Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים, כגון

Abstract

דג הזברה (Danio rerio) עוברים משמשים יותר ויותר כמודל לחקר תפקוד של מערכת החיסון המולדת חוליות של אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן 1. את סוגי התאים העיקריים של מערכת החיסון המולדת, מקרופאגים ו נויטרופילים, לפתח במהלך הימים הראשונים של embryogenesis לפני ההבשלה של לימפוציטים הנדרשים תגובות הסתגלות המערכת החיסונית. להקל על קבלת מספר גדול של עוברים, נגישות בשל פיתוח חיצוני, שקיפות אופטית של בשלבים עובריים הזחל שלהם, מגוון רחב של כלים, משאבים גנטיים מוטציה נרחבים ואוספים של שורות הכתב מהונדס, כולם להוסיף צדדיות של דג הזברה המודל. סלמונלה enterica serovar Typhimurium (ס 'typhimurium) ו Mycobacterium marinum יכולים לשכון intracellularly ב מקרופאגים ו משמשים לעתים קרובות ללמוד בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות עוברי דג הזברה. את הזיהום של תהליכים אלה 2חיידקים פתוגנים הם מעניין להשוות בגלל ש ' זיהום typhimurium הוא חמור וקטלני בתוך יום אחד, בעוד מ ' זיהום marinum היא כרונית ניתן הדמיה עד שלב הזחל 2, 3. האתר של הזרקת מיקרו של חיידקים אל העובר (תרשים 1) קובע אם הזיהום יהיה להפוך במהירות מערכתי או יהיה בתחילה להישאר מקומי. זיהום מערכתי מהיר ניתן לקבוע על ידי מיקרו הזרקת חיידקים ישירות למחזור הדם דרך וריד הזנב על האי דם אחורי או דרך צינור של קיביה, ערוץ זרימת רחב על שק החלמון חיבור הלב vasculature את תא המטען. ב DPF 1, כאשר עוברים בשלב זה יש מקרופאגים פעילים phagocytically אבל הנויטרופילים לא הבשילו עדיין, הזרקת לאי דם עדיפה. על זריקות ב 2-3 DPF, כאשר עוברים גם פיתחו תפקודית (myeloperoxidase לייצור) נויטרופילים, הדביק של קיביה עדיף לא כמוהוא הזרקת באתר. ללמוד הגירה מכוונת של תאים מיאלואידית כלפי זיהומים מקומיים, חיידקים יהיה ניתן להזריק לתוך השריר הזנב, שלפוחית ​​otic, או למוח האחורי החדר 4-6. בנוסף, notochord, מבנה שנראה נגיש בדרך כלל תאים מיאלואידית, סיכון גבוה לזיהום מקומי 7. חלופה שימושי תפוקה גבוהה יישומים הוא הזרקה של חיידקים לתוך החלמון של העובר במהלך השעות הראשונות שלאחר ההפריה 8. שילוב של חיידקים ניאון וקווי דג הזברה מהונדס עם מקרופאגים או נויטרופילים פלורסנט יוצר נסיבות אידיאליות עבור הדמיה רב צבע בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות. מאמר זה יתאר וידאו פרוטוקולים מפורטים של זיהום תוך ורידי ומקומיים של עוברי דג הזברה עם ס ' typhimurium או מ ' marinum חיידקים עבור דימות פלואורסצנטי הבאות של אינטראקציה עם תאים של מערכת החיסון המולדת.

Protocol

1. הכן מחטים בהזרקה

  1. הכן בורוסיליקט microcapillary זכוכית הזרקת מחטים (הרווארד Apparatus, 300038, 1 מ"מ OD × 0.78 מזהה מ"מ) באמצעות מכשיר חולץ micropipette (סאטר מכשירים בע"מ, לוהטים / בראון p-97 עם ההגדרות הבאות עבור עצה יותר: לחץ אוויר 400; חום 610, משיכה 40, מהירות 50, 30 ו הזמן עם ההגדרות הבאות עבור טיפ קצר: לחץ האוויר 500, חום 510, משיכה 100, מהירות 200, הפעם 60).
  2. לנתק את קצה המחט עם פינצטה בסדר לקבל עצה הפתיחה בקוטר של 5-10 מיקרומטר. מומלץ שפוע קצה המחט הפתיחה של 45 מעלות זווית microgrinder (Narishige בע"מ, EG-400) להניב עצה חדה יותר. זה יקל על ניקוב שכבת אפידרמיס ובכך לגרום זריקות לשחזור נוספים עם נזק לרקמות פחות עם מחטים קהים. מחטים שקצהו כבר עדיפים על וריד הזנב (שלב 5) ו Duct של קיביה (שלב 6.1) זריקות ומחטים שקצהו קצריםהם העדיפו את הזרקת פרוטוקולים אחרים (צעדים 6.2-6.6).

2. הכינו ש ' typhimurium הבידוד

  1. צלחת את ס ' typhimurium מ -80 המניות גליצרול C ° על צלחות אגר ליברות (באמצעות אנטיביוטיקה המתאימה כדי לסמן את דרכי הביטוי הקרינה) ו דגירה לילה ב 37 ° C.
  2. בחר מושבות חיוביות fluorescently בודדים resuspend אותם לריכוז הרצוי (ראה פרוטוקולים 5 ו -6) ב סטרילית פוספט בופר סליין (PBS), אופציונלי המכיל 0.085% (V / V) פנול אדום (Sigma-Aldrich) לסייע ויזואליזציה של תהליך ההזרקה. להשתמש ישירות על השעיית טרי להזרקה או להכין מלאי וגליצרול. להכין מלאי וגליצרול, ספין למטה המניות הזרקת טריים עם הריכוז הרצוי של חיידקים ולהתרכז המניות על ידי resuspending גלולה בנפח 1/2 החל גליצרול סטרילית (V / V) 20% (Sigma-Aldrich) ב PBS. אחסן את המניה ב -8 גליצרול0 ° C. לדלל את המניות גליצרול 1:1 (V / V) לפני הזריקה ב סטרילית PBS, לחלופין המכילה פנול אדום 0.17%.
  3. המערבולת ההשעיה חיידקי גם להימנע clumping.
  4. טען את הבידוד לתוך מחט microcapillary משתמש קצה microloader (Eppendorf, 5242956.003).
  5. בשל גודל גדול יחסית של ס ' חיידקים typhimurium ו-DS אדום בוהק הקרינה שלהם כאשר באמצעות וקטור pGMDs3 הביטוי 3 (זן זמין על פי דרישה), תאים חיידקיים בודדים ניתן בקלות לספור עם סטראו הקרינה כדי לקבוע את מינון ההזרקה. לשם כך, להזריק 1 NL לתוך ירידה של PBS על צלחת אגר, לספור את החיידקים ניאון, ולחשב את נפח ההזרקה הדרוש כדי להשיג את המינון הרצוי חיידקי (רצוי לשמור את עוצמת הזריקה בין 1-2 NL). להזריק את העוברים עם ס ' typhimurium דרך כביש שנבחר (ראה פרוטוקולים 5 ו - 6).

3. להכין

  1. שמור מ marinum המתח הגובר על אגר Difco 7H10 מידלברוק (BD החברה) השלימו עם אולאית 10% חומצה אלבומין דקסטרוז, catalase (OADC, BD החברה), גליצרול 0.5%, ועם אנטיביוטיקה המתאימה כדי לסמן את דרכי הביטוי הקרינה (זנים זמין לפי בקשה 9), אז תמיד יש מלאי חדש.
  2. בחר מושבה של מ ' marinum ו resuspend אותו Difco מידלברוק 7H9 מרק (BD החברה) השלימו עם 10% אלבומין דקסטרוז, catalase (ADC, BD החברה) ו - 0.05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) לבין טיפול אנטיביוטי מתאים. בדוק כי צפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר הוא 0.2-0.3 ולתת לו לגדול בין לילה באופן סטטי על 28.5 ° C. זמן הדור של מ ' marinum הוא כ 4-6 שעות, משתנה בהתאם לזן.
  3. למדוד את OD ב 600 ננומטר שוב ביום זריקות. OD600 של 1 מתאים כ 10 8 מ ' marinum / mL(זה עשוי להשתנות על פי זן חיידקי בשימוש, וכך צריך להיות מבוסס על עקומת הצמיחה של זן מסוים).
  4. לקצור את החיידקים כשהם בשלב לוגריתמי (לא נותנים OD600 יעלה 1.00) על ידי צנטריפוגה כביסה אותם שלוש פעמים PBS סטרילית.
  5. למדוד את OD600 שוב ההשעיה החיידקים PBS, ספין למטה, resuspend החיידקים לריכוז הרצוי (ראה פרוטוקולים 5 ו -6) ב PBS או Polyvinylpyrrolidone 2% (PVP40) ב PBS (W / V), אשר משפר את ההומוגניות ההשעיה של חיידקים. פנול אדום (Sigma-Aldrich) ניתן להוסיף בריכוז של 0.085% כדי לסייע להדמיה של תהליך ההזרקה. להשתמש ישירות על השעיית טרי להזרקה או להכין מלאי וגליצרול. להכין מלאי וגליצרול לסובב את המניות הזרקת טריים עם הריכוז הרצוי של חיידקים ולהתרכז המניות על ידי resuspending גלולה בנפח 1/2 החל גליצרול 20% סטרילי ב PBS. אחסן את glycארול המניה ב -80 ° C. לדלל את המניות גליצרול 1:1 (V / V) ב סטרילית PBS, לחלופין המכיל 4% PVP40 ו / או 0.17% פנול אדום.

4. עוברים להכין דג הזברה זריקות

  1. הגדרת זוגות רבייה דג הזברה ולאסוף עוברים כפי שמוצג במאמר אחר וידאו 10. שמור עוברים בצלחת פטרי מלא מים ביצה (60 מיקרוגרם / מ"ל ​​מלחי ים,. ע"א 60 / עוברים צלחת) ו - דגירה על 28.5 ° C.
  2. במידת הצורך, להוסיף 0.003% N-Phenylthiourea (PTU, Sigma-Aldrich) למים ביצה כאשר הם עוברים כ 12 hpf למנוע melanization.
  3. בסביבות 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf), dechorionate את העוברים עם פינצטה פיין (פיין המדע כלים בע"מ, דומונט # 5 מלקחיים - ביולוגיה Inox.
  4. שמור את העוברים בצלחת פטרי מלא מים ביצה בשכבת agarose 1% למטה כדי למנוע עוברים להידבק למשטח הפלסטיק.
  5. להרדים את העוברים עם 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​שנאגרו 3Aminobenzoic-acid (Tricaine, Sigma-Aldrich) כ 10 דקות לפני זריקות.

