Summary
وقد ثبت أن الأجنة الزرد شفاف المضيفين نموذجا مفيدا لتصور ودراسة التفاعلات وظيفيا بين الخلايا المناعية الفطرية ومسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا، مثل
Abstract
ويتزايد استخدام الزرد (دانيو rerio) الأجنة كنموذج لدراسة وظيفة نظام المناعة الفطرية في الفقاريات المضيف الممرض التفاعلات 1. من أنواع الخلايا الرئيسية للنظام المناعة الفطرية، الضامة والعدلات، ووضع خلال الأيام الأولى من التطور الجنيني قبل نضوج الخلايا اللمفية التي مطلوبة من أجل الاستجابات التكيفية المناعي. سهولة الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة، وسهولة الحصول عليها بسبب التنمية الخارجية، والشفافية البصرية من المراحل الجنينية واليرقات، مجموعة واسعة من الأدوات الجينية، والموارد متحولة واسعة ومجموعة من خطوط مراسل المعدلة وراثيا، إضافة إلى براعة كل من الزرد نموذج. يمكن السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية (س. التيفية الفأرية) وmarinum المتفطرة intracellularly يقيمون في الضامة وكثيرا ما تستخدم لدراسة المضيف الممرض التفاعلات في الأجنة الزرد. عمليات العدوى من هذينمسببات الأمراض البكتيرية مقارنة مثيرة للاهتمام لأنه س. عدوى التيفية الفأرية حادة وقاتلة في غضون يوم واحد، في حين م. marinum عدوى مزمنة، ويمكن تصوير ما يصل الى مرحلة اليرقات 2، 3. موقع الدقيقة حقن البكتيريا في جنين (الشكل 1) يحدد ما إذا كانت العدوى سوف تصبح بسرعة النظامية أو سيبقى في البداية مترجمة. يمكن تأسيس عدوى السريع الأجهزة عن طريق حقن البكتيريا الدقيقة مباشرة في الدورة الدموية عن طريق الوريد الذيلية في جزيرة دم الخلفي أو عن طريق القناة كوفييه، قناة تداول واسع على الكيس المحي الذي يربط بين القلب إلى الأوعية الدموية في الجذع. في 1 DPF، عندما الأجنة في هذه المرحلة لديها الضامة نشط phagocytically لكن العدلات لم تنضج بعد، عن طريق الحقن في الدم ويفضل جزيرة. لحقن في DPF 2-3، عندما الأجنة أيضا قد وضعت وظيفية (الميلوبيروكسيديز المنتجة) العدلات، ويفضل القناة كوفييه كما تيانه موقع الحقن. لدراسة الهجرة الموجهة للخلايا الدم النخاعي نحو العدوى المحلية، ويمكن حقن البكتيريا في عضلة الذيل، وحويصلة أذني، أو الدماغ المؤخر البطين 4-6. وبالإضافة إلى ذلك، والحبل الظهري، وهو الهيكل الذي يبدو أنه لا يمكن الوصول إليها عادة لخلايا الدم النخاعي، هي عرضة للعدوى المحلية 7. وثمة بديل مفيد للالإنتاجية العالية لتقديم الطلبات هو حقن البكتيريا في صفار البيض من الأجنة في غضون الساعات الأولى بعد الإخصاب 8. الجمع بين البكتيريا الفلورسنت وخطوط الزرد المعدلة وراثيا مع الضامة فلوري أو العدلات يخلق الظروف المثالية لمتعددة الألوان التصوير من المضيف الممرض التفاعلات. هذه المادة سوف فيديو وصف بروتوكولات تفصيلية للعدوى عن طريق الوريد والمحلية من الأجنة الزرد مع س. التيفية الفأرية أو م. بكتيريا marinum و. التصوير مضان اللاحقة للتفاعل مع خلايا الجهاز المناعي الفطرية
Protocol
1. إعداد إبر حقن
- إعداد البورسليكات الزجاج حقن الإبر microcapillary (هارفارد جهاز، 300038، 1 مم OD × 0،78 ملم معرف) باستخدام جهاز مجتذب micropipette (سوتر الآلات شركة، ويلهب / P-97 براون مع الإعدادات التالية لفترة أطول تلميح: الضغط الجوي 400؛ حرارة 610؛ سحب 40؛ سرعة 50؛ الساعة 30 و بالإعدادات التالية لأقصر تلميح: الضغط الجوي 500؛ حرارة 510؛ سحب 100؛ سرعة 200؛ الساعة 60).
- قطع رأس إبرة مع ملاقط غرامة للحصول على قطر افتتاح قمة ميكرومتر 5-10. فإنه من المستحسن أن شطبة افتتاح قمة إبرة في زاوية 45 درجة مع microgrinder (Narishige شركة، EG-400) لانتاج أكثر وضوحا طرف. وسوف يسهل هذا ثقب طبقة البشرة ويؤدي بالتالي في حقن أكثر استنساخه مع ضرر أقل من الأنسجة مع الإبر غير حادة. ويفضل الإبر يعد يميل لالوريد الذيلية (الخطوة 5) والقناة كوفييه (الخطوة 6.1) الحقن والإبر أقصر الرؤوسويفضل لحقن بروتوكولات أخرى (خطوات 6،2-6،6).
2. إعداد S. التيفية الفأرية اللقاح
- لوحة من أصل س. التيفية الفأرية من مخزون -80 ° C الجلسرين على لوحات أجار رطل (مع المضادات الحيوية المناسبة لاختيار لناقلات التعبير مضان)، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- اختيار الفرد المستعمرات إيجابي fluorescently وresuspend لهم تركيز المطلوب (انظر بروتوكولات 5 و 6) في المياه المالحة الفوسفات مخزنة معقم (PBS)، التي تحتوي على اختياريا 0.085٪ (V / V) الفينول الحمراء (سيغما الدريخ) للمساعدة على تصور لل حقن عملية. استخدام مباشرة تعليق جديد لحقن أو إعداد مخزونات الجلسرين. لإعداد مخزون الجلسرين، وتدور باستمرار على الأوراق المالية حقن الطازجة مع التركيز المطلوب من البكتيريا والتركيز على الأسهم من قبل resuspending لبيليه في حجم النصف ابتداء من عام عقيمة الجلسرين (V / V) 20٪ (سيغما الدريخ) في برنامج تلفزيوني. تخزين الأوراق المالية الجلسرين في -80 درجة مئوية. يخفف من الجلسرين 1:01 الأوراق المالية (V / V) قبل الحقن في برنامج تلفزيوني العقيمة، التي تحتوي على اختياريا أحمر الفينول 0.17٪.
- دوامة تعليق الجرثومي بشكل جيد لتجنب تراكمها.
- تحميل اللقاح في إبرة microcapillary باستخدام طرف microloader (إيبندورف، 5242956.003).
- بسبب الحجم الكبير نسبيا من س. بكتيريا التيفية الفأرية وعلى مشرق مضان DS-RED عند استخدام ناقلات التعبير pGMDs3 3 (السلالة متوفرة عند الطلب)، ويمكن بسهولة الخلايا البكتيرية الفردية تحسب مع stereomicroscope مضان من أجل ضبط جرعة حقن. تحقيقا لهذه الغاية، حقن 1 NL إلى قطرة من برنامج تلفزيوني على صفيحة أجار، عد البكتيريا فلوري، وحساب حجم الحقن ما هو مطلوب للحصول على جرعة المرجوة البكتيرية (ويفضل ابقاء حجم الحقن بين NL 1-2). حقن الأجنة مع س. التيفية الفأرية عبر الطريق المحدد (انظر بروتوكولات 5 و 6).
3. إعداد 4. إعداد الأجنة الزرد لحقن 5. حقن في الوريد من البكتيريا في يوم واحد الأجنة القديمة 6. طرق بديلة من العدوى 7. ستيريو التصوير من العدوى 8. مبائر التصوير من العدوى 9. ممثل النتائج حقن من السالمونيلا التيفية الفأرية أو بكتيريا المتفطرة البحرية في جزيرة دم الأجنة في النتائج DPF 1 في البلعمة السريع بواسطة الضامة. وقد تم مؤخرا في الجينات التي تم تحديدها MPEG1 كعلامة المؤمنين من الضامة الجنينية، colocalizing مع csf1r راسخة علامة البلاعم (FMS) وعدم التداخل مع علامات العدلة مثل MPX (MPO) وlyz 4 و 14. للتصوير حي لالبلعمة البكتيرية استخدمنا خطوط المعدلة وراثيا في المروج التي MPEG1 يدفع فلوري بروتين تعبير في الضامة 14. هذه الخطوط المعدلة وراثيا لديها إما و مروج MPEG1استخدامها مباشرة لهذا الجين GFP، أو استخدام نظام يتألف من عنصر حيث المروج MPEG1 يقود التعبير عن عامل النسخ خميرة Gal4 أن ينشط التحوير الثاني مع تسلسل اعتراف Gal4 (UAS، وتفعيل المنبع تسلسل) منصهر إلى الجين Kaede الذي. عندما حقن جزيرة الدم (بروتوكول 5؛ الشكل 1A) يتم تنفيذها بشكل صحيح، فإن البكتيريا بالتدفق على الفور من خلال الدورة الدموية وينتشر في جميع أنحاء جنين. نشر S. DS-RED فلوري كبيرة نسبيا والزاهية المسمى ولا يمكن تصوير البكتيريا التيفية الفأرية مباشرة مع مجهر مضان ستيريو (الشكل 3A)، والتصوير مبائر في المعارض HPI 2 أن يتم phagocytosed العديد من أنواع البكتيريا بواسطة البلاعم فلوري (الشكل 3B-C). ضخ ما لا يزيد عن 25 وت س. النوع البري والبكتيريا التيفية الفأرية يؤدي الى عدوى قاتلة، في حين أن جرعة مماثلة من البكتيريا من ليالي عديم الفوعةيمكن أن يتم مسح القطار، مثل رع، من قبل النظام المناعي 3 الجنينية. تم استخدام حقن جرعة من 250 وت م لتحديد استجابات النسخي إلى س. أظهرت عدوى التيفية الفأرية في الجنين الزرد وتحريض قوية موالية للالتهابات الجينات استجابة التعبير 15. في المقابل، فإن الحقن في الوريد من م. marinum البكتيريا لا يستحضر القوية المؤيدة للالتهابات وردا على ذلك، بل يؤدي إلى التهاب مستمر حيث الضامة المصابة تشكيل المجاميع الضيقة التي تعتبر في المراحل الأولى من حبيبية، والتي هي السمة المميزة لمرض السل 2. مبائر التصوير من مجموع هذه الحبيبي، وكأنه في تيراغرام (MPEG1: EGFP) gl22 السطر 14 في 5 نقطة في البوصة ويبين نمو الخلايا من mCherry المسمى م. بكتيريا marinum داخل الضامة في الفلورية الخضراء (الشكل 3D-E). بعد التمديدطرق العدوى لها هي مفيدة لأغراض مختلفة. ويمكن حقن البكتيريا إلى البطين الدماغ المؤخر في 32 HPF (الشكل 1C)، وهي مقصورة خالية من الضامة. حقن من 20-100 mCherry المسمى م. بكتيريا marinum في هذه المقصورة يؤدي إلى تسلل السريع من قبل الضامة أن يبلعم البكتيريا الشكل (4A). طريقة أخرى لدراسة الهجرة الموجهة من خلايا المناعة الفطرية هي حقن البكتيريا في عضلة الذيل (1D الشكل). ومع ذلك، والحقن العضلي ذيل أيضا أن يسبب تلف الأنسجة الذي في حد ذاته يثير بعض جاذبية من الكريات البيض. ويمكن تجنب مثل هذه الاستجابة اصابة عندما حقن بعناية حجم صغير (0.5-1 NL) في الحويصلة الأذنية (الشكل 1E). كما هو موضح هنا باستخدام تيراغرام (MPX: EGFP) i114 خط 16، ضخ حوالي 20 وت س. التيفية الفأرية في الحويصلة الأذنية يؤدي إلى جذب العدلات في 3 HPI ( 
الشكل 1. وتجرى عمليات الحقن في الوريد محة عامة عن طرق الحقن المستخدمة لإنشاء الالتهابات الجهازية أو المحلية في الأجنة الزرد. (AB) لإقامة عدوى السريعة الشاملة في الوريد الذيلية في جزيرة دم الخلفي في 1 DPF (A) أو في القناة كوفييه في 2-3 DPF (B). (CE) يتم تنفيذ الحقن محلي لدراسة البلاعم والعدلات الكيميائي إلى البطين الدماغ المؤخر في 1 DPF (C)، والعضلات في ذيل 1-2 DPF (D) أو حويصلة في أذني 2-3 DPF (E). (F) يتم تنفيذ الحقن لخلق وجود عدوى لا يمكن الوصول إليها على ما يبدو لالبالعات في الحبل الظهري في 1-2 DPF. (G) حقن لخلق وجود عدوى في وقت مبكر النظامية مع بطء نمو البكتيريا مثل م. لا يمكن أن يؤديها marinum في صفار البيض في مرحلة الخلية 16-1000. وقد اتخذت جميع الصور مع M165C لايكا، PLANAPO 1.0X متصلة كاميرا لايكا DFC420 (لايكا 10446307 0.8x). 
الشكل 2. حلقة الشعر أداة. يتم إدخال قطعة من الشعر البشري باعتباره حلقة في افتتاح ماصة باستير وثابتة في مكانها مع الصمغ السوبر أو مع تيب السابقين. هذا يوفر أداة مناسبة لمعالجة بلطف الأجنة الزرد الهشة. 
الشكل 3. حقن في الوريدأحمر فلوري التيفية الفأرية السالمونيلا والمتفطرة البحرية. S. DS-RED-المسمى التيفية الفأرية SL1027 بكتيريا (AC) وmCherry المسمى م. تم حقن marinum Mma20 بكتيريا (DE) في جزيرة دم TG (MPEG1: Gal4-VP16) gl24؛ تيراغرام (UAS-E1b: Kaede الذي) s1999t (AC) أو تيراغرام (MPEG1: EGFP) الأجنة gl22 الزرد (DE) في 28 HPF. (أ) صورة التراكب ستيريو ومضان ومشرق في الميدان تظهر نشر س. التيفية الفأرية في الدورة الدموية في HPI 2 (لايكا MZ16FA مجهر لايكا مع DFC420C الكاميرا). (قبل الميلاد) متحد البؤر Z-كومة التوقعات تظهر أحمر س. بكتيريا التيفية الفأرية phagocytosed بواسطة الضامة الخضراء في HPI 2 (لايكا TCS SPE، HCX APO هدف 40X 0.8 NA). ويمكن أيضا أن البكتيريا التي لا تزال خارج الخلية يتعين مراعاتها. (D) متحد البؤر Z-كومة إسقاط يظهر مجموع الحبيبي مثل التي تحتوي على م. الضامة marinum Mma20 المصابة وغير المصابة في 5 نقطة في البوصة (لايكا TCS SPE، HCX APO 40X0.8 NA). الضامة في الخضراء والبكتيريا باللون الأحمر. (E) متحد البؤر Z-كومة الإسقاط من البلاعم الفردية (الأخضر) مع م. بين الخلايا بكتيريا marinum (الحمراء). تم تصوير منطقة صورت في D من المستطيل الأبيض مع هدف تضخم أعلى (لايكا TCS SPE، HCX PL APO 63x 1.2 NA). Scalebars: 20 ميكرون. 
الشكل 4. طرق بديلة للإصابة الأجنة الزرد. (A) mCherry المسمى م. تم حقن marinum Mma20 البكتيريا إلى البطين الدماغ المؤخر في 32 HPF. مضان ونقل صورة التراكب تظهر البكتيريا mCherry المسمى phagocytosed بواسطة الضامة في 5 HPI (لايكا TCS SPE، HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA). (B) س. تم حقن التيفية الفأرية في عضلة الذيل في 1 DPF. ويظهر جاذبية للخلايا الدم النخاعي في موقع الحقن (أبيض دائرة) في 3 و بواسطة HPIluorescent في التهجين في الموقع 4، (C) في حين أنه في الأجنة uninjected هناك عادة أي خلايا الدم النخاعي في هذا الموقع الصرفي. على الرغم من أن الأجنة لا تحتوي على العدلات الناضجة في هذه المرحلة، يمكن التمييز بين السكان من خلايا الدم النخاعي، واحد يعبر عن علامة بلعم mfap4 (الحمراء) واحد يعبر عن علامة العدلة MPX (الأخضر) (لايكا TCS SPE، HC PL FLUOTAR 10.0x 0.3 NA). ضاع مضان من البكتيريا بعد في إجراء التهجين في الموقع. (D) DS-RED-المسمى S. تم حقن البكتيريا التيفية الفأرية في الحويصلة الأذنية من تيراغرام (MPX: EGFP) i114 الزرد في 2 DPF. تراكب الصور ستيريو ومضان ومشرق في الميدان تبين أن MPX: تنجذب EGFP المسمى العدلات الخلايا لحويصلة في أذني المصابة (القطع الناقص منقط) في 3 HPI، (E)، في حين حقن السيطرة على برنامج تلفزيوني في الحويصلة الأذنية من تيراغرام (MPX: EGFP ) i114 الزرد لا تظهر جذب العدلات إلى اشتركوا في أذني غير مصابsicle (القطع الناقص منقط) (لايكا MZ16FA مع كاميرا لايكا DFC420C). (F) mCherry المسمى م. تم حقن البكتيريا marinum من eccCb1 E11 الموهن :: تينيسي سلالة متحولة 17 في الحبل الظهري في 1 DPF. تم تصوير الانتشار داخل الحبل الظهري في 5 نقطة في البوصة (لايكا MZ16FA المجهر مع DC500 الكاميرا). (G) mCherry المسمى م. تم حقن marinum البكتيريا E11 في صفار البيض من 16 خلية الأجنة الزرد مرحلة من مراحل (fli1a: EGFP) تيراغرام الخط الذي يعبر عن GFP في الخلايا البطانية من الدم والأوعية اللمفاوية. وقد لوحظ تشكيل الحبيبي، مثل تجمعات من الخلايا المصابة في منطقة الذيل في 5 نقطة في البوصة (مجهر MZ16FA لايكا مع كاميرا لايكا DFC420C؛ صورة من 8).
Discussion
وكثيرا ما تستخدم أساليب العدوى المذكورة في هذه المقالة لدراسة وظيفة الجينات المضيف المناعة الفطرية أو الجينات الفوعة الجرثومية 1. وتستخدم عن طريق الحقن الدقيقة حقن أساليب (بروتوكولات 5 و 6.1) في أغلب الأحيان لمثل هذه الدراسات. على المنوال الذيلية في جزيرة دم الخلفي هو الموقع الأكثر ملاءمة للحقن في الوريد من 1 يوما الأجنة. كما الوريد الذيلية يصبح أكثر صعوبة في اختراق في مراحل لاحقة، ونحن نفضل القناة كوفييه وموقع الحقن في الوريد للأجنة في 2-3 DPF. في جميع الحالات فإن من الأهمية بمكان لحقن الأجنة مع أرقام متناسقة من البكتيريا، التي يجب أن يتم التحقق من قبل قائح حقن تصفيح لفرز وت. ويجب النظر في الجوانب التالية لتحقيق حقن استنساخه. أولا، من الضروري أن يكون عالي الجودة من الزجاج حقن الإبر microcapillary. إذا كان رأس إبرة كبيرة جدا، فإن حقن خلق ثقب ثقب كبيرة بما يكفي لحدوث نزيف وفإن البكتيريا حقن تتدفق من الدورة الدموية. ثانيا، لا بد من حقن البكتيريا مباشرة في الدورة الدموية. إذا كان رأس إبرة ليس داخل الوريد أو في حال انتشار السوائل الحقن في تمديد الكيس المحي، لا بد من التخلص من الجنين من هذه التجربة. ثالثا، وذلك باستخدام PVP40 باعتبارها الناقل لحقن م. وسوف marinum مساعدة في منع البكتيريا من الغرق في إبرة الزجاج. PVP40 يحسن تجانس التعليق، مما أدى إلى قائح أكثر استنساخه طوال مدة الحقن. ويمكن أيضا أن تستخدم لPVP40 س. حقن التيفية الفأرية، ولكن هنا هو أقل أهمية، لأن حجم أكبر ومضان مشرق من البكتيريا يسمح للمراقبة البصرية على حقن اللقاح خلال التجارب. لممارسة حقنا من المستحسن استخدام صبغ أحمر الفينول (1٪ V / V) أو 1 ميكرومتر فلوري المجالات المتاحة في مختلف الألوان (إينفيتروجن). بمجرد يتقن هذه التقنية، فإنه يأخذ ما يقرب من 30 minutوفاق لحقن 50-100 الأجنة، بما في ذلك الوقت اللازم لمواءمة الأجنة على لوحات الاغاروز وضبط حجم حقن البكتيريا.
في حين هي الأكثر شيوعا الحقن في الوريد في جزيرة الدم (بروتوكول 5) أو في قناة كوفييه (بروتوكول 6.1)، أثبتت طرق بديلة للعدوى الموضحة في هذه المقالة الفيديو مفيدة لدراسة البلاعم والعدلات الكيميائي (بروتوكولات 6.2، 6.3 ، و 6.4)، لدراسة نمو سلالات بكتيرية الموهن (بروتوكول 6.5)، وتكييف نموذج للعدوى الزرد عالية الإنتاجية التطبيقات (بروتوكول 6.6) 4-8. ويمكن أيضا وصف الدقيقة حقن أساليب تطبيقها لحقن من الفيروسات 18 و 19 و الجراثيم الفطرية 14، 20 أو طفيليات الأوالي (ماريا Forlenza، اتصال شخصي). إضافة مفيدة لإجراءات الحقن الموصوفة في هذه المقالة الفيديو هو إجراء وصف مؤخرا للحقن تحت الجلد من البكتيريا في zebrالأجنة عفيش 21. تم تطبيق هذا الإجراء لدراسة البلعمة من قبل العدلات من البكتيريا، التي عثر على بكتيريا تبتلع بكفاءة على أسطح الأنسجة ولكن، على النقيض من الضامة، وكانت عمليا غير قادر على يبلعم البكتيريا على الحقن في الدم أو في تجاويف الجسم مملوءة بسائل. للأجنة حقن تحت الجلد يتم وضع مماثل بالنسبة للحقن عضلة ذيل الموضحة في هذه المقالة الفيديو، ولكن تم إدخال إبرة تحت الجلد لحقن البكتيريا أكثر من الجسيدة.
من المهم أن نعتبر أن حقن الجزئي هو في جوهره طريقا الاصطناعي للعدوى. ومع ذلك، الأجنة في وقت مبكر من مقاومة عالية للتعرض الخارجي لمسببات الأمراض البكتيرية. في الواقع، المقايسات الغمر، حيث استحم الأجنة في تعليق البكتيرية، لا يمكن استنساخه في أيدينا 22. في حين أن بعض الأجنة يمكن أن يصاب على الغمر، وقد لاحظنا تفاوت كبير في معدلات وفيات و في التعبير عنايون من الجينات علامة التهابات بين الأجنة فرد في هذه المقايسات. طرق حقن الصغيرة الموضحة في هذه المقالة تحقيق التهابات متكررة ومفيدة بشكل خاص لدراسة التفاعلات البكتيرية مع الخلايا المضيفة المناعة الفطرية. وهو نهج فعال لتحديد العدوى البكتيرية في الأجنة الفردية هو تحليل الصور فلوري من الأجنة المصابة مع حسب الطلب، مخصصة بكسل البرامج الكمي 17 و 23. وقد تبين أن هذا النهج أنها تتطابق جيدا مع نتائج عمليات العد وت بعد طلي من الأجنة المصابة. وبالمثل، تم كميا التغيرات النسبية في أعداد الكريات البيض في الجنين بواسطة تحليل الصور الرقمية المعدلة وراثيا في خطوط الكريات البيض مراسل fluorophore، وهذا النهج من شأنه أن تكون قابلة للتطبيق لقياس استجابة المضيف leukopoietic إلى إصابة 24.
يمكن أن يتم التحقيق في وظيفة الجينات المضيف المناعة الفطرية بكفاءة في الجسم الحي من خلال الجمع بين نماذج عدوى صفهامع morpholino ضربة قاضية. [أليغنوكليوتيد] Morpholinos هي العقاقير الاصطناعية التي تستهدف RNAs ومحددة والحد من التعبير عن منتجات الجين عند حقنه في 1-خلية الأجنة الزرد مرحلة كما هو مبين في المادتين الفيديو وغيرها في هذه المجلة 10، 25. في دراسات ضربة قاضية morpholino، فإنه من الأهمية بمكان أن يتم عرض هذه الحفلات لجميع الفئات الجنين يمكن مقارنتها بشكل صحيح قبل حقن البكتيريا. هذا مهم بشكل خاص لأن الأجنة النامية لديها نظام المناعة الذي يصبح المختصة على نحو متزايد مع مرور الوقت.
هناك العديد من خطوط مراسل المعدلة وراثيا المتوفرة حاليا للتمييز بين مجموعات فرعية رئيسية المناعة الفطرية، الضامة والعدلات، في الأجنة الزرد. استخدمت MPX والمروجين lyz لتوليد خطوط مراسل العدلة 16، 26، 27، واستخدمت csf1r (FMS) والمروجين MPEG1 لانتاج صحفيين بلعم 14، 28. في حين CSFوأعرب بالإضافة إلى ذلك 1R (FMS) في xanthophores، MPEG1 التعبير هي حصرا في الضامة. كما هو موضح في هذا المقال الفيديو، وضعت مؤخرا خطوط مراسل MPEG1 مفيدة للغاية لالبلعمة التصوير البكتيرية بواسطة الضامة.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر تشاو تسوى، الطابق دي كورت، ستوب استير وكارفاليو رالف لصور في الشكل 4، Nehrdich أولريك وديفي دي ويت لرعاية الأسماك، وغيرها من أعضاء مختبر لاجراء مناقشات مفيدة. ويدعم هذا العمل الذي يقوم به برنامج ميكس الذكية من وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية ووزارة التعليم والثقافة والعلوم، والمفوضية الأوروبية مشروع الإطار 7 ZF-الصحية (الصحة-F4-2010-242048) والاتحاد الأوروبي وماري كوري، التدريب الأولي شبكة FishForPharma (PITN-GA-2011-289209)، والتي NHMRC استرالي (637394). يتم اعتماد الأسترالي التجديدي معهد الطب من المنح المقدمة من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 228210 | |
| Difco Middlebrook 7H10 agar | BD Biosciences | 262710 | |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | BD Biosciences | 211886 | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| BBL Middlebrook ADC Enrichment | BD Biosciences | 211887 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Calbiochem | 529504 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) | Lonza Inc. | 50100 | |
| FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) | Invitrogen | F8821 | |
| FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) | Invitrogen | F8823 |
References
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
- Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
- vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
- Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
- Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
- Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
- Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
- van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
- Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
- Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
- van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
- Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
- Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
- Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
- Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).
