Summary
透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明している
Abstract
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の胚がますます宿主-病原体相互作用の1の脊椎動物の自然免疫系の機能を研究するためのモデルとして使用されています。自然免疫系の主要な細胞型、マクロファージおよび好中球は、免疫応答に必要とされるリンパ球の成熟の前に胚発生の最初の日の間に開発しています。胚の大量入手のしやすさ、外部の開発のために、アクセシビリティ、胚および幼虫の光透過性、遺伝的なツール、トランスジェニックレポーターラインの大規模な変異体リソースやコレクションの広い範囲は、すべてのゼブラフィッシュの汎用性を追加モデル。 サルモネラ血清型Typhimuriumの（ネズミチフス菌）と結核marinumは、マクロファージに細胞内に存在することができ、頻繁にゼブラフィッシュ胚における宿主-病原体相互作用を研究するために使用されます。これら二つの感染過程細菌の病原体は、比較することは興味深いものですので、S.ネズミチフス菌感染症は、M.、一方、1日以内の急性および致命的であるmarinum感染症は慢性的であり、幼虫2、3までイメージングすることができます。胚（ 図1）に細菌の微小注射部位の感染が急速に全身になるか、最初にローカライズされたままかどうかを決定します。急速な全身感染症が直接後部血島で、またはキュビエ、トランク血管系に心を接続する卵黄嚢の広い流通チャネルのダクトを介して尾静脈を介して血液循環にマイクロ注入細菌によって確立することができます。 1 DPFで、この段階で胚がphagocyticallyアクティブマクロファージを持っていますが、好中球はまだ血島に注入し、成熟していない場合が好ましい。 2月3日DPFにおける注射のために、胚は、機能（ミエロペルオキシダーゼ産）好中球を開発しているときは、キュビエのダクトはtとして好ましい彼は、注射部位。ローカル感染症に対する骨髄細胞の指示への移行を検討するため、細菌は、尾の筋肉、耳胞、あるいは後脳室4から6に注入することができます。さらに、脊索、骨髄系細胞に正常にアクセスできないように見える構造は、局所感染、7〜非常に敏感です。ハイスループットアプリケーションのための有用な代替手段は受精後の最初の8時間以内に胚の卵黄への菌の注射である。蛍光マクロファージや好中球と蛍光細菌およびトランスジェニックゼブラフィッシュラインを組み合わせることにより、宿主 - 病原体相互作用のマルチカラーイメージングのための理想的な状況を作成します。このビデオの記事はSでゼブラフィッシュ胚の静脈内投与と局所感染の詳細なプロトコルを記述します。 ネズミチフス菌またはM. marinum細菌と自然免疫系の細胞との相互作用のその後の蛍光イメージングのために。
Protocol
1。注射針を準備します。
- 、エア圧力：400マイクロピペットプラー装置（サッター·インスツルメンツ、長い先端のために次の設定で/ブラウンP-97フレーミングを使用してホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリー注射針（ハーバード装置、300038、1ミリメートルOD×0.78ミリメートルID）を準備熱610、プル40、速度50、時間30、短い先端のために次の設定で：空気圧500、熱510、プル100;速度200;時間60）。
- 5月10日μmの先端開口直径を得るために微細なピンセットで針の先端を折ります。それはシャープな先端をもたらすためにmicrogrinder（ナリシゲ社、EG-400）角度45°のベベル針の先端開口部をすることをお勧めします。これは、表皮層を穿刺促進するため、鈍針より小さい組織の損傷をより再現性の注射になります。長い先端針は尾静脈（ステップ5）とキュヴィエのダクト（ステップ6.1）注射と短い針先端のために好ましい他の注入プロトコル（手順6.2から6.6）のために好ましい。
2。 S.を準備するネズミチフス菌接種
- S.外板LB寒天プレート上に-80℃のグリセロールストックからネズミチフス菌 （蛍光発現ベクターを選択するために適切な抗生物質）と37℃で一晩インキュベート℃、
- 個々の蛍光陽性コロニーをピックアップし、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で所望の濃度（プロトコル5および6を参照）に再懸濁し、必要に応じて0.085パーセント（v / v）を含むフェノールレッド（Sigma-Aldrich社）は、可視化を支援する注入プロセス。直接注入のために新鮮な懸濁液を使用するか、またはグリセロールストックを準備します。グリセロールストックを調製するために、細菌の所望の濃度でたて注入株式をスピンダウンし、PBS中の滅菌20％（v / v）グリセロール（Sigma-Aldrich）を半分の起動ボリュームにペレットを再懸濁することにより株式を集中しています。 -8でグリセロールストックを保管する0℃必要に応じて0.17パーセントフェノールレッドを含有する滅菌PBSで注射前にグリセロールストック1:1（v / v）を、希釈します。
- 渦凝集を避けるためにも、細菌懸濁液を。
- microloaderチップ（エッペンドルフ、5242956.003）を使用して、マイクロキャピラリー針に接種をロードします。
- S.の比較的大きなサイズのためにネズミチフス菌とその鮮やかなDS-RED蛍光pGMDs3発現ベクター3（リクエストに応じて利用できる菌株）を使用して、個々の細菌細胞は容易に注入量を設定するために、蛍光実体顕微鏡でカウントすることができます。この目的のために、寒天プレート上でPBSのドロップに1 NLを注入する蛍光バクテリアをカウントし、所望の細菌の用量（好ましくは1〜2 nLの間に注入量を維持する）を取得するために必要な注入量を計算します。 Sで胚を注入する選択したルート（プロトコル5および6を参照）を介して菌 。
3。準備する 4。注射用のゼブラフィッシュ胚を準備する 5。一日齢の胚に細菌の静脈注射 6。感染症の代替ルート 7。感染のステレオイメージング 8。感染の共焦点イメージング 9。代表的な結果 マクロファージによる貪食急速に1 DPFの結果では胚の血島にネズミチフス菌またはマイコバクテリウムmarinum菌の注射。 MPEG1遺伝子は 、最近よく確立されたマクロファージマーカーcsf1r（FMS）との共局在やMPX（MPO）とLYZ 4、14と好中球マーカーと重ならない、胚性マクロファージの忠実なマーカーとして同定されている。細菌貪食のライブイメージングのための我々は、MPEG1プロモーターは、マクロファージ14に蛍光タンパク質の発現を駆動するトランスジェニック系統を使用していました。これらのトランスジェニックラインのいずれかMPEG1プロモーターfを持っているGFP遺伝子を直接使用したり、MPEG1プロモーターは楓遺伝子に融合したGAL4認識配列（UAS、上流配列を活性化する）2番目の遺伝子を活性化する酵母GAL4転写因子の発現を駆動する2成分系を採用しています。血島注入（プロトコル5; 図1A）は、ときに正しく実行され、細菌はすぐに血液循環を通って流れると、胚全体に広がるでしょう。比較的大きな、明るい蛍光灯DS-REDラベルS.の普及ネズミチフス菌は、多くの細菌は蛍光マクロファージ（ 図3B-C）によって貪食されている2 HPIショーでステレオ蛍光顕微鏡（ 図3A）と、共焦点イメージングと直接撮像することができます。野生型S.のようにわずか25 CFUの注入ネズミチフス菌は 、致死的な感染症になりながら、病原性の細菌と同様の用量このようなRAの列車は、胚の免疫システム3でクリアすることができます。 250 CFUの注入量は、Sに転写応答を決定するために使用されたゼブラフィッシュ胚とネズミチフス菌感染症は強力な炎症誘発性遺伝子発現応答の15の誘導を示した。対照的に、Mの静脈注射marinum菌は、強力な炎症誘発性応答を誘発しますが、感染したマクロファージが結核2の特徴である肉芽腫の初期段階として考えられているタイトな凝集体を形成する持続感染につながることはありません。 dpiはmCherry標識M.の細胞内増殖を示しています。5時gl22 14行目：Tgのような肉芽腫のような集合体（EGFP MPEG1）の共焦点イメージング緑色蛍光マクロファージ（ 図3D-E）内側marinum菌 。 OT感染症の彼女のルートは、さまざまな目的のために有用である。細菌は、マクロファージを欠いている区画は32 HPF（ 図1C）において、後脳の脳室に注入することができます。 20から100 mCherry標識M.の注入このコンパートメントにmarinum菌は、細菌（ 図4A）を貪食マクロファージによって急速な浸透につながります。生得的な免疫細胞の指示への移行を検討するもう1つの方法は、尾筋（ 図1D）に細菌の注入です。しかし、尾の筋肉注射は、それ自体によって白血球のいくつかの魅力を引き出すことが組織の損傷の原因となります。注意深く耳胞（ 図1E）に少量の（0.5-1 NL）に注入したときにそのような創傷応答を回避することができます。 i114 16行目、S.の約20 CFUの注入：Tgを（EGFP MPX）を使用して、ここに示すように耳胞にネズミチフス菌は、3つの HPIでの好中球の魅力につながる（ 