5. הזרקה תוך ורידית של חיידקים לתוך יום אחד עוברים הישנים

  1. לביים את העוברים על 28 hpf 11 על ידי בדיקת זרימת הדם עולה בקנה אחד, לתחילת פיגמנטציה בעיניים, זנב ישר, הלב להיות ממוקם רק ventrally לעין.
  2. להרדים את העוברים, ראה שלב 4.5.
  3. טען את מחט עם הבידוד חיידקי באמצעות עצה microloader.
  4. הר מחט הועמסו על micromanipulator (כלי סאטר, MM-33) המחובר לעמוד (מכשירי דיוק העולם, מעמד מגנטי M10L) ומקם אותה תחת מיקרוסקופ סטריאופוני (לייקה M50, achromat 1x 0,15 אובייקטיבי NA, בסיס אור מסור TL ST). קבע את הזמן כדי הזרקה של 0.2 והלחץ פיצויים 15 hPa (Eppendorf, Femtojet). התאם את הלחץ הזרקת בין 700 לבין 900 hPa להשיג נפח הזריקה הנכונה מחטבשימוש. להתאים את גודל טיפה כדי להתאים את הקוטר הרצוי בעזרת סרגל קנה המידה על שקופיות מיקרוסקופ או עינית. לקביעת גודל טיפה יהיה ניתן להזריק לתוך שמן מינרלי בשקופית מיקרוסקופ, או את גודל ניתן להעריך על ידי הזרקת באוויר, מה שמשאיר את הירידה תלויה על קצה המחט. רדיוס ירידה של 1 NL הוא 0.062 מ"מ (V = 4/3 π r 3).
  5. הגדר את micromanipulator עם מחט טעון אל המיקום הנכון לפני הזרקת (כלומר כ בזווית של ° 45 ביחס לפני השטח את הצלחת הזריקה) ורק להעביר אותו קדימה ואחורה כדי להזריק.
  6. עוברים את הרדים הם pipetted על צלחת שטוחה agarose 1% הזרקת מים ביצה עודף מוסר, המאפשר מתח הפנים לקיים את העוברים במקום במהלך זריקות. שימוש בלולאה שיער הכלי (איור 2) כדי ליישר את העוברים. אוריינט הצלחת הזריקה ביד במהלך זריקות למקם את העוברים לתנוחה המועדפת inserting, כלומר המחט עם זנבותיהם והצביע לעבר קצה המחט.
  7. הנח את קצה המחט מעל קרוב וריד הזנב לפתיחת המין ודרכי השתן (איור 1 א '), פירס periderm עם קצה המחט להזריק את המינון הרצוי של חיידקים, אנו משתמשים CA. 250 CFU ש ' typhimurium בטבע סוג (WT) מתח SL1027, המכיל את הביטוי DS-RED וקטור pGMDs3, ו CA. 120 CFU של מ ' marinum זן Mma20. ההשעיה חיידקי מוזרק יעברו את זרימת הדם דרך וריד הזנב לכיוון הלב. לפקח אם הזריקה בוצעה כראוי על ידי בדיקת היקף הרחבת מערכת כלי הדם מיד לאחר הדופק 2. עבור מנה תגובה ניסויים, 2-3 זריקות רצופות יכול להתבצע ללא חילוץ המחט.
  8. לעתים קרובות לבדוק את עוצמת הזריקה נשאר זהה במהלך הניסוי. כדי לספק שליטה על עקביות של זריקות במהלך הניסוי, מזריקים DROעמ 'של חיידקים ישירות ירידה PBS סטרילית על מצע התפתחות חיידקים לאחר ההזרקה כל העובר כ 30 ה. צלחת את זה טיפה ולספור את מושבות חיידקים לאחר הדגירה כדי לקבוע את יחידות המושבה להרכיב (CFU) בנפח ההזרקה.
  9. השתמש סטראו הקרינה (פרוטוקול 7) לצפות הפרט ניאון ס תאים typhimurium במחזור הדם מיד לאחר ההזרקה, וזורקים עוברים שלא מוזרקים כמו שצריך. הפרט ניאון מ ' חיידקים marinum לא ניתן לראות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו מיד לאחר זריקות, אבל אגרגטים ניאון של תאים נגועים צריך להיות גלוי על ידי זיהום ימים 2 הודעה (dpi) לגדול עם הזמן.

6. דרכים חלופיות של זיהום

  1. צינור של הזרקת קיביה: בשורה עוברים הרדים (2-3 DPF) על צלחת שטוחה agarose 1% הזרקת זריקות כמו וריד הזנב (ראה 5.6). אוריינט להזריקיון צלחת ביד במהלך זריקות למקם את העוברים לתנוחה המועדפת עבור החדרת המחט, כלומר באלכסון תחת 45 מעלות זווית כך את צינור של קיביה ניתן לגשת על ידי קצה המחט מהצד הגבי של העובר (איור 1 ב) . הכנס את המחט לנקודת ההתחלה של צינור של קיביה הגבי רק למיקום בו צינור מתחיל להרחיב את שק החלמון ואת להזרים 100-200 חיידקים (NL 1-3). הזריקה היא נכונה אם נפח בתוך צינור מתרחב מיד לאחר הדופק ואת שק החלמון לא מקרע. לגבי הזרקות וריד הזנב (ראו 5.7), זריקות רצופות יכול להתבצע ללא חילוץ המחט.
  2. החדר הזרקת למוח האחורי: בשורה עוברים הרדים (32 hpf) על צלחת שטוחה agarose 1% הזרקת כך את עוברי ממוקמים בצד הגבי שלהם לכיוון קצה המחט. הכנס את המחט אל תוך החדר למוח האחורי מהעמדה הקדמית בלי לגעת neuroepithelium (איור 1 ג) ו - 20-100 להזריק חיידקים (0.5-1 NL). כדי לתרגל את הנוהל, השתמש צבע פלואורסצנטי (כמו טקסס אדום dextran) כפי שמוצג במאמר אחר וידאו 13.
  3. שרירים הזרקת זנב: עוברים עמדה הרדים (1-2 DPF) באשר זריקות וריד הזנב (ראה 5.6). התאם micromanipulator עם מחט טעון לזווית של כ 65 מעלות ביחס לפני השטח את הצלחת ההזרקה. להזריק תרחיף חיידקי (0.5-1 NL) המכיל 20-50 CFU לתוך השריר מעל לפתח המין ודרכי השתן (איור 1D) ללא גרימת נזק notochord או כלי דם.
  4. הזרקת שלפוחית ​​Otic: עוברים עמדה הרדים (2-3 DPF) כמו זריקות וריד הזנב (ראה 5.6). התאם micromanipulator עם מחט טעון לזווית של כ 65 מעלות ביחס לפני השטח את הצלחת ההזרקה. להזריק כ 20 חיידקים (0.5 NL) לתוך שלפוחית ​​otic (איור 1E) עם לחץ נמוךיור למנוע קרע ברקמה המקומית.
  5. הזרקת Notochord: בשורה עוברים הרדים (1-2 DPF) על צלחת שטוחה agarose 1% הזרקת כך את עוברי מוצבים עם הזנב שלהם מצביע הרחק בקצה המחט. הכנס את המחט דרך רקמת השריר לתוך הזנב notochord (איור 1F) ו להזריק כ 20-50 חיידקים (מקסימלי 0.5 NL). יש להיזהר לא להזריק נפח גדול מדי, כדי למנוע קרע notochord.
  6. חלמון הזרקה: מיקום ביצים המכילות עוברים בשלב 16-1000 התא על צלחת agarose 1% הזרקת עם ערוצי מלבניים או בצורת V עשה עם עובש ערוץ 12 או באופן מקוון http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . פירס את המחט דרך סיסית למרכז חלמון (איור 1G) ו להזריק חיידקים 20-40 (1-2 NL). השימוש בפתרון PVP40 המוביל 2% עבור ההשעיה חיידקי (ראה שלב 3.5)חשוב למנוע התפשטות חיידקים מוקדם לעובר.

7. הדמיה סטריאו הזיהום

  1. להרדים את בעוברים נגועים ב 1% צלחת פטרי agarose שכבות מכוסה מים הביצה המכיל Tricaine (ראה 4.5).
  2. יישר את העוברים במקום הנכון הדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו עם כלי השיער לולאה (איור 2). לפני בשלפוחית ​​השחייה לא מנופחים (1-5 DPF), העוברים יהיה לשכב על צדם המאפשר הדמיה תצוגה לרוחב.
  3. אם עמדה שונה צפה לרוחב הנדרש, לעלות את העוברים על מתיל תאית 1.5%. לתפעל את העובר לתנוחה הרצויה עם כלי השיער לולאה (איור 2).
  4. להחזיר את העוברים למים ביצה לאחר ההדמיה.

8. הדמיה confocal הזיהום

  1. מניחים ירידה של טמפ 'התכה נמוכה agarose (Lonza בע"מ, 1.5% (W / V) במים ביצה) בתחתית כוסWillCo, צלחת (WillCo וולס, GWSt-5040) אם מיקרוסקופ confocal הפוכה נעשה שימוש, או על שקופית אחת דיכאון חלל (אגר מדעי, L4090) אם מיקרוסקופ confocal זקוף משמש.
  2. מניחים את העובר הרדים את הירידה agarose עם כמות מוגבלת של מים ביצה ולטפל עובר למצב עם כלי השיער לולאה (איור 2). בעת שימוש במיקרוסקופ הפוכה חשוב באזור של העובר עניין היא שטוחה על קרקעית כוס צלחת הדמיה. מיקרוסקופ זקוף יכול לשמש בשילוב עם טבילה במים או מטרות למרחקים ארוכים ויבשים העובר יש למקם כך את האזור של עניין הוא קרוב למטרה ככל האפשר.
  3. בואו agarose לגבש לצלול ירידה agarose במים הביצה המכיל Tricaine (ראה 4.5). אם מיקרוסקופ זקוף משמש, הצב מכסה זכוכית להחליק על גבי חלל דיכאון (לא מאפשרים ליצור בועות אוויר).
  4. ברצף לרכוש שפעתorescence ותמונות הילוכים.
  5. מוציאים בזהירות את agarose מעובר עם פינצטה דקים ומניחים את העובר חזרה למים ביצה, אם יש צורך בניסויים נוספים.

9. נציג תוצאות

הזרקה של סלמונלה או typhimurium Mycobacterium חיידקים marinum אל האי דם של עוברים ב 1 תוצאות DPF ב phagocytosis מהירה של מקרופאגים. הגן MPEG1 לאחרונה זוהה הסמן נאמן של מקרופאגים עובריים, colocalizing עם ומבוססת מקרופאג סמן csf1r (FMS) ולא חופפים עם סמנים נויטרופילים כמו MPX (MPO) ו lyz 4, 14. הדמיה חיה של phagocytosis חיידקי השתמשנו בקווים מהונדס שבו היזם MPEG1 כונני ביטוי חלבון פלואורסצנטי ב מקרופאגים 14. שורות אלה מהונדס או שיש F MPEG1 האמרגןבשימוש ישירות בגן ה-GFP, או מעסיקים מערכת דו רכיבי שבו היזם MPEG1 מניע ביטוי של גורם שעתוק Gal4 שמרים המפעיל transgene 2 עם רצף ההכרה Gal4 (כטב"מ, במעלה הזרם הפעלת רצף) התמזגו לגן קאךה. כאשר האי הזרקת דם (פרוטוקול 5, איור 1 א) נעשה בצורה נכונה, החיידקים מיד לזרום דרך מחזור הדם להתפשט בכל העובר. הפצת גדול יחסית בהיר ניאון DS-RED ס שכותרתו חיידקים typhimurium ניתן הדמיה ישירות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו (איור 3 א), הדמיה confocal ב 2 הופעות HPI כי חיידקים רבים phagocytosed ידי מקרופאגים ניאון (איור 3 ב-C). הזרקת CFU קטנה כמו 25 מסוג ס בר חיידקים typhimurium תגרום לזיהום קטלני, בעוד מנה דומה של חיידקים של של לא אליםהרכבת, כמו Ra, ניתן לפנות על ידי 3 מערכת החיסון העוברי. מינון הזרקת 250 CFU שימש כדי לקבוע התגובות תעתיק את ס ' זיהום typhimurium העובר דג הזברה, והמחיש את הגיוס של תגובה חזקה הגן הפרו דלקתי ביטוי 15. לעומת זאת, הזרקה תוך ורידית של מ ' marinum חיידקים לא לעורר תגובה חריפה הפרו דלקתי, אך מובילה לזיהום מתמשך שבו מקרופאגים נגועים ליצור אגרגטים צפופים שנחשבים בשלבים הראשונים של גרנולומות, שהן סימן ההיכר של שחפת 2. הדמיה confocal של צבירה כגון גרנולומה כמו ב Tg (MPEG1: EGFP) gl22 קו 14 בשעה 5 dpi מראה צמיחה תאיים של mCherry שכותרתו מ ' חיידקים marinum בתוך מקרופאגים פלואורסצנטי ירוק (איור 3D-E).

OTהמסלולים שלה זיהום שימושיים למטרות שונות. חיידקים ניתן להזריק לתוך החדר למוח האחורי ב 32 hpf (איור 1 ג), שהוא תא ללא מקרופאגים. זריקה של 20-100 mCherry שכותרתו מ ' חיידקים marinum לתוך תא זה מוביל חדירה מהירה של מקרופאגים כי phagocytose את החיידקים (איור 4 א). שיטה נוספת ללמוד הגירה מכוונת של תאים חיסוניים מולדים היא הזרקה של חיידקים לתוך השריר הזנב (1D איור). עם זאת, זריקות זנב שרירים גם לגרום נזק לרקמות זה כשלעצמו מעורר כמה המשיכה של כדוריות דם לבנות. תגובה כזו פציעה ניתן להימנע כאשר בזהירות הזרקת נפח קטן (0.5-1 NL) לתוך שלפוחית ​​otic (איור 1E). כפי שמוצג כאן על ידי שימוש Tg (MPX: EGFP) i114 קו 16, הזרקה של CFU כ 20 ש ' typhimurium לתוך שלפוחית ​​otic גורם משיכה של נויטרופילים ב 3 HPI ( (4E איור). Notochord, אשר נראה עמיד בפני חדירה של כדוריות דם לבנות, הוא תא מתירנית לצמיחה של מ ' marinum מוטציות כי הם נחלש מאוד כאשר הוא מוזרק ברקמות אחרות: 7 (איור 4F). לבסוף, הזרקת מוקדם של מ ' marinum בחלמון של עוברים מספק שיטה חלופית להשיג זיהום מערכתי. בדרך כלל אנחנו מבצעים את זריקות סביב הבמה 16 תאים (איור 1G), אבל זריקות חיידקים לתוך החלמון יכולה גם להתבצע בשלבים מאוחרים יותר (עד 1000 בשלב התא), או מוקדם יותר (1-8 בשלב התא) על שיתוף זריקות עם morpholinos 8. החלמון בעקבות הזרקת מינון של CFU 20-40, מ ' חיידקים marinum על פני מספר ימים לתוך הרקמות עובריים גרנולומה כמו אגרגטים טפסים דומים לאלה שנצפו על קונבנציונליתהזרקה תוך ורידית שיטה 8: (4G איור). שיטת הזרקת החלמון אינו מתאים ש זיהום typhimurium, כי הצמיחה המהירה שלה החלמון גורם הקטלניות מוקדם. שיטת ההדבקה חלמון של מ ' זיהום marinum יהיה שימושי עבור תפוקה גבוהה יישומים שכן הוא יכול להיות אוטומטי באמצעות רובוט הזרקת 8.

איור 1
באיור 1. זריקות תוך ורידי סקירה כללית של שיטות הזרקת המשמשים לקביעת זיהומים סיסטמיים או מקומיים עוברי דג הזברה. (AB) לקביעת זיהום מערכתי מהיר מבוצעות לווריד הזנב לאי הדם האחורי ב DPF 1 (א) או לתוך צינור של קיביה ב 2-3 DPF (ב '). (CE) זריקות מקומיות ללימוד מקרופאג ו chemotaxis נויטרופילים מבוצעים לתוך החדר למוח האחורי ב DPF 1 (ג), שרירי הזנב ב DPF 1-2 (D) או שלפוחית ​​otic ב DPF 2-3 (ה). (ו) זריקות כדי ליצור זיהום נגיש ככל הנראה phagocytes מבוצעות תוך notochord ב DPF 1-2. (ז) זריקות כדי ליצור זיהום מערכתי מוקדם עם חיידקים הגדלים לאט, כמו מ ' marinum יכול להתבצע לתוך החלמון בשלב 16-1000 התא. כל התמונות צולמו עם M165C לייקה, PLANAPO 1.0x מחוברת המצלמה Leica DFC420 (לייקה 10446307 0.8x).

איור 2
איור 2. לולאת שיער הכלי. חתיכה של שיער אדם מוכנס כמו לולאה לתוך הפתח של פיפטה פסטר קבוע במקום עם דבק סופר או עם טיפ-Ex. זה מספק כלי נוח לתמרן בעדינות עוברי דג הזברה שבירים.

איור 3
איור 3. זריקות תוך ורידי שלאדום ניאון סלמונלה typhimurium ו Mycobacterium marinum. DS-RED-שכותרתו ס typhimurium SL1027 חיידקים (AC) ו-mCherry שכותרתו מ ' marinum Mma20 חיידקים (DE) הוזרקו האי דם Tg (MPEG1: Gal4-VP16) gl24, Tg (כטב"מ-E1b: קאךה) s1999t (AC) או Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) עוברי דג הזברה ב 28 hpf. () שכבה של תמונה סטריאו פלואורסצנציה ובהיר שדה מראה הפצת ס typhimurium במחזור הדם 2 HPI (לייקה מיקרוסקופ MZ16FA עם לייקה DFC420C המצלמה). (לפני הספירה) confocal Z-מחסנית התחזיות מראה אדום ס חיידקים typhimurium phagocytosed ידי מקרופאגים ירוקים ב 2 HPI (לייקה TCS SPE, HCX המטרה APO 40X 0.8 NA). חיידקים, כי הם עדיין תאי יכול להיות גם ציין. (ד) Confocal Z-מחסנית התחזית מראה המצרפי גרנולומה דמוי המכיל מ marinum מקרופאגים Mma20-נגועים נגוע ב 5 dpi (לייקה TCS SPE, HCX APO 40X0.8 NA). מקרופאגים בירוק וחיידקים באדום. (ה) Confocal Z-מחסנית השלכה של מקרופאג הפרט (ירוק) עם מ 'תאיים marinum חיידקים (אדום). השטח המתואר על ידי D מלבן לבן צילמו במטרה בהגדלה גבוהה יותר (לייקה TCS SPE, HCX PL APO 63x 1.2 NA). Scalebars: 20 מיקרומטר.

איור 4
באיור 4. מסלולים חלופיים עבור זיהום של עוברי דג הזברה. () MCherry שכותרתו יג marinum Mma20 חיידקים הוזרקו החדר למוח האחורי ב hpf 32. הקרינה ואת כיסוי שידור התמונה מראה חיידקים mCherry שכותרתו phagocytosed ידי מקרופאגים ב 5 HPI (לייקה TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA). (ב) ס typhimurium שהוזרק לתוך השריר הזנב ב DPF 1. משיכה של תאים מיאלואידית באתר ההזרקה (לבן מעגל) מוצג ב 3 HPI על ידי Fluorescent ב הכלאה באתרו 4, (ג) ואילו עוברים uninjected יש בדרך כלל לא התאים מיאלואידית באתר זה מורפולוגי. למרות העוברים אינם מכילים נויטרופילים בשלים בשלב זה, שתי אוכלוסיות של תאים מיאלואידית ניתן להבחין, אחד להביע את הסמן מקרופאג mfap4 (אדום) ואחד להביע את הסמן נויטרופילים MPX (ירוק) (לייקה TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x 0.3 NA). הקרינה של החיידק אובד אחרי בהליך ההכלאה באתרה. (ד) DS-RED-שכותרתו ש ' חיידקים typhimurium הוזרקו שלפוחית ​​otic של Tg (MPX: EGFP) i114 דג הזברה ב DPF 2. התמונות כיסוי סטריאו פלואורסצנציה ובהיר שדה עולה כי MPX: EGFP התאים המסומנים נויטרופילים נמשכים שלפוחית ​​otic נגוע (אליפסה מנוקד) בשעה 3 HPI, (E) ואילו הזרקת השליטה PBS לתוך שלפוחית ​​otic של Tg (MPX: EGFP ) i114 דג הזברה לא מראה משיכה של נויטרופילים ל יש otic נגועsicle (אליפסה מנוקד) (לייקה MZ16FA עם מצלמה DFC420C לייקה). (ו) mCherry שכותרתו מ ' חיידקים marinum של E11 נחלש eccCb1 :: TN זן מוטנטי 17 הוזרקו notochord ב DPF 1. ריבוי בתוך notochord היה צילמו בשעה 5 dpi (לייקה מיקרוסקופ MZ16FA עם מצלמה DC500). (ז) mCherry שכותרתו מ ' marinum חיידקים E11 הוזרקו חלמון של 16 תאים דג הזברה עוברים שלב של Tg (fli1a: EGFP) קו המבטא GFP בתאים אנדותל של כלי הדם, הלימפה. היווצרות גרנולומה כמו אגרגטים של תאים נגועים באזור הזנב הוא ציין ב 5 dpi (מיקרוסקופ MZ16FA לייקה עם מצלמה DFC420C Leica, תמונה 8).

Discussion

שיטות הזיהום המתוארות במאמר זה נעשה שימוש לעתים קרובות כדי ללמוד את הפונקציה של גנים מולדים המארחות חסינות או גנים ארסיות חיידקים 1. תוך ורידי של מיקרו הזרקה שיטות (פרוטוקולים 5 ו 6.1) משמשים בדרך כלל ללימודים כאלה. וריד הזנב על האי דם האחורי הוא המיקום הנוח ביותר עבור הזרקה תוך ורידית של 1-בני יומם עוברים. כמו וריד הזנב הופך להיות קשה יותר לחדור בשלבים מאוחרים יותר, אנו מעדיפים את צינור של קיביה כאתר הזרקה תוך ורידית של עוברי ב DPF 2-3. בכל מקרה זה קריטי להזריק את העוברים עם מספרים עקביים של חיידקים, אשר צריך להיבדק על ידי הזרקת inocula ציפוי על ספירת CFU. ההיבטים הבאים יש לקחת בחשבון כדי להשיג זריקות לשחזור. ראשית, חשוב שיהיה באיכות גבוהה microcapillary זכוכית מחטי הזרקה. אם קצה המחט גדולה מדי, הזרקת תיצור חור לנקב גדול מספיק מדמם להתרחשהחיידקים המוזרקים יזרום מתוך מחזור הדם. שנית, החיידק חייב להיות מוזרק ישירות לתוך מחזור הדם. אם קצה המחט לא בתוך הווריד או אם נוזל מתפשט זריקה לתוך הרחבה שק חלמון, העובר חייב להיות מושלך מן הניסוי. שלישית, באמצעות PVP40 כנשא להזרקת מ ' marinum יסייע למנוע את החיידקים מן שוקע בתוך מחט זכוכית. PVP40 משפר את ההומוגניות של השעיה, וכתוצאה מכך inocula יותר לשחזור בכל משך זמן של זריקות. PVP40 יכול לשמש גם למטרות ס זריקות typhimurium, אבל כאן זה פחות חשוב כי גודל גדול הקרינה בהיר של החיידקים מאפשר בקרה חזותית על הבידוד הזרקת במהלך הניסויים. עבור לתרגל את הזריקות אנו ממליצים להשתמש פנול אדום צבע (1% V / V) או 1 מיקרומטר כדורים ניאון זמין בצבעים שונים (Invitrogen). לאחר הטכניקה שולט, זה לוקח בערך 30 מינוטes להזריק 50-100 עוברים, כולל הזמן הדרוש יישור עוברים על צלחות agarose והתאמת נפח הזרקת חיידקים.

