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Immunology and Infection

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales como

Abstract

Pez cebra (Danio rerio), los embriones se utiliza cada vez más como un modelo para estudiar la función de los vertebrados del sistema inmune innato en las interacciones huésped-patógeno 1. Los principales tipos de células del sistema inmune innato, los macrófagos y neutrófilos, se desarrollan durante los primeros días de la embriogénesis antes de la maduración de los linfocitos que se requieren para las respuestas inmunitarias adaptativas. La facilidad de obtener un gran número de embriones, su accesibilidad debido a la externa para el desarrollo, la transparencia óptica de estadios embrionario y larval, una amplia gama de herramientas genéticas, los amplios recursos y colecciones de mutantes de las líneas transgénicas, el reportero se suman a la versatilidad del pez cebra modelo. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) y Mycobacterium marinum puede residir de manera intracelular en los macrófagos y se utilizan con frecuencia para estudiar las interacciones huésped-patógeno en embriones de pez cebra. Los procesos de infección de estas dospatógenos bacterianos son interesantes para comparar ya que S. la infección es aguda typhimurium y letal en un día, mientras que M. la infección es crónica marinum y se puede exponer a la etapa de larva 2, 3. El sitio de micro-inyección de bacterias en el embrión (Figura 1) determina si la infección rápidamente se convertirá sistémica o inicialmente permanecerá localizada. Una infección sistémica rápida puede ser establecido por micro-inyección de bacterias directamente en la circulación sanguínea a través de la vena caudal en la isla posterior o sangre a través del conducto de Cuvier, un canal de circulación de ancho en el saco vitelino conecta el corazón a la vasculatura tronco. En un DPF, cuando los embriones en esta etapa tienen los macrófagos phagocytically activos, pero los neutrófilos aún no han madurado, la inyección en la isla de sangre se prefiere. Para las inyecciones en el 2-3 fdd, cuando los embriones también se han desarrollado funcionales (mieloperoxidasa que produce) los neutrófilos, el conducto de Cuvier se prefiere como tque el sitio de inyección. Para estudiar la migración dirigida de las células mieloides hacia infecciones locales, las bacterias pueden ser inyectados en el músculo cola, vesícula ótica, o rombencéfalo ventrículo 4-6. Además, la notocorda, una estructura que parece ser normalmente inaccesible a las células mieloides, es altamente susceptible a la infección local 7. Una alternativa útil para aplicaciones de alto rendimiento es la inyección de bacterias en la yema de los embriones en las primeras horas después de la fecundación 8. La combinación de bacterias fluorescentes y las líneas de transgénicos de pez cebra con los macrófagos fluorescentes o neutrófilos crea condiciones ideales para la multi-color de imágenes de las interacciones huésped-patógeno. Este artículo video describe protocolos detallados para la infección por vía intravenosa y locales de los embriones de pez cebra con S. typhimurium o M. marinum bacterias y para la imagen posterior de fluorescencia de la interacción con las células del sistema inmune innato.

Protocol

1. Preparar Agujas de inyección

  1. Preparar agujas de vidrio de borosilicato microcapilares de inyección (Harvard Apparatus, 300038, de 1 mm de diámetro externo × 0,78 mm de diámetro) con un dispositivo extractor de micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown p-97 con los siguientes valores para un consejo más: la presión del aire 400; de calor 610; tirón 40; velocidad de 50, el tiempo de 30 y con los siguientes valores para una punta más corta: la presión del aire 500; de calor 510, 100 tracción, velocidad de 200, el tiempo de 60).
  2. Rompa la punta de la aguja con las pinzas finas para obtener un diámetro de abertura de la punta de micras 5-10. Es aconsejable bisel de la abertura punta de la aguja en un ángulo de 45 grados con una microgrinder (Narishige Inc., EG-400) para producir una punta más aguda. Esto facilitará la perforación de la capa epidérmica y por lo tanto dar lugar a más inyecciones reproducibles con el daño tisular menor que con agujas romas. Agujas con punta más larga son los preferidos para la vena caudal (paso 5) y el conducto de Cuvier (paso 6.1) y las inyecciones de agujas más cortas con puntase prefieren para los protocolos de inyección otros pasos (6.2-6.6).

