800 ul ekleyin. Kuyunun tüm yüzey medya ile kaplı olduğundan emin olun.
  2. Steril bir 10 cm doku kültürü çanak kapağı ters çevirin ve kapağı ortasına 1.5 DMEM ml / 20% FBS medya ekleyebilir ve serolojik pipet ucu ile medya damla yaymak.
  3. Steril bir forseps kullanarak, yer to cilt çanak medyada parça biyopsi.

2. Cilt Punch Biyopsi diseksiyonu

9 2.1-2.2 ADIMLAR bir YATAY LAMİNER AKIŞ HOOD İÇ YAPILACAK OLAN

  1. Ters kapak 10 cm çanak alt kısmını yerleştirin ve cilt laminer akış kaputu mikroskop için biyopsi aktarın.
  2. Yerinde biyopsi tutmak için bir neşter kullanılarak ve bir yönde bir dönme hareketi ile kesmek için ikinci neşter eşit devrede de gol parçaları keserek keskin kenarlı 12-15 eşit büyüklükte parçalar halinde bir 4-mm yuvarlak deri biyopsisi parçalara ayır. Düzensiz kenarlı Adet kötü eki / hücre akıbet katkıda bulunur.

3. Dissected Cilt Devri Doku Kültürü Tabaklar içine adet biyopsi

ADIMLAR 3.1-3.6 Bir BİYOGÜVENLİK CABINET İÇ YAPILACAK OLAN

  1. 10 cm doku kültürü çanak alt kısmını yerleştirinters kapak, ve transfer yemeğin üstüne geri biyogüvenlik kabini içine.
  2. Kuru kuyu 800 ul ve içermesin hazırlanan 6-plaka her kuyuya bir sivri forseps, yer 2-3 biyopsi parçaları kullanılarak. Adet kuyunun dibinde eklemek için almak için hareket dokunarak veya sürgülü kullanın. Bir neşter forseps herhangi bir biyopsi parçaları kaldırmak için yararlıdır.
  3. 37 ° C inkübatör 6 plaka yerleştirin. Herhangi bir buharlaşan medya yerine 2 günde ~ 200 ul ekleyin; medya kaplama ilk hafta için kuyunun dibinde bir filmi olmadığından emin olmak için her gün izleyin.
  4. Bir hafta sonra, tam DMEM/20% FBS ve değişim ortamı, her 2-3 günde 2 ml ortam miktarı artar.
  5. Bir kez fibroblast fibroblast 2X T75 şişeler (geçit 1) içine de, Trypsinize ve geçiş 6-plaka kenarları ulaşıyor noktasına her kuyuda konfluent. Doku parçaları da aktarılabilir. Onlar o yapıştırmayın ve yıkanabilirBir sonraki medya değişikliği sırasında ut.
  6. Bir kez fibroblast konfluent, 3X T175 şişeler (geçit 2), tam DMEM medyada dondurma artı 1x10 6 hücre / flakon başına ml% 10 DMSO aktarabilirsiniz.

4. Immün ile karakterizasyonu Fibroblastlar

  1. 8 iyi odasında slayt Kültür fibroblastlar jelatin kaplı.
  2. Hücreleri confluency% 80 altındadır, her kuyudan orta aspire.
  3. , Oda sıcaklığında on dakika süreyle% 4 paraformaldehid hücreleri saptamak.
  4. 1X PBS ile kuyu 3 kere yıkayın.
  5. % 0,3 olan 150 ul hücre geçirgenliği Triton oda sıcaklığında 5 dakika boyunca X-100 (PBS içinde).
  6. 1X PBS ile kuyu 3 kere yıkayın.
  7. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 ul blokaj çözeltisi (PBS +% 5 normal keçi serumu (Vector, S-1000)) ilave edilir.
  8. Çözümü engelleme anti-SERPHIN-1 (anti-tavşan, mAB Sigma, S5950-200 ul) bir 1:250 seyreltme hazırlayın.
  9. BirBloke etme çözeltisi spirate ve AntiSERPINH-1 1:250 seyreltmesinin 150 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edilir, ya da 4 ° C'da gece boyunca.
  10. 1X PBS ile kuyu 3 kere yıkayın.
  11. Çözelti bir şekilde bloke eden 1:200 keçi-anti-tavşan monoklonal antikoru (Alexa Fluor keçi anti-tavşan IgG (H + L), Invitrogen, A11008) hazırlayın.
  12. Her kuyuya 1:200 keçi-anti-tavşan monoklonal antikor 150 ul ekle. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 1 saat süreyle inkübe edin.
  13. 1xPBS ile bir kez kuyu yıkayın.
  14. PBS aspire ve dikkatle sadece slayt ortaya çıkarmak için odaları kaldırın.
  15. DAPI (Vektör, H-1200) içeren montaj orta bir 2-3 damla ile slayt monte edin.
  16. Bir floresan mikroskop altında slayt analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Keratinositler diseksiyonu sonra 48 saat gibi kısa sürede biyopsi parçaları dışında büyüyen. İlk fibroblast akıbet yaklaşık bir hafta işleme sonra görülebilir. Kuyu konfluense ulaştığında, fibroblastlar üç 150 cm şişeleri (T150) ulaşmak için iki veya daha fazla geçit olarak tatbik edilir ve hücreler dondurulup saklanır. Bu yöntem 15-20.000.000 hücreleri ile üretir. Fibroblastlar, endoplazmik retikulum lokalize bir kollajen spesifik moleküler şaperon anti-SERPINH1 (ayrıca HSP-47 olarak da bilinir) (Şekil 1), için olumludur. HSP47 deri fibroblast kolajen sentezi (Kuroda, ve arkadaşları, 2004) önemli bir rol oynar.