図1。ゼブラフィッシュ胚で全身または局所の感染を確立するために使用される注入法の概要について説明します。（AB）の急速な全身感染を確立するための静脈注射が1 DPF（）またはキュビエのダクトで後部に血島で尾静脈内に実行されます。 2から3 DPF（B）。 （CE）マクロファージと好中球走化性を研究するための局所注射は、1 DPF（C）で後脳の脳室に実行されます。、1-2 DPF（D）または2〜3 DPF（E）で耳胞における尾筋。 （F）食細胞に明らかにアクセスできない感染を作成するための注射は1-2 DPFで脊索に実行されます。 （G）注射は、M.として成長の遅い細菌を早期に全身感染を作成するmarinumは 16から1000の細胞の段階で卵黄に行うことができます。すべての画像はライカDFC420カメラ（ライカ10446307 0.8倍）に接続されたライカM165C、PLANAPO 1.0Xで撮影したものです。 
図2。髪のループツール 。人間の髪の毛の部分は、パスツールピペットの開口部にループとして挿入され、スーパー接着剤、またはティップ-EXのある場所に固定されている。これは、静かに壊れやすいゼブラフィッシュの胚を操作するための便利なツールを提供しています。 
図3。の静脈注射赤色蛍光ネズミチフス菌およびマイコバクテリウムmarinum。DS-RED-標識されたS.ネズミチフス菌 SL1027細菌（AC）とmCherry標識M. s1999t（AC）またはTgが（MPEG1：EGFP）28時gl22（DE）ゼブラフィッシュの胚：TG（楓UAS-E1B）gl24：marinum Mma20細菌（DE）は、Tgの血島（GAL4-VP16 MPEG1）に注入したHPF。 S.の普及を示す（A）ステレオ蛍光と明視野オーバーレイイメージ2 HPI（ライカDFC420CカメラとライカMZ16FA顕微鏡）での血液循環のネズミチフス菌 。赤いS.を示す（BC）共焦点Z-スタック投影ネズミチフス菌は、2 HPI（ライカTCS SPE、HCX APO対物レンズ40×0.8 NA）にある緑色のマクロファージによって貪食。まだ外である細菌も観察することができます。 Mを含む肉芽腫のような集合体を示す（D）焦点Z-スタック投影5解像度（ライカTCS SPE、HCX APO 40倍でmarinum Mma20感染および非感染マクロファージ0.8 NA）。赤の緑とバクテリアのマクロファージ。細胞内M.、個々のマクロファージの（E）共焦点Z-スタック投影（緑） marinum菌 （赤）。白い四角形でDに示されている領域は、高倍率の対物レンズ（ライカTCS SPE、HCX PL APO 63x 1.2 NA）で撮像された。スケールバー：20μmである。 
図4。ゼブラフィッシュ胚の感染の代替ルート（A）mCherry標識M. marinum Mma20細菌は、32 HPFにおける後脳室に注入した。蛍光と5 HPI（ライカTCS SPE、HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA）でマクロファージによって貪食mCherry標識細菌を示す透過オーバーレイイメージ。 （B）S.ネズミチフス菌は 1 DPFで尾の筋肉に注入した。注射部位（白丸）の骨髄細胞の魅力は、fによって3 HPIで示されている（C）、in situハイブリダイゼーション4 luorescent uninjected胚でこの形態サイトには骨髄細胞は、通常ありません一方。胚はこの段階で成熟した好中球を含んでいませんが、骨髄細胞の2つの集団を区別することができ、好中球マーカーMPX（緑）（ライカTCS SPE、HC PL FLUOTAR 10.0xを表現するマクロファージマーカーmfap4（赤）と1を表現する1 0.3 NA）。細菌の蛍光in situハイブリダイゼーションの手順の後に失われています。 （D）DS-RED-標識されたS. 2 DPFでi114ゼブラフィッシュ：ネズミチフス菌は、Tgの耳胞（EGFP MPX）に注入した。ステレオ蛍光と明視野のオーバーレイイメージMPXことを示している：EGFP：TG（MPXの耳胞へのPBS（E）に対し、制御インジェクション、EGFP標識した好中球細胞を3 HPIに感染した耳胞（点線の楕円）に魅了されてい）i114 ゼブラフィッシュは、感染していない耳のVEに好中球の引力が表示されませんsicle（点線の楕円）（ライカDFC420CカメラとライカMZ16FA）。 （F）M. mCherry標識弱毒E11 eccCb1 :: TN変異株17 marinum菌は1 DPFで脊索に注入した。脊索内の増殖は5解像度（DC500カメラでライカMZ16FA顕微鏡）で撮影されました。 （G）M. mCherry標識血液やリンパ管の内皮細胞にGFPを発現しライン：marinum E11菌はTgが（EGFP fli1a）の16細胞期のゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入した。尾部領域における感染細胞の肉芽腫のような凝集体の形成は5解像度（; 8から画像ライカDFC420CカメラでライカMZ16FA顕微鏡）で観察されています。
Discussion
この資料に記載されている感染方法は、頻繁に自然免疫遺伝子や細菌の病原性遺伝子1の機能を研究するために使用されています。静脈内マイクロインジェクション法（プロトコル5および6.1）は、そのような研究のために最も頻繁に使用されています。後部血島で尾静脈には、1日齢の胚の静脈注射のための最も便利な場所です。尾静脈は後の段階で浸透することはより困難になるにつれ、我々は2-3 DPFにおける胚の静脈内注射部位としてキュビエ管を好む。すべてのケースでは、CFUカウントのためのメッキ注入接種によってチェックされるべき細菌の一貫した数字との胚を注入することが重要です。次の側面は、再現性の注射を達成するために考慮する必要があります。第一に、高品質のガラスマイクロキャピラリー注射針を持っていることが不可欠である。針先が大きすぎる場合は、インジェクションは発生する出血のために十分な大きさの穿刺孔を作成します。注入された細菌は、血液循環の外に流れます。第二に、細菌が血液循環に直接注入する必要があります。針の先端が卵黄嚢の拡張子への注入液のスプレッド静脈内またはそうでない場合であれば、胚は実験から破棄しなければなりません。第三に、Mを注入するためのキャリアとしてPVP40を使用して、 marinumはガラス針に沈んでから細菌を防ぐことに役立ちます。 PVP40は、注射の期間中、より再現性の接種の結果、懸濁液の均質性を向上させます。 PVP40もS.ために使用することができる大きいサイズや細菌の明るい蛍光が実験中に注射接種上のビジュアルコントロールを許可しているので、 ネズミチフス菌の注射が、ここではそれほど重要ではありません。注射を実施するための我々は、フェノールレッド染料（1％v / v）の、または1μmの異なる色（Invitrogen社製）で利用可能な蛍光球の使用をお勧めします。技術が習得されれば、約30 minutを取るESは、アガロースプレート上胚を合わせ、細菌の注入量を調整するために必要な時間を含めて、50から100の胚を注入する。
血島（プロトコル5）に、またはキュビエ（プロトコル6.1）のダクトに静脈内注射が最も一般的に使用されていますが、このビデオ資料に記載されている感染症の代替ルートは、（プロトコル6.2、6.3、マクロファージおよび好中球走化性の研究に有用であることが分かった、および6.4）、弱毒菌株（プロトコル6.5）の成長を研究するために、高スループットアプリケーションのためのゼブラフィッシュ感染モデル（プロトコル6.6）4-8を適応させる。に記載のマイクロインジェクション法もウイルス18、19、真菌の胞子14、20または原生動物の寄生虫（マリアForlenza、私信）の注射のために適用することができます。このビデオ資料に記載されている注射の手続きに便利な付加はzebrに細菌の皮下注射のために最近では説明した手順です。afish胚21。この手順は、組織の表面に効率的に巻き込む細菌に見つかっていたが好中球による細菌の貪食を研究するために適用され、マクロファージとは対照的に、血液中にまたは液体で満たされた体腔への注入時に細菌を貪食することが事実上できませんでした。皮下注射の胚については、このビデオ資料に記載されている尾の筋肉注射の場合と同様に配置されていますが、針が体節を介して細菌を注入するだけで皮膚の下に挿入されます。
マイクロインジェクションは、本質的に感染の人工的なルートであることを考慮することが重要です。しかし、初期の胚は、細菌性病原体に対する外部被曝に対して高い耐性があります。実際には、胚を細菌懸濁液に浸されている液浸アッセイは、我々の手22の再現性はありません。いくつかの胚は、浸漬に感染するかもしれませんが、我々は、死亡率や急行に大きな変化を観察しているこのようなアッセイの個々の胚の間に炎症性マーカー遺伝子のイオン。この資料に記載されているマイクロインジェクション方法は再現性の感染症を達成し、宿主生来の免疫細胞と細菌の相互作用を研究するのに特に有用である。個々の胚で細菌感染を定量化するための効率的なアプローチは、カスタムメイド、専用の画素の定量化ソフトウエア17、23に感染した胚の蛍光画像を分析することです。このアプローチは、感染した胚のめっき後のCFUカウントの結果とよく相関することが示されている。同様に、胚当たりの白血球数の相対的変化は、トランスジェニック白血球フルオロフォアレポーターラインのデジタル画像解析によって定量化されていますが、このアプローチでは感染24〜ホスト白血球産生の反応を定量化するにも適切でしょう。
宿主自然免疫遺伝子の機能について説明し、感染モデルを組み合わせることにより、 生体内で効率的に調べることができますモルホリノノックダウンした。 Morpholinosは、特定のRNAを標的とし、このジャーナル10、25の他のビデオの記事に示されているように、1細胞期のゼブラフィッシュ胚に注入する遺伝子産物の発現を軽減する合成アンチセンスオリゴヌクレオチドである。モルホリノノックダウンの研究では、比較するすべての胚グループは、細菌注射の前に正しく上演されていることを非常に重要である。胚は時間の経過とともにますます有能になる発展途上の免疫システムを持っているので、これは特に重要です。
ゼブラフィッシュ胚では、主要な先天性免疫のサブセット、マクロファージおよび好中球を区別するために現在利用可能ないくつかのトランスジェニックレポーターラインがあります。 MPXとLYZプロモーターは好中球レポーターライン16、26、27を生成するために使用されており、csf1r（FMS）とMPEG1プロモーターは、マクロファージの記者14、28を生成するために使用されました。一方、CSF1R（FMS）は、さらにMPEG1発現がマクロファージで排他的ですが、xanthophoresで表されます。このビデオの記事で示したように、最近開発されたMPEG1レポーターラインはマクロファージによるイメージング細菌貪食のために非常に便利です。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、有益な議論のために魚の世話のために、図4、ウルリケNehrdichとデービー·デ·ウィット内の画像、および他のラボメンバーのチャオ崔、フロア·デ·コート氏、エスターのストゥープとラルフ·カルバリョに感謝します。この作品は、経済や教育·文化·科学省のオランダ省、欧州委員会第7次フレームワークプロジェクトZF-HEALTH（健康F4-2010から242048）、欧州マリー·キュリーのスマートミックス·プログラムでサポートされています初期研修ネットワークFishForPharma（PITN-GA-2011から289209）、およびオーストラリアNHMRC（637394）で。オーストラリアの再生医学研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの補助金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 228210 | |
| Difco Middlebrook 7H10 agar | BD Biosciences | 262710 | |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | BD Biosciences | 211886 | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| BBL Middlebrook ADC Enrichment | BD Biosciences | 211887 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Calbiochem | 529504 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) | Lonza Inc. | 50100 | |
| FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) | Invitrogen | F8821 | |
| FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) | Invitrogen | F8823 |
References
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