2. Preparar S. typhimurium inóculo

  1. Placa de S. typhimurium de un stock de -80 ° C glicerol en placas de agar LB (con los antibióticos apropiados para seleccionar para vectores de expresión de fluorescencia) y se incuba durante una noche a 37 ° C.
  2. Elige individuales colonias positivas fluorescentemente y resuspender a la concentración deseada (véase protocolos 5 y 6) en estéril tamponada con fosfato salino (PBS), que contiene opcionalmente 0,085% (v / v) de rojo fenol (Sigma-Aldrich) para ayudar a la visualización del inyección proceso. Utilizar directamente la suspensión fresca para la inyección o preparar las poblaciones de glicerol. Para preparar las existencias de glicerol, girar hacia abajo el stock de inyección recién hecha con la concentración deseada de bacterias y concentrar el stock de resuspender el sedimento en la mitad del volumen de partida en estéril 20% (v / v) de glicerol (Sigma-Aldrich) en PBS. Guarde el stock de glicerol a -80 ° C. Diluir el stock de glicerol 1:1 (v / v) antes de la inyección en PBS estéril, que contiene opcionalmente 0,17% de rojo fenol.
  3. Vórtice de la suspensión bacteriana y evitar la formación de grumos.
  4. Cargue el inóculo en la aguja con una punta de microcapilar microloader (Eppendorf, 5.242.956,003).
  5. Debido al tamaño relativamente grande de S. bacterias typhimurium y su fluorescencia brillante Ds-RED cuando se utiliza el vector de expresión pGMDs3 3 (cepa disponibles bajo petición), las células bacterianas individuales pueden ser contadas con un microscopio estereoscópico de fluorescencia con el fin de ajustar la dosis de la inyección. Para este fin, inyectar 1 nL en una gota de PBS en una placa de agar, contar las bacterias fluorescentes, y calcular el volumen de inyección que se requiere para obtener la dosis deseada bacteriana (preferiblemente mantener el volumen de inyección entre 1-2 nL). Inyectar los embriones con S. typhimurium a través de la ruta seleccionada (ver protocolos 5 y 6).

3. Preparar

  1. Mantenga la M. marinum cepa que crece en agar Middlebrook 7H10 Difco (BD y de la empresa), complementado con 10% de ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa (OADC, BD y de la empresa), 0,5% de glicerol, y con los antibióticos apropiados para seleccionar los vectores de expresión de fluorescencia (cepas disponibles previa solicitud 9), por lo que existe siempre un stock fresco.
  2. Elija una colonia de M. marinum y resuspender en medio líquido Middlebrook 7H9 Difco (BD y de la empresa), complementado con Tween 10% de albúmina-dextrosa-catalasa (ADC, BD y de la empresa) y 0,05% 80 (Sigma-Aldrich) y los antibióticos apropiados. Compruebe que la densidad óptica (DO) a 600 nm es 0,2 a 0,3 y se deja crecer de forma estática durante toda la noche a 28,5 ° C. El tiempo de generación de M. marinum es de aproximadamente 4-6 horas, variando de acuerdo a la cepa.
  3. Medir la DO a 600 nm de nuevo en el día de inyecciones. Un OD600 de 1 corresponde a aproximadamente 10 8 M. marinum / ml(Esto puede variar dependiendo de la cepa bacteriana utilizada y por lo tanto se debe basar en una curva de crecimiento de la cepa en particular).
  4. Coseche las bacterias cuando están en fase logarítmica (no deje que el OD600 superar 1,00) por centrifugación y lavado tres veces en PBS estéril.
  5. Medir la DO600 de nuevo de la suspensión bacteriana en PBS, la desaceleración y resuspender las bacterias a la concentración deseada (véase protocolos 5 y 6) en PBS o en 2% Polivinilpirrolidona (PVP40) en PBS (w / v), que mejora la homogeneidad de la suspensión bacteriana. Rojo de fenol (Sigma-Aldrich) se puede añadir a una concentración de 0,085% a ayudar a la visualización del proceso de inyección. Utilizar directamente la suspensión fresca para la inyección o preparar las poblaciones de glicerol. Para preparar las existencias glicerol girar hacia abajo el stock de inyección recién hecha con la concentración deseada de bacterias y concentrar el stock de resuspender el sedimento en la mitad del volumen a partir de glicerol estéril 20% en PBS. Guarde el GlycErol acciones a -80 ° C. Diluir el stock de glicerol 1:1 (v / v) en PBS estéril, que contiene opcionalmente 4% PVP40 y / o 0,17% de rojo fenol.

4. Preparar embriones de pez cebra para preparaciones inyectables

  1. Establecer pares de cría de pez cebra y recoger los embriones como se muestra en otro artículo de vídeo 10. Mantener embriones en una placa Petri con agua de huevo (60 g / ml sales del Mar, ca. 60 embriones y placa) y se incuba a 28,5 º C.
  2. Si es necesario, añadir un 0,003% de N-feniltiourea (PTU, Sigma-Aldrich) al agua del huevo, cuando los embriones son aproximadamente el 12 por HPF para evitar la melanización.
  3. Alrededor de 24 horas después de la fecundación (HPF), dechorionate los embriones con unas pinzas finas (Fine Ciencia Herramientas Inc., Dumont # 5 Pinzas-Biología Inox.
  4. Mantener los embriones en una placa de Petri con agua y huevo con una capa de agarosa al 1% en la parte inferior para evitar que los embriones se peguen a la superficie de plástico.
  5. Anestesie los embriones con 200 ug / ml tamponada 3Ácido p-aminobenzoico (tricaína, Sigma-Aldrich) aproximadamente 10 minutos antes de la inyección.

5. La inyección intravenosa de bacterias en un día de edad embriones

  1. Etapa de los embriones en 28 HPF 11 mediante la comprobación de la circulación sanguínea en consonancia, a partir de la pigmentación en los ojos, una cola recta, y el corazón se coloca justo ventralmente a la vista.
  2. Anestesie los embriones, vea el paso 4.5.
  3. Coloque la aguja con el inóculo bacteriano usando una punta microloader.
  4. Monte la aguja de carga en un micromanipulador (Instrumento de Sutter, MM-33) conectado a un soporte (World Precision Instruments, soporte magnético M10L) y colocarlo debajo de un microscopio estereoscópico (Leica M50, acromático 1x objetivo de 0,15 NA, base de luz transmitida TL ST). Establecer el tiempo de inyección a 0,2 s y la compensación de la presión a 15 hPa (Eppendorf, FemtoJet). Ajustar la presión de inyección entre 700 y 900 hPa para obtener el volumen de inyección correcta para la agujautilizada. Ajustar el tamaño de gota para que coincida con el diámetro deseado con la ayuda de una barra de escala en un portaobjetos de microscopio o en el ocular. Para la determinación del tamaño de la gota se puede inyectar en aceite mineral sobre un portaobjetos de microscopio, o el tamaño se puede estimar mediante la inyección en el aire, lo que deja la gota colgante en la punta de la aguja. El radio de una gota de 1 nL es 0,062 mm (V = 4/3 π r 3).
  5. Establecer el micromanipulador con la aguja cargada en la posición correcta antes de la inyección (es decir, aproximadamente en un ángulo de 45 ° con respecto a la superficie de la placa de inyección) y sólo se mueve adelante y atrás para inyectar.
  6. Los embriones son anestesiados pipeta en un piso del 1% de agarosa placa de inyección de agua y se elimina el exceso de huevo, lo que permite la tensión superficial para mantener los embriones en su lugar durante las inyecciones. Utilice una herramienta de lazo de pelo (Figura 2) para alinear los embriones. Oriente la placa de inyección a mano durante las inyecciones para colocar los embriones en la posición preferida para inserting la aguja, es decir, con la cola apuntando hacia la punta de la aguja.
  7. Colocar la punta de la aguja directamente sobre la vena caudal para cerrar la abertura urogenital (Figura 1A), perforar la peridermis con la punta de la aguja e inyectar la dosis deseada de bacterias; usamos ca. 250 ufc de S. typhimurium de tipo salvaje (wt) de la cepa SL1027, que contiene la expresión Ds-RED vector pGMDs3, y ca. 120 ufc de M. marinum cepa Mma20. La suspensión bacteriana inyectado seguirá el flujo sanguíneo a través de la vena caudal hacia el corazón. Controlar si la inyección se ha realizado correctamente mediante la comprobación de un mayor volumen del sistema vascular directamente después del impulso de 2. Para los experimentos de dosis-respuesta, 2-3 inyecciones consecutivas se puede realizar sin necesidad de extraer la aguja.
  8. Compruebe con frecuencia que el volumen de inyección sigue siendo la misma durante el experimento. Para proporcionar un control de la consistencia de las inyecciones en todo el experimento, se inyecta un DROp de las bacterias directamente en una solución estéril de PBS sobre la caída de un medio de crecimiento bacteriano después de cada inyección de aproximadamente 30 º de embriones. Placa a cabo esta caída y contar las colonias bacterianas después de la incubación para determinar las unidades formadoras de colonias (ufc) en el volumen de inyección.
  9. Utilice un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Protocolo n º 7) para observar individuo S. fluorescentes las células de S. typhimurium que circula en el torrente sanguíneo directamente después de la inyección, y desechar los embriones que no están debidamente inyectadas. Individual M. fluorescentes marinum bacterias no se puede observar por microscopía de fluorescencia estéreo directamente después de las inyecciones, pero agregados fluorescentes de células infectadas debe ser visible por 2 días después de la infección (dpi) y crecen con el tiempo.

6. Vías alternativas de infección

  1. Conducto de la inyección de Cuvier: se alinean embriones anestesiados (2-3 DPF) en un piso del 1% placa de agarosa de inyección, para preparaciones inyectables vena caudal (ver 5.6). Oriente la inyeccióniones de la placa con la mano durante las inyecciones para colocar los embriones en la posición preferida para insertar la aguja, es decir, en diagonal con un ángulo de 45 ° para que el conducto de Cuvier puede ser abordado por la punta de la aguja desde el lado dorsal del embrión (Figura 1B) . Inserte la aguja en el punto de partida del conducto de Cuvier sólo dorsal a la ubicación en la que el conducto se inicia la ampliación sobre el saco vitelino y se inyectan las bacterias 100-200 (1-3 NL). La inyección es correcta si el volumen se expande dentro del conducto directamente después del pulso y el saco vitelino no está roto. En cuanto a las inyecciones de la vena caudal (véase 5,7), varias inyecciones consecutivas se puede realizar sin necesidad de extraer la aguja.
  2. Cerebro posterior inyección del ventrículo: se alinean embriones anestesiados (32 HPF) en un piso del 1% de agarosa placa de inyección de tal manera que los embriones se colocan con la cara dorsal hacia la punta de la aguja. Inserte la aguja en el ventrículo posterior del cerebro a partir de una posición anterior sin tocar el neuroepithelium (fig. 1C) e inyectar 20-100 bacterias (0,5-1 latitud norte). Para practicar el procedimiento, utiliza un tinte fluorescente (tales como Texas Red-dextrano) como se muestra en otro artículo de vídeo 13.
  3. La cola de inyección muscular: los embriones posición anestesiados (1-2 DPF) como para las inyecciones vena caudal (ver 5.6). Ajustar el micromanipulador con la aguja cargada con un ángulo de aproximadamente 65 ° con respecto a la superficie de la placa de inyección. Inyectar una suspensión bacteriana (0.5-1 nL) que contiene 20 a 50 ufc en el músculo por encima de la abertura urogenital (Figura 1D) sin causar daño a la notocorda o vasos sanguíneos.
  4. Inyección de vesícula ótica: embriones posición anestesiados (2-3 DPF) para inyección vena caudal (ver 5.6). Ajustar el micromanipulador con la aguja cargada con un ángulo de aproximadamente 65 ° con respecto a la superficie de la placa de inyección. Inyectar aproximadamente 20 bacterias (0,5 nL) en la vesícula ótica (Figura 1) con la prensa de bajaure para evitar la ruptura del tejido local.
  5. Inyección de notocorda: se alinean embriones anestesiados (1-2 DPF) en un piso del 1% de agarosa placa de inyección de tal manera que los embriones se colocan con su cola apuntando hacia afuera de la punta de la aguja. Inserte la aguja a través del tejido muscular cola en la notocorda (Figura 1F) y se inyecta alrededor de 20 a 50 bacterias (máximo de 0,5 nL). Tenga cuidado de no inyectar demasiado volumen para evitar la ruptura de la notocorda.
  6. Yema de inyección: los huevos que contienen embriones de posición en la etapa de la celda 16 hasta 1000 en un 1% de agarosa placa de inyección con canales rectangulares o en forma de V o hechos a medida con un molde de canal 12 o en línea en http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Pierce la aguja a través del corion en el centro de la yema (Figura 1G) e inyectar bacterias 20-40 (1-2 nL). El uso de solución al 2% portador PVP40 para la suspensión bacteriana (véase el paso 3,5)es importante para prevenir la propagación de bacterias en el embrión temprano.

7. Imagen estéreo de la infección

  1. Anestesie los embriones infectados en un 1% de agarosa al plato de Petri en capas cubiertas de agua huevo que contiene tricaína (ver 4.5).
  2. Alineación de los embriones en la posición correcta para la imagen bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia con una herramienta de bucle del cabello (Figura 2). Antes de la vejiga natatoria ha inflado (1-5 DPF), los embriones se recostará sobre su lado que permite imágenes de vista lateral.
  3. Si una posición diferente a la vista lateral es necesario, instale los embriones en metilcelulosa al 1,5%. Manipular el embrión en la posición requerida con una herramienta de bucle del cabello (Figura 2).
  4. Volver a los embriones de huevo con el agua después de la filmación.

8. Imagen confocal de la infección

  1. Colocar una gota de bajo punto de fusión de agarosa (Lonza Inc., 1,5% (w / v) en agua huevo) en la parte inferior de un vasoWillco-DISH (Willco Wells, GWSt-5040), si un microscopio confocal invertido se utiliza, o en una cavidad de la depresión sola diapositiva (Agar Scientific, L4090) en caso de un microscopio confocal se utiliza en posición vertical.
  2. Coloque el embrión anestesiado en la gota de agarosa con la cantidad limitada de agua huevo y manipular el embrión en su posición con una herramienta de bucle del cabello (Figura 2). Cuando se utiliza un microscopio invertido, es importante que la región del embrión de interés es plana contra el fondo de vidrio del plato de imagen. Un microscopio vertical se puede utilizar en combinación con la inmersión en agua o los objetivos de larga distancia en seco y el embrión debe ser posicionado de tal manera que la región de interés es lo más cerca al objetivo como sea posible.
  3. Deje que la agarosa se solidifique y sumergir la caída de agarosa en agua huevo que contiene tricaína (ver 4.5). Si un microscopio vertical se usa, coloque un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la cavidad depresión (no permitir que las burbujas de aire para formar).
  4. Secuencialmente adquirir la gripeorescence y las imágenes de transmisión.
  5. Retirar con cuidado la agarosa del embrión con pinzas finas y colocar el embrión de nuevo en agua huevo si se requiere para experimentos posteriores.

9. Los resultados representativos

La inyección de Salmonella typhimurium o bacteria Mycobacterium marinum en la isla de la sangre de los embriones de 1 resultados DPF en la fagocitosis por los macrófagos rápida. El gen mpeg1 ha sido recientemente identificado como un marcador fiel de los macrófagos embrionarias, colocalizing con la bien establecida CSF1R macrófagos marcador (FMS) y no se superpongan con los marcadores de los neutrófilos como MPX (MPO) y Lyz 4, 14. Para imágenes en vivo de la fagocitosis de bacterias que utilizan las líneas de transgénicos en los que el promotor mpeg1 impulsa la expresión de proteínas fluorescentes en los macrófagos 14. Estas líneas transgénicas o bien tienen la f promotor mpeg1utilizarse directamente para el gen GFP, o emplear un sistema de dos componentes donde el promotor mpeg1 conduce la expresión del factor de transcripción de levadura Gal4 que activa un transgén segundos con la secuencia de reconocimiento Gal4 (UAS, aguas arriba activando secuencia) fusionado al gen Kaede. Cuando la inyección de sangre isla (protocolo 5; Figura 1) se realiza correctamente, la bacteria de inmediato fluirá a través de la circulación sanguínea y extenderse por todo el embrión. Difusión de la relativamente grande y brillante fluorescente Ds-RED etiqueta S. typhimurium bacterias pueden tomarse imágenes directamente con un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Figura 3), y la imagen confocal en la figura 2 muestra hpi que muchas bacterias son fagocitadas por los macrófagos fluorescentes (Figura 3B-C). La inyección de tan poco como 25 ufc de tipo salvaje de S. bacterias typhimurium se traducirá en una infección letal, mientras que una dosis similar de bacterias de un s avirulentotren, tales como Ra, puede ser limpiado por el sistema inmune 3 embrionario. Una dosis de inyección de 250 ufc fue utilizado para determinar las respuestas transcripcionales a S. la infección typhimurium en el embrión de pez cebra y demostró la inducción de una fuerte respuesta proinflamatoria la expresión génica 15. En contraste, la inyección intravenosa de M. marinum bacterias no provoca una fuerte respuesta proinflamatoria, sino que conduce a una infección persistente en los macrófagos infectados formar agregados estrechos que se consideran como las primeras etapas de granulomas, que son el sello distintivo de la tuberculosis 2. Imagen confocal de un total de granuloma-como en la Tg (MPEG1: EGFP) gl22 la línea 14 a las 5 dpi muestra el crecimiento intracelular de mCherry marcado M. marinum bacterias dentro de los macrófagos fluorescentes verdes (Figura 3D-E).

Antiguo Testamentosus vías de infección son útiles para diferentes propósitos. Las bacterias pueden ser inyectado en el ventrículo rombencéfalo a 32 HPF (Figura 1C), que es un compartimiento desprovisto de los macrófagos. La inyección de 20-100 mCherry marcado con M. bacterias marinum en este compartimiento conduce a la infiltración rápida por los macrófagos que fagocitan las bacterias (Figura 4A). Otro método para estudiar la migración dirigida de las células inmunes es la inyección de bacterias en el músculo cola (Figura 1D). Sin embargo, las inyecciones de cola musculares también pueden causar daño a los tejidos que por sí misma, provoca una cierta atracción de los leucocitos. Tal acción de la herida puede evitarse cuando cuidadosamente inyectando un volumen pequeño (0.5-1 nL) en la vesícula ótica (Figura 1E). Como se muestra aquí mediante el uso de la Tg (mpx: EGFP) i114 línea 16, la inyección de aproximadamente 20 ufc de S. typhimurium en la vesícula ótica conduce a la atracción de los neutrófilos a las 3 hpi ( (Figura 4). La notocorda, que parece ser resistentes a la infiltración de leucocitos, es un compartimento permisivo para el crecimiento de M. marinum mutantes que son fuertemente atenuado cuando se inyecta en otros tejidos; 7 (Figura 4F). Finalmente, la inyección inicial de M. marinum en la yema de embriones proporciona un método alternativo para lograr una infección sistémica. Por lo general, realizar estas inyecciones alrededor de la etapa de células 16 (Figura 1G), pero inyecciones bacterianas en la yema también se puede realizar en etapas posteriores (hasta la fase de célula 1000), o anterior (1 a 8 etapa celular) para la co-inyecciones con morfolinos 8. Después de yema de inyección de una dosis de 20-40 ufc, M. bacterias marinum repartidas en varios días en los tejidos embrionarios y forman agregados como granuloma-similares a los observados en la convencionalmétodo de inyección intravenosa 8; (Figura 4G). El método de inyección de yema no es adecuado para S. la infección typhimurium, porque su rápido crecimiento en la yema de huevo provoca letalidad temprana. El método de infección de yema de M. la infección marinum será útil para aplicaciones de alto rendimiento, ya que se puede automatizar mediante un robot de inyección 8.

Figura 1
Figura 1. Descripción de los métodos de inyección utilizados para el establecimiento de infecciones sistémicas o locales en los embriones de pez cebra. (AB) Las inyecciones intravenosas para el establecimiento de una infección sistémica rápida se llevan a cabo en la vena caudal en la isla de sangre posterior en un DPF (A) o en el conducto de Cuvier en el 2-3 fdd (B). (CE) inyecciones locales para el estudio de los macrófagos y la quimiotaxis de neutrófilos se llevan a cabo en el ventrículo posterior del cerebro en un DPF (C), El músculo de la cola a 1-2 fdd (D) o la vesícula ótica en el 2-3 fdd (E). (F) Las inyecciones para crear una infección aparentemente inaccesibles para los fagocitos se llevan a cabo en la notocorda en el 1-2 fdd. (G) Las inyecciones para crear una infección sistémica temprana con bacterias de crecimiento lento como M. marinum puede realizarse en la yema en la fase celular 16-1000. Todas las imágenes fueron tomadas con una Leica M165C, PLANAPO 1,0 x conectado a una cámara Leica DFC420 (Leica 10446307 0.8x).

Figura 2
Figura 2. Pelo herramienta bucle. Un pedazo de cabello humano se inserta como un bucle en la apertura de una pipeta Pasteur y se fija en su lugar con pegamento o con Tipp-Ex. Esto proporciona una herramienta adecuada para la manipulación de embriones con cuidado frágiles de pez cebra.

Figura 3
Figura 3. Las inyecciones intravenosas defluorescente de color rojo Salmonella typhimurium y Mycobacterium marinum. S. Ds-RED-etiquetados typhimurium SL1027 bacterias (AC) y mCherry marcado con M. marinum Mma20 bacterias (DE) fueron inyectados en sangre de la isla Tg (MPEG1: Gal4-VP16) GL24; Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t (AC) o Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) a 28 embriones de pez cebra HPF. (A) superposición estéreo-fluorescencia y campo claro-imagen que muestra la difusión de S. typhimurium en la circulación de la sangre a las 2 hpi (Leica microscopio Leica MZ16FA DFC420C cámara). (AC) confocal z-stack proyecciones que muestran de color rojo S. bacterias typhimurium fagocitado por los macrófagos verdes en 2 hpi (Leica TCS SPE, HCX objetivo APO 40x 0,8 NA). Las bacterias que son todavía extracelular también se puede observar. (D) confocal z-stack de proyección que muestra un total de granuloma-como la que contiene M. marinum Mma20-macrófagos infectados y no infectados a los 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0.8 NA). Los macrófagos en verde y en rojo las bacterias. (E) confocal z pila proyección de un individuo macrófagos (verde) con intracelular M. marinum bacterias (rojo). El área representada en D por el rectángulo blanco fue fotografiada con un objetivo de mayor aumento (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 m.

Figura 4
Figura 4. Las rutas alternativas para la infección de los embriones de pez cebra. (A) mCherry marcado con M. marinum Mma20 bacterias fueron inyectadas en el cerebro posterior del ventrículo a los 32 HPF. Fluorescencia y transmisión de la imagen superpuesta que muestra bacterias mCherry marcados fagocitado por los macrófagos a las 5 hpi (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA). (B) S. typhimurium se inyecta en el músculo de la cola a 1 fdd. Atracción de las células mieloides en el sitio de la inyección (círculo blanco) se muestra a las 3 hpi por fluorescent hibridación in situ 4, (C), mientras que en los embriones inyectados normalmente no hay células mieloides en este sitio morfológica. A pesar de que los embriones no contienen neutrófilos maduros en esta etapa, dos poblaciones de células mieloides pueden distinguirse, una expresión de la macrófagos marcador mfap4 (rojo) y una expresión del marcador de neutrófilos mpx (verde) (Leica TCS SPE, HC PL Fluotar 10.0x 0.3 NA). La fluorescencia de las bacterias se pierde después de la hibridación in situ en el procedimiento. (D) DS-RED-etiquetados S. typhimurium bacterias fueron inyectadas en la vesícula ótica de Tg (mpx: EGFP) i114 pez cebra a las 2 fdd. Superposición de imágenes en estéreo de fluorescencia y campo claro, muestran que mpx: EGFP células marcadas con los neutrófilos son atraídos a la vesícula ótica infectada (puntos elipse) a las 3 hpi, (E) mientras que la inyección de control de PBS en la vesícula ótica de Tg (mpx: EGFP ) i114 pez cebra no se muestra la atracción de los neutrófilos a la ótica ve infectadasiclo (puntos elipse) (Leica MZ16FA con la cámara Leica DFC420C). (F) mCherry marcado con M. bacterias marinum de la eccCb1 atenuada E11 :: tn cepa mutante 17 se inyectaron en la notocorda en un DPF. Proliferación de las armas dentro de la notocorda fue fotografiada en el 5 dpi (Leica DC500 con el microscopio de MZ16FA cámara). (G) mCherry marcado con M. marinum bacterias E11 fueron inyectados en la yema de los embriones de 16 células de pez cebra de la etapa de la Tg (fli1a: EGFP) de la línea que expresa GFP en las células endoteliales de los vasos sanguíneos y linfáticos. La formación de granulomas como agregados de células infectadas en la región de la cola se observa en el 5 dpi (microscopio Leica MZ16FA con la cámara Leica DFC420C; imagen 8).

Discussion

Los métodos de infección se describen en este artículo se utilizan con frecuencia para estudiar la función de los genes receptores de inmunidad innata o de los genes de virulencia bacteriana 1. Los micro-inyección por vía intravenosa métodos (protocolos 5 y 6.1) se utilizan con mayor frecuencia para este tipo de estudios. La vena caudal en la isla sangre posterior es el lugar más conveniente para la inyección intravenosa de 1-día-embriones. Como la vena caudal se vuelve más difícil de penetrar en las etapas posteriores, se prefiere que el conducto de Cuvier como sitio de la inyección intravenosa de embriones en 2-3 fdd. En todos los casos es crítico para inyectar a los embriones con números consistentes de las bacterias, los cuales deben ser controlados por los inóculos de siembra de la inyección para el conteo de ufc. Los siguientes aspectos deben ser considerados para lograr inyecciones reproducibles. En primer lugar, es esencial disponer de alta calidad agujas de vidrio microcapilares inyección. Si la punta de la aguja es demasiado grande, la inyección creará un agujero punción suficientemente grande para que se produzca sangrado ylas bacterias inyectadas fluirá hacia fuera de la circulación sanguínea. En segundo lugar, las bacterias debe ser inyectado directamente en la circulación sanguínea. Si la punta de la aguja no está dentro de la vena o si se propaga de inyección de fluidos en la extensión del saco vitelino, el embrión debe ser desechado en el experimento. En tercer lugar, usando PVP40 como un portador para inyectar M. marinum ayudará en la prevención de las bacterias que se hunda en la aguja de vidrio. PVP40 mejora la homogeneidad de la suspensión, lo que resulta en inóculos más reproducible a lo largo de la duración de las inyecciones. PVP40 también puede ser usada para S. inyecciones typhimurium, pero aquí es menos importante porque el tamaño más grande y brillante de fluorescencia de las bacterias permite un control visual sobre el inóculo de la inyección durante los experimentos. Para la práctica de las inyecciones se recomienda el uso de tinte rojo de fenol (1% v / v) o 1 m esferas fluorescentes disponibles en diferentes colores (Invitrogen). Una vez que la técnica se domina, se tarda aproximadamente 30 minutES para inyectar 50-100 embriones, incluyendo el tiempo requerido para alinear los embriones en placas de agarosa y ajustando el volumen de inyección bacteriana.

Mientras que las inyecciones por vía intravenosa en la isla de sangre (protocolo 5) o en el conducto de Cuvier (protocolo 6.1) son los más utilizados, las vías alternativas de infección se describen en este artículo de vídeo han demostrado ser útiles para estudiar los macrófagos y la quimiotaxis de neutrófilos (protocolos 6.2, 6.3 y 6.4), para estudiar el crecimiento de cepas bacterianas atenuadas (protocolo 6.5), y para adaptar el modelo de infección pez cebra para aplicaciones de alto rendimiento (protocolo 6.6) 4-8. Los descritos micro-inyección métodos también se pueden aplicar para las inyecciones de virus 18, 19, esporas de hongos 14, 20 o parásitos protozoarios (Maria Forlenza, comunicación personal). Una adición útil a los procedimientos de inyección descritas en este artículo de vídeo es un procedimiento descrito recientemente para la inyección subcutánea de bacterias en zebrembriones afish 21. Este procedimiento fue utilizado para estudiar la fagocitosis de las bacterias por los neutrófilos, los cuales fueron encontrados a las bacterias eficientemente engullen en las superficies del tejido pero, en contraste con los macrófagos, eran virtualmente incapaz de fagocitar bacterias después de la inyección en la sangre o en las cavidades corporales llenas de líquido. Para subcutáneos embriones inyecciones se colocan similar al de las inyecciones de cola musculares descritos en este artículo de vídeo, pero se inserta la aguja justo debajo de la piel para inyectar las bacterias sobre un somito.

Es importante considerar que la microinyección es esencialmente una vía artificial de la infección. Sin embargo, los primeros embriones son altamente resistentes a la exposición externa a los patógenos bacterianos. De hecho, los ensayos de inmersión, donde los embriones se bañan en una suspensión bacteriana, no se pueden reproducir en nuestras manos 22. Mientras que algunos embriones pueden infectarse tras la inmersión, se ha observado una gran variación en las tasas de mortalidad y en el expresoión de los genes marcadores inflamatorios entre embriones individuales en dichos ensayos. Los métodos de inyección de micro-descritos en este artículo conseguir infecciones reproducibles y son particularmente útiles para estudiar las interacciones bacterianas con las células inmunes del huésped innatas. Un enfoque eficaz para cuantificar la infección bacteriana en los embriones individuales es el de analizar las imágenes fluorescentes de embriones infectados con el encargo, el software dedicado cuantificación pixel 17, 23. Este enfoque se ha demostrado que se correlaciona bien con los resultados de los recuentos cfu después de placas de embriones infectados. Del mismo modo, los cambios relativos en el número de leucocitos por embrión han sido cuantificados por análisis digital de imágenes en las líneas transgénicas de leucocitos fluoróforo reportero, este enfoque sería aplicable a la cuantificación de la respuesta del huésped a la infección leukopoietic 24.

La función de los genes receptores inmunes innatas puede ser investigado eficazmente in vivo mediante la combinación de los modelos de infección descritoscon la caída morfolino. Morpholinos son oligonucleótidos sintéticos que se dirigen a los ARN antisentido específicos y reducir la expresión de los productos génicos cuando se inyectan en embriones de pez cebra 1-celulares etapa como se muestra en artículos de vídeo otros en esta revista 10, 25. En estudios desmontables morfolino, es de gran importancia que todos los grupos de embrión a comparar se realizaron correctamente antes de las inyecciones bacterianas. Esto es especialmente importante porque los embriones tienen un desarrollo del sistema inmune que hace cada vez más competente en el tiempo.

Hay varias líneas de reportero transgénicos actualmente disponibles para distinguir los principales subconjuntos de inmunidad innata, los macrófagos y los neutrófilos, en embriones de pez cebra. El MPX y promotores Lyz se han utilizado para generar líneas de neutrófilos reportero 16, 26, 27, y el CSF1R (FMS) y promotores mpeg1 se utilizaron para producir reporteros macrófagos 14, 28. Mientras CSF1R (FMS) es, además, se expresa en xantóforos, mpeg1 expresión es exclusivamente en los macrófagos. Como se muestra en este artículo de vídeo, las líneas se han desarrollado recientemente mpeg1 reporteros son muy útiles para la fagocitosis por los macrófagos de imagen bacteriana.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Cui Chao, Piso de Kort, Stoop Esther y Carvalho para las imágenes de Ralph en la Figura 4, Nehrdich Ulrike y Davy de Witt para el cuidado de los peces, y otros miembros del laboratorio útil para los debates. Este trabajo es apoyado por el Programa Smart Mix del Ministerio holandés de Asuntos Económicos y el Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia, la Comisión Europea séptimo proyecto marco ZF-SALUD (SALUD-F4-2010-242048), la Unión Europea Marie Curie- Red de Formación Inicial FishForPharma (PITN-GA-2011 a 289209), y por el NHMRC Australia (637.394). El australiano Instituto de Medicina Regenerativa con el apoyo de subvenciones del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

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Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

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