בעוד זריקות תוך ורידי לתוך האי דם (פרוטוקול 5) או לתוך צינור של קיביה (פרוטוקול 6.1) משמשים בדרך כלל, על דרכים חלופיות של זיהום המתוארות במאמר זה וידאו הוכיחו שימושי ללמוד מקרופאג ו נויטרופילים chemotaxis (פרוטוקולים 6.2, 6.3 , ו - 6.4), ללמוד הצמיחה של זני חיידקים מוחלשים (פרוטוקול 6.5), ולהתאים את המודל זיהום דג הזברה עבור תפוקה גבוהה יישומים (פרוטוקול 6.6) 4-8. תיאר את שיטות הזרקת מיקרו יכול להיות מיושם גם על זריקות של 18 וירוסים, נבגי פטריות 19, 14, 20 או טפילים protozoan (מריה פורלנזה, תקשורת אישית). בנוסף שימושי הנהלים הזרקת המתוארות במאמר זה וידאו היא הליך תיאר לאחרונה להזרקה תת עורית של חיידקים לתוך zebrafish עוברים 21. נוהל זה יושם ללמוד phagocytosis של חיידקים על ידי נויטרופילים, שנמצאו חיידקים לבלוע ביעילות על משטחים רקמות אבל, בניגוד מקרופאגים, לא הצליחו כמעט phagocytose חיידקים על זריקה לתוך הדם או אל מלאות נוזל חללים בגוף. עבור העוברים תת עורי זריקות ממוקמים דומה באשר השריר זריקות זנב המתוארות במאמר זה וידאו, אבל את המחט מוחדרת מתחת לעור להזריק את החיידקים על somite.

חשוב לקחת בחשבון כי מיקרו הזרקה היא למעשה תוואי מלאכותית של זיהום. עם זאת, עוברי מוקדם עמידות מאוד לחשיפה חיצונית פתוגנים חיידקיים. למעשה, מבחני טבילה, שבו עוברים שטופים ההשעיה חיידקי, לא לשחזור בידינו 22. בעוד כמה עוברי יכול להידבק על טבילה, ראינו שונות רבה בשיעורי התמותה והן אקספרסיון של גנים דלקתיים סמן בין עוברים מבחני בודדים כאלה. המיקרו הזרקה בשיטות המתוארות במאמר זה להשיג זיהומים לשחזור והם יעילים במיוחד כדי לחקור אינטראקציות חיידקים עם תאים חיסוניים מולדים המארחות. הגישה היעילה לכמת זיהום חיידקי עוברי בודדים היא לנתח את התמונות ניאון של עוברים נגועים מחוייט, תוכנה ייעודית כימות פיקסל 17, 23. גישה זו הוכח לתאם גם עם התוצאות של ספירת CFU לאחר ציפוי של עוברים נגועים. כמו כן, שינויים יחסית במספרים ליקוציט לכל העובר היה לכמת ידי ניתוח תמונה דיגיטלית ב מהונדס fluorophore קווי ליקוציט הכתב, גישה זו תהיה ישימה לכימות בתגובה המארח leukopoietic לזיהום 24.

פונקציה של גנים מארח מולדים החיסון ניתן לחקור ביעילות על ידי שילוב של מודלים זיהום המתוארים vivoעם מציאה morpholino. Morpholinos הם מולקולות אנטיסנס סינתטיים כי היעד RNAs ספציפיים ולצמצם את הביטוי של גנים המוצרים כאשר מזריקים 1-סלולריים עוברי דג הזברה הבמה כפי שמוצג כתבות וידאו אחרים היומן הזה 10, 25. במחקרים morpholino מציאה, יש חשיבות רבה, כי כל הקבוצות העובר כדי להשוות מועלים בצורה נכונה לפני זריקות חיידקים. זה חשוב במיוחד, כי עוברים יש מערכת החיסון מפתחת המוסמכת שהופך יותר ויותר עם הזמן.

ישנם כמה קווי הכתב מהונדס זמין כרגע להבחין בין תת קבוצות עיקריות החיסון המולדת, מקרופאגים, נויטרופילים עוברי דג הזברה. MPX ואת היזמים lyz שימשו כדי ליצור קווי הכתב נויטרופילים 16, 26, 27, ו csf1r (FMS) ו MPEG1 מקדמי שימשו להפקת כתבים מקרופאג 14, 28. בעוד CSF1R (FMS) באה לידי ביטוי ב xanthophores בנוסף, MPEG1 הביטוי הוא אך ורק מקרופאגים. כפי שניתן לראות במאמר זה וידאו, שפותחו לאחרונה MPEG1 קווי הכתב שימושיים ביותר עבור phagocytosis הדמיה חיידקי ידי מקרופאגים.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות קואי צ'או, קומה דה קורט, מרפסת אסתר ראלף קרבאליו לתמונות בתרשים 4 אולריקה Nehrdich ודייוי דה ויט לטיפול דגים, ובני מעבדה אחרות דיונים מועילים. עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית תמהיל חכם של משרד הולנד לעניינים כלכליים ומשרד החינוך, התרבות והמדע, הנציבות האירופית 7 הפרויקט במסגרת ZF-בריאות (בריאות F4-2010-242048), מארי קירי האירופי הדרכה ראשונית רשת FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), ועל ידי NHMRC אוסטרלי (637,394). אוסטרליה הרגנרציה לרפואה המכון נתמך על ידי תרומות של ממשלת מדינת ויקטוריה ממשלת אוסטרליה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

Tags

אימונולוגיה גיליון 61 עובר דג הזברה חסינות מולדת מקרופאגים זיהום סלמונלה Mycobacterium מיקרו הזרקה הקרינה הדמיה,
זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E. L., van der Sar, A. M.,… More

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter