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Immunology and Infection

L'infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Embrioni di zebrafish trasparente si sono dimostrati padroni di casa modello utile per la visualizzazione e lo studio delle interazioni funzionali tra cellule immunitarie innate e batteri patogeni intracellulari, come ad esempio

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embrioni sono sempre più utilizzati come modello per studiare la funzione del sistema immunitario innato dei vertebrati in interazioni ospite-patogeno 1. I principali tipi di cellule del sistema immunitario, macrofagi e dei neutrofili, sviluppano durante i primi giorni di embriogenesi prima della maturazione dei linfociti che sono necessari per le risposte immunitarie adattative. La facilità di ottenere un gran numero di embrioni, la loro accessibilità a causa dello sviluppo esterno, la trasparenza ottica degli stadi embrionali e larvale, una vasta gamma di strumenti genetici, le vaste risorse mutanti e collezioni di linee giornalista transgenici, tutti a creare la versatilità del pesce zebra modello. Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (S. typhimurium) e Mycobacterium marinum possono risiedere intracellulare nei macrofagi e sono spesso utilizzati per studiare le interazioni ospite-patogeno in embrioni di zebrafish. I processi di infezione di questi duepatogeni batterici sono interessanti per confrontare, perché S. typhimurium infezione è acuta e letale entro un giorno, mentre M. marinum infezione è cronica e può essere ripreso fino allo stadio larvale 2, 3. Il sito di micro-iniezione di batteri nell'embrione (figura 1) determina se l'infezione diventerà rapidamente sistemico o inizialmente rimane localizzata. Una infezione sistemica rapido può essere stabilita da micro-iniezione batteri direttamente nella circolazione sanguigna attraverso la vena caudale all'isola sangue posteriore o attraverso il condotto di Cuvier, un canale di circolazione ampia sul sacco vitellino collega il cuore alla vascolarizzazione tronco. A 1 dpf, quando gli embrioni a questo stadio sono attivi i macrofagi phagocytically neutrofili, ma non hanno ancora maturato, iniettando nel sangue, l'isola è preferito. Per le iniezioni a 2-3 dpf, anche quando gli embrioni hanno sviluppato funzionali (mieloperossidasi che produce) neutrofili, il dotto di Cuvier è preferito come tche al sito di iniezione. Per studiare la migrazione diretta di cellule mieloidi verso infezioni locali, i batteri possono essere iniettato nel muscolo coda, vescicola otica, o rombencefalo ventricolo 4-6. Inoltre, la notocorda, una struttura che sembra essere normalmente inaccessibile alle cellule mieloidi, è altamente suscettibile di infezione locale 7. Un'alternativa utile per applicazioni ad elevato throughput è l'iniezione di batteri nel tuorlo di embrioni entro le prime ore dopo la fecondazione 8. La combinazione di batteri fluorescenti e le linee di zebrafish transgenico con macrofagi fluorescenti o neutrofili crea le circostanze ideali per il multi-color imaging di interazioni ospite-patogeno. Questo articolo video descrivere i protocolli dettagliati per l'infezione per via endovenosa e locale di embrioni di zebrafish con S. typhimurium o M. marinum batteri e per la successiva immagine di fluorescenza della interazione con le cellule del sistema immunitario.

Protocol

1. Preparare aghi da iniezione

  1. Preparare borosilicato aghi da iniezione microcapillari di vetro (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm di diametro x 0,78 mm ID) utilizzando un dispositivo estrattore micropipetta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown p-97 con le seguenti impostazioni per una punta lunga: pressione atmosferica 400; di calore 610; trazione 40; velocità di 50, di tempo di 30 e con le seguenti impostazioni per una punta più corta: la pressione dell'aria 500; calore 510; trazione 100, velocità 200, tempo 60).
  2. Rompere la punta dell'ago con una pinzetta fini di ottenere un diametro di apertura punta di 5-10 micron. Si consiglia di smussare la punta dell'ago di apertura ad un angolo di 45 gradi con un microgrinder (Narishige Inc., EG-400) per ottenere una punta tagliente. Ciò faciliterà la puntura dello strato epidermico e quindi portare a più iniezioni riproducibili con danni ai tessuti meno che con gli aghi smussati. Aghi più punte sono da preferire per vena caudale (passo 5) e del dotto di Cuvier (step 6.1) iniezioni e più brevi aghi con puntasono preferiti per i protocolli di iniezione altri passaggi 6.2-6.6).

2. Preparare S. typhimurium inoculo

  1. Piastra in S. typhimurium da un archivio di -80 ° C glicerolo su piastre di LB agar (con antibiotici appropriati per selezionare vettori di espressione per fluorescenza) e incubare durante la notte a 37 ° C.
  2. Molto singole colonie positive fluorescenza e risospendere li alla concentrazione desiderata (vedere protocolli 5 e 6) in sterile tampone fosfato salino (PBS), opzionalmente contenente 0,085% (v / v) rosso fenolo (Sigma-Aldrich) per facilitare la visualizzazione dei processo di iniezione. Utilizzare direttamente la sospensione fresca per l'iniezione o preparare scorte di glicerolo. Per preparare stock di glicerolo, centrifugare la fotografia di iniezione appena fatto con la concentrazione desiderata di batteri e concentrare il magazzino risospendendo il pellet in metà del volume iniziale in sterile 20% (v / v) glicerolo (Sigma-Aldrich) in PBS. Conservare lo stock di glicerolo a -80 ° C. Diluire il glicerolo archivio di 1:1 (v / v) prima dell'iniezione in PBS sterile, eventualmente contenente 0,17% rosso fenolo.
  3. Vortex la sospensione batterica bene per evitare grumi.
  4. Caricare il inoculo l'ago microcapillare con una punta microloader (Eppendorf, 5.242.956,003).
  5. A causa delle dimensioni relativamente grandi di S. typhimurium batteri e le loro brillanti Ds-fluorescenza rossa quando si utilizza il vettore di espressione pGMDs3 3 (ceppo disponibile su richiesta), le singole cellule batteriche possono essere facilmente contato con uno stereomicroscopio a fluorescenza, al fine di impostare la dose di iniezione. A tal fine, iniettare 1 nL in una goccia di PBS su una piastra di agar, contare i batteri fluorescenti, e calcolare il volume di iniezione che è necessaria per ottenere la dose desiderata batterica (preferibilmente mantenere il volume di iniezione tra 1-2 nL). Iniettare gli embrioni con S. typhimurium attraverso il percorso selezionato (vedi protocolli 5 e 6).

3. Preparare

  1. Tenere il M. marinum tensione cresce su agar Difco Middlebrook 7H10 (BD e compagnia) supplementato con 10% di acido oleico-albumina-destrosio-catalasi (OADC, BD e compagnia), 0,5% glicerolo, e con antibiotici appropriati per selezionare per vettori di espressione fluorescenza (ceppi disponibili su richiesta 9), quindi c'è sempre un nuovo ceppo.
  2. Scegli una colonia di M. marinum e risospendere in Difco Middlebrook 7H9 (BD e compagnia) supplementato con 10% albumina-destrosio-catalasi (ADC, BD e società) e 0,05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) e gli antibiotici adatti. Verificare che la densità ottica (OD) a 600 nm è di 0,2 - 0,3 e lasciarlo crescere in modo statico per una notte a 28,5 ° C. Il tempo di generazione di M. marinum è di circa 4-6 ore, varia a seconda del ceppo.
  3. Misurare la DO a 600 nm nuovamente il giorno di iniezioni. Un OD600 di 1 corrisponde a circa 10 8 M. marinum / mL(Questo può variare a seconda del ceppo batterico usato e pertanto dovrebbe essere basata su una curva di crescita del ceppo particolare).
  4. Raccogliere i batteri quando sono in fase logaritmica (non lasciare che il OD600 superare 1,00) mediante centrifugazione e lavaggio tre volte in PBS sterile.
  5. Misurare la OD600 nuovamente della sospensione batterica in PBS, centrifugare, e risospendere le batteri alla concentrazione desiderata (vedere protocolli 5 e 6) in PBS o in 2% Polivinilpirrolidone (PVP40) in PBS (w / v), che migliora l'omogeneità della sospensione batterica. Rosso fenolo (Sigma-Aldrich) può essere aggiunto ad una concentrazione di 0,085% per facilitare la visualizzazione del processo di iniezione. Utilizzare direttamente la sospensione fresca per l'iniezione o preparare scorte di glicerolo. Per preparare stock di glicerolo centrifugare la fotografia di iniezione appena fatto con la concentrazione desiderata di batteri e concentrare il magazzino risospendendo il pellet in metà del volume iniziale in sterile glicerolo 20% in PBS. Conservare il glycErol magazzino a -80 ° C. Diluire il glicerolo archivio di 1:1 (v / v) in PBS sterile, eventualmente contenente 4% PVP40 e / o 0,17% rosso fenolo.

4. Preparare embrioni di zebrafish per preparazioni iniettabili

  1. Impostare coppie nidificanti zebrafish e raccogliere gli embrioni, come mostrato in un altro articolo il video 10. Mantenere gli embrioni in una capsula di Petri riempita con acqua uovo (60 mcg / mL sali del Mar;. Ca 60 embrioni e piatto) e incubare a 28,5 ° C.
  2. Se necessario, aggiungere 0,003% N-Phenylthiourea (PTU, Sigma-Aldrich) all'acqua uovo quando gli embrioni sono circa 12 HPF per prevenire melanizzazione.
  3. Circa 24 ore dopo la fecondazione (HPF), dechorionate gli embrioni con pinzette FINE (fine Science Tools Inc., Dumont # 5 Pinza - Biologia Inox.
  4. Mantenere gli embrioni in una capsula Petri riempito con acqua uovo e con uno strato di 1% agarosio sul fondo per evitare embrioni di attaccarsi alla superficie plastica.
  5. Anestetizzare gli embrioni con 200 ug / mL tamponata 3-Amminobenzoico (Tricaine, Sigma-Aldrich) a circa 10 min prima iniezioni.

5. L'iniezione endovenosa di batteri in embrioni vecchi di un giorno

  1. In scena gli embrioni a 28 hpf 11 controllando la circolazione del sangue coerente, a partire di pigmentazione negli occhi, una coda dritta, e il cuore è posizionato solo ventralmente per gli occhi.
  2. Anestetizzare gli embrioni, vedere il punto 4.5.
  3. Caricare l'ago con l'inoculo batterico con una punta microloader.
  4. Montare l'ago caricato su un micromanipolatore (Instrument Sutter, MM-33) collegato ad un supporto (strumenti di precisione mondiali, M10L supporto magnetico) e posizionarlo sotto un microscopio stereo (Leica M50, acromatico 1x oggettiva NA 0,15, base della trasmissione della luce TL ST). Impostare il tempo di iniezione di 0,2 s e la compensazione della pressione a 15 hPa (Eppendorf, FemtoJet). Regolare la pressione di iniezione tra i 700 ei 900 hPa per ottenere il corretto volume di iniezione per l'agoutilizzato. Regolare la dimensione delle gocce per corrispondere al diametro desiderato con l'aiuto di una barra di scala su un vetrino o in oculare. Per la determinazione della dimensione goccia può essere iniettato in olio minerale su un vetrino da microscopio, o la dimensione può essere stimata iniettando in aria, che lascia la goccia sulla punta dell'ago. Il raggio di una goccia di 1 NL è 0,062 millimetri (V = 4/3 π R 3).
  5. Impostare micromanipolatore con l'ago caricato nella posizione corretta prima iniezione (cioè circa a 45 ° rispetto alla superficie della piastra di iniezione) e solo muoversi avanti e indietro per iniettare.
  6. Gli embrioni vengono anestetizzati pipettati su una piastra piatta 1% agarosio iniettando uova e l'acqua in eccesso viene rimosso, consentendo tensione superficiale di tenere gli embrioni in posizione durante le iniezioni. Utilizzare uno strumento ciclo dei capelli (Figura 2) per allineare gli embrioni. Orient la piastra di iniezione a mano durante le iniezioni per posizionare gli embrioni in posizione preferita per inserting l', cioè ago con la coda rivolta verso la punta dell'ago.
  7. Posizionare la punta dell'ago direttamente sopra la chiusura vena caudale all'apertura urogenitale (Figura 1A), bucare la periderm con la punta dell'ago e iniettare la dose desiderata di batteri; usiamo ca. 250 cfu di S. typhimurium wild type (WT) ceppo SL1027, contenente il Ds-RED pGMDs3 vettore di espressione, e ca. 120 cfu di M. marinum ceppo Mma20. La sospensione batterica iniettato seguiranno il flusso di sangue attraverso la vena caudale verso il cuore. Monitorare se l'iniezione è stata eseguita correttamente controllando per un volume in espansione del sistema vascolare direttamente dopo l'impulso 2. Per esperimenti dose-risposta, 2-3 iniezioni consecutive può essere eseguita senza l'estrazione dell'ago.
  8. Controllare frequentemente che il volume di iniezione rimane la stessa durante l'esperimento. Per fornire un controllo per la coerenza delle iniezioni tutta la durata dell'esperimento, iniettare un DROp di batteri direttamente in una goccia PBS sterile sul terreno di crescita batterica dopo circa ogni iniezione embrione 30. Tavola questa goccia e contare le colonie batteriche dopo incubazione per determinare le unità formanti colonia (cfu) nel volume di iniezione.
  9. Utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza (protocollo 7) per osservare individuale fluorescente S. cellule typhimurium circolante nel sangue direttamente dopo l'iniezione, e scartare gli embrioni che non sono correttamente iniettati. Individuale fluorescente M. batteri marinum non può essere osservato da stereo microscopio a fluorescenza direttamente dopo le iniezioni, ma fluorescenti aggregati di cellule infette dovrebbero essere visibili da 2 giorni dall'infezione (dpi) e crescere nel tempo.

6. Percorsi alternativi di infezione

  1. Condotto di iniezione Cuvier: line up embrioni anestetizzati (2-3 DPF) su una piastra piatta agarosio all'1%, come l'iniezione per preparazioni iniettabili vena caudale (vedi 5.6). Orientare la iniettarePiastra agli ioni di mano durante le iniezioni per collocare gli embrioni nella posizione preferita per l'inserimento dell'ago, cioè in diagonale con un angolo di 45 ° in modo che il condotto di Cuvier può essere affrontato dalla punta dell'ago dal lato dorsale dell'embrione (Figura 1B) . Inserire l'ago nel punto di partenza del dotto di Cuvier solo dorsale nella posizione in cui inizia il condotto ampliare il sacco vitellino e iniettare batteri 100-200 (1-3 NL). L'iniezione è corretta se il volume all'interno del condotto si espande subito dopo l'impulso e il sacco vitellino non si rompe. Come per iniezioni vena caudale (vedi 5.7), più iniezioni consecutive può essere eseguita senza l'estrazione dell'ago.
  2. Rombencefalo iniezione ventricolo: line up embrioni anestetizzati (32 HPF) su una piastra piatta agarosio all'1% l'iniezione in modo tale che gli embrioni siano posizionate con il loro lato dorsale verso la punta dell'ago. Inserire l'ago nel ventricolo rombencefalo da una posizione anteriore senza toccare la neuroepithelium (Figura 1C) e iniettare 20-100 batteri (0.5-1 nL). Per praticare la procedura, utilizzare un colorante fluorescente (come Texas Red-destrano), come mostrato in un altro articolo video 13.
  3. Coda di iniezione muscolare: gli embrioni posizione anestetizzati (1-2 DPF) per preparazioni iniettabili vena caudale (vedi 5.6). Regolare la micromanipolatore con l'ago caricato ad un angolo di circa 65 ° rispetto alla superficie della piastra di iniezione. Iniettare una sospensione batterica (0.5-1 nL) contenente 20-50 cfu nel muscolo sopra dell'apertura urogenitale (Figura 1D) senza causare danni al notocorda o vasi sanguigni.
  4. Iniezione di vescicole Otic: embrioni di posizione anestetizzati (2-3 DPF) per preparazioni iniettabili vena caudale (vedi 5.6). Regolare la micromanipolatore con l'ago caricato ad un angolo di circa 65 ° rispetto alla superficie della piastra di iniezione. Iniettare circa 20 batteri (0,5 nL) nella vescicola otica (Figura 1E) con la stampa a bassaure per evitare la rottura del tessuto locale.
  5. Notocorda iniezione: line up embrioni anestetizzati (1-2 DPF) su una piastra piatta agarosio all'1% l'iniezione in modo tale che gli embrioni vengono posizionati con la coda in direzione opposta alla punta dell'ago. Inserire l'ago attraverso il tessuto muscolare di coda nella notocorda (Figura 1F) e iniettare circa 20-50 batteri (massimo 0,5 nL). Fare attenzione a non iniettare troppo volume per evitare la rottura della notocorda.
  6. Yolk iniezione: uova posizione contenenti embrioni allo stadio 16-1000 cella su una piastra 1% agarosio iniezione con canali o rettangolari a forma di V in uno stampo con canale 12 o online http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Pierce l'ago attraverso il corion al centro del tuorlo (Figura 1G) e iniettare batteri 20-40 (1-2 NL). L'impiego del 2% PVP40 soluzione portante per la sospensione batterica (vedi fase 3.5)è importante per prevenire precoce diffusione batterica nell'embrione.

7. Imaging stereo di infezione

  1. Anestetizzare gli embrioni infetti in un piatto di agarosio 1% a strati Petri coperta con acqua contenente uova Tricaine (vedi 4.5).
  2. Allineare gli embrioni in posizione corretta per l'imaging con un microscopio stereo a fluorescenza con un utensile anello capelli (Figura 2). Prima che la vescica natatoria si è gonfiato (1-5 DPF), gli embrioni sdraiarsi su un fianco che permette l'imaging laterale vista.
  3. Se una posizione diversa da quella vista laterale è necessario, montare gli embrioni in metilcellulosa 1,5%. Manipolare l'embrione nella posizione desiderata con un utensile anello capelli (Figura 2).
  4. Ritorno degli embrioni per l'acqua uovo dopo l'imaging.

8. Confocale di infezione

  1. Mettere una goccia di agarosio basso punto di fusione (Lonza Inc., 1,5% (w / v) in acqua uovo) sul fondo di un bicchiereWillCo-dish (WillCo Wells, GWSt-5040) se un microscopio invertito confocale viene utilizzato, o su una singola diapositiva depressione cavità (Agar Scientific, L4090) se un microscopio confocale montante viene utilizzato.
  2. Posizionare l'embrione anestetizzato nella goccia agarosio con quantità limitata di acqua uovo e manipolare l'embrione in posizione con un utensile anello capelli (Figura 2). Quando si usa un microscopio invertito è importante che l'embrione regione di interesse è piatta contro il fondo del piatto di vetro di imaging. Un microscopio montante può essere utilizzato in combinazione con immersione in acqua o obiettivi lunga distanza secco e l'embrione deve essere posizionato in modo tale che la regione di interesse è il più vicino possibile obiettivo.
  3. Lasciate solidificare l'agarosio e sommergere la goccia di agarosio in acqua uovo contenente Tricaine (vedi 4.5). Se un microscopio montante viene utilizzato, posizionare un vetrino di vetro sulla parte superiore della cavità depressione (non consentono di bolle d'aria).
  4. Sequenziale acquisire influenzaorescence e immagini di trasmissione.
  5. Rimuovere con cautela l'agarosio dall'embrione con le pinzette sottili e posizionare l'embrione di nuovo in acqua uovo se necessario per ulteriori esperimenti.

9. Risultati rappresentativi

L'iniezione di Salmonella typhimurium o Mycobacterium batteri marinum nell'isola sangue di embrioni a 1 risultati DPF in rapida fagocitosi da parte dei macrofagi. Il gene MPEG1 è stato recentemente identificato come marker fedele di macrofagi embrionali, colocalizing con la ben consolidata macrofagi marcatore csf1r (FMS) e non sovrapposizione con marcatori neutrofili come MPX (MPO) e Lyz 4, 14. Per immagine dal vivo di fagocitosi batterica abbiamo usato linee transgeniche in cui il promotore pilota l'espressione mpeg1 proteina fluorescente in macrofagi 14. Queste linee transgeniche sia la mpeg1 f promotoreusato direttamente per il gene GFP, o impiegare un sistema a due componenti in cui il promotore pilota l'espressione mpeg1 del fattore di trascrizione di lievito Gal4 che attiva un transgene secondo con la sequenza di riconoscimento Gal4 (UAS, a monte attivando sequenza) fuso al gene Kaede. Quando l'iniezione isola di sangue (protocollo 5; Figura 1A) è stata eseguita correttamente, i batteri immediatamente fluire attraverso la circolazione sanguigna e diffusa in tutto l'embrione. Diffusione del relativamente ampio e luminoso fluorescente Ds-rosso con la scritta S. typhimurium batteri possono essere esposte direttamente con un microscopio stereo a fluorescenza (Figura 3A), e confocale a 2 mostra HPi che molti batteri sono fagocitati dai macrofagi fluorescenti (Figura 3B-C). L'iniezione di un minimo di 25 cfu di tipo selvatico S. typhimurium batteri si tradurrà in una infezione letale, mentre una dose simile di batteri di un s non virulentotreno, come Ra, possono essere cancellati dal 3 embrionale sistema immunitario. Iniezione di una dose di 250 cfu è stato usato per determinare le risposte trascrizionali di S. infezione typhimurium nell'embrione zebrafish e ha dimostrato la induzione di una forte pro-infiammatoria risposta espressione genica 15. Al contrario, l'iniezione endovenosa di M. marinum batteri non suscitare una forte risposta pro-infiammatoria, ma conduce ad una infezione persistente in cui i macrofagi infetti formare aggregati stretti che sono considerati come le fasi iniziali di granulomi, che sono il segno distintivo della tubercolosi 2. Confocale di un tale granuloma-come aggregato nel Tg (mpeg1: EGFP) gl22 linea 14 a 5 dpi mostra la crescita intracellulare di mCherry marcato M. marinum batteri all'interno dei macrofagi verde fluorescente (Figura 3D-E).

Otle sue vie di infezione sono utili per scopi diversi. I batteri possono essere iniettata nel ventricolo rombencefalo a 32 HPF (Figura 1C), che è un vano privo di macrofagi. Iniezione di 20-100 mCherry marcato M. batteri marinum in questo vano porta alla rapida infiltrazione di macrofagi che fagocitare i batteri (Figura 4A). Un altro metodo per studiare la migrazione diretta di cellule immuni innate è l'iniezione di batteri nel muscolo coda (figura 1D). Tuttavia, le iniezioni muscolari coda anche causare danni ai tessuti che di per sé suscita una certa attrazione dei leucociti. Tale risposta ferita può essere evitata accuratamente quando l'iniezione di una piccola quantità (0.5-1 nL) nella vescicola otica (Figura 1E). Come mostrato qui utilizzando la Tg (MPX: EGFP) I114 linea 16, l'iniezione di circa 20 cfu di S. typhimurium nella vescicola otica porta alla attrazione di neutrofili a 3 HPI ( (figura 4E). La notocorda, che appare resistente alle infiltrazioni di leucociti, è un vano permissive per la crescita di M. marinum mutanti che sono fortemente attenuato quando iniettate in altri tessuti 7; (Figura 4F). Infine, l'iniezione iniziale di M. marinum nel tuorlo di embrioni fornisce un metodo alternativo per ottenere una infezione sistemica. In genere questi eseguire iniezioni intorno alla cella stadio 16 (figura 1G), ma iniezioni batteriche nel tuorlo può anche essere effettuata in fasi successive (fino alla fase 1000 cella), o anteriore (1 a 8 stadio cella) per co-iniezioni con Morpholinos 8. Dopo tuorlo iniezione di una dose di 20-40 cfu, M. batteri marinum distribuiti su diversi giorni nei tessuti embrionali e forma granuloma simili aggregati simili a quelli osservati sul convenzionaleiniezione endovenosa metodo 8; (4G Figura). Il metodo di iniezione tuorlo non è adatto per S. infezione da typhimurium, perché la sua rapida crescita nel tuorlo provoca mortalità precoce. Il metodo di infezione tuorlo per M. infezione marinum sarà utile per applicazioni ad alta produttività in quanto può essere automatizzato usando un robot di iniezione 8.

Figura 1
Figura 1. Panoramica dei metodi di iniezione utilizzati per stabilire infezioni sistemiche o locali in embrioni di zebrafish. (AB) iniezioni endovenose per stabilire una infezione sistemica rapida vengono eseguite nella vena caudale presso l'isola di sangue posteriore a 1 dpf (A) o nel condotto di Cuvier a 2-3 DPF (B). (CE) iniezioni locali per lo studio chemiotassi dei neutrofili e macrofagi vengono eseguite nel ventricolo rombencefalo a 1 dpf (C), Il muscolo coda a 1-2 dpf (D) o la vescicola otica a 2-3 dpf (E). (F) Iniezioni per creare un'infezione apparentemente inaccessibile ai fagociti vengono eseguite nella notocorda a 1-2 dpf. (G) Iniezioni di creare un precoce dell'infezione sistemica con lenti batteri che crescono come M. marinum può essere eseguita nel tuorlo nella fase 16-1000 cella. Tutte le immagini sono state scattate con una Leica M165C, Planapo 1.0x collegato ad una macchina fotografica Leica DFC420 (0,8 x Leica 10446307).

Figura 2
Figura 2. Capelli anello attrezzo. Un pezzo di capello umano è inserito come un anello nell'apertura di una pipetta Pasteur e fissato con colla super o con Tipp-Ex. Ciò fornisce un comodo strumento per la manipolazione di embrioni di zebrafish dolcemente fragili.

Figura 3
Figura 3. Iniezioni endovenose dirosso fluorescente Salmonella typhimurium e Mycobacterium marinum. Ds-RED-marcato S. typhimurium SL1027 batteri (AC) e mCherry marcato M. marinum Mma20 batteri (DE) sono stati iniettati nel sangue isola di Tg (MPEG1: Gal4-VP16) GL24; Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t (AC) o Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) embrioni di zebrafish a 28 HPF. (A) immagine di sovrapposizione stereo-fluorescenza e in campo chiaro che mostra la diffusione di S. typhimurium nella circolazione del sangue a 2 HPI (microscopio Leica Leica DFC420C MZ16FA con fotocamera). (BC) confocali Z-Stack proiezioni mostrano rosso S. typhimurium batteri fagocitati dai macrofagi verde a 2 HPI (Leica TCS SPE, HCX obiettivo APO 40x 0,8 NA). I batteri che sono ancora extracellulare può anche essere osservato. (D) confocale Z-Stack proiezione mostra un granuloma-come aggregati, contenente M. marinum Mma20-macrofagi infetti e non infetti a 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0,8 NA). I macrofagi in verde e batteri in rosso. (E) Confocal z-pila proiezione di un individuo macrofagi (verde) con M. intracellulare batteri marinum (rosso). L'area rappresentata in D dal rettangolo bianco è stato ripreso con un obiettivo di ingrandimento maggiore (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 micron.

Figura 4
Figura 4. Percorsi alternativi per l'infezione di embrioni di zebrafish. (A) mCherry marcato M. marinum Mma20 batteri sono stati iniettati nel ventricolo rombencefalo a 32 HPF. Fluorescenza e sovrapposizione di immagini che mostra la trasmissione dei batteri mCherry marcati fagocitati dai macrofagi a