SÜREÇ

Gün Beklenti
3. Gün - Günlük 7 Keratinositlerin eki ve akıbet Gün 7 - Gün 14 Fibroblast akıbet
Gün 25 Gün 35 Fibroblastlar 6-plaka kapsamalı ve 150cm şişeler içine 75cm şişeler, geçiş ikinci kez içine geçişli için olmalıdır
Gün 30 Gün 50 Tam DMEM medya artı% 10 DMSO içinde 15-20 Mio hücreleri hakkında 1Mio hücre / şişe olarak aşağı Freeze


Şekil 1. DAPI counterstaining hasta kaynaklı fibroblast kültür Anti-SERPHIN1 immünhistokimya.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol ile, deri fibroblast nispeten saf kültürleri elde edilebilir. Fibroblastlar oval hücre çekirdekleri yuvarlak uzun, iğ gibi hücre gövdeleri, karakteristik morfolojik özelliklere sahip, ve ne zaman birleşik fibroblast uyumlu ve demetleri büyür. Medya fibroblast büyüme örneğin keratinositler ilaveler ve büyüme faktörleri gerekir, ya da mitotik daha az aktif olan diğer hücre popülasyonlarının ise, bu nispeten saf fibroblast kültürleri sağlar destekler.

Fibroblastlar daha sonra 01:05 oranı, 1:3 tripsin ile tatbik edilir. Kültür 4-8 hafta içinde fibroblast istenilen miktarda (15-20 Milyon) genişletilir.

Bu tekniği kullanarak, bizim laboratuvar başarılı 70 fibroblast hatları üzerinden elde etti. Biz mycoplasma kirlenme her satır test edilmiş ve diğer bakteriyel kontaminasyonu önlemek için büyüme ortamı için antibiyotik ekleyin var. Initial eksplant kültürünü, medya içinde% 20 FBS daha sonra% 10 FBS zarfı içinde, ancak, büyüme desteklediği bulundu yeterlidir. Zaman zaman deri ve keratinositler içeren epidermis kaldırma kesme açısına muhtemelen nedeniyle deri parçalarından fibroblast doğrudan bir sonucudur görüyoruz.

Deri parçalarını tutmak için bir lamel kullanan benzer bir yöntem elimizde 4 daha az etkili olmuştur. Içinde lamel hareketi nedeniyle kültür çanak-bile ele çok dikkatli-deri parçaları düzgün takılmamış.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu protokolün geliştirilmesi Rejeneratif Tıp California Institute (CIRM, TR1-01246) ve Parkinson Alliance tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Leica S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish VWR 25382-166
6-well Tissue Culture plate VWR 73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex VWR 21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes VWR 21008-940
2 mL Serological Pipettes VWR 89130-894
5 mL Serological Pipettes VWR 89130-896
10 mL Serological Pipettes VWR 89130-898
Pasteur Pipettes VWR 14672-380

Table A. Table of specific reagents and equipments.

1X DMEM: High Glucose Invitrogen/Gibco 11960-069
20% Fetal Bovine Serum Invitrogen/Gibco 26140-079
1X L-Glutamine Invitrogen/Gibco 25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids Invitrogen/Gibco 11140-076
1X Penicillin/Streptomycin Invitrogen/Gibco 15140-163

Table B. Reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
  2. Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
  3. Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
  4. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
  5. Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. 241-246 (2004).
İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).More

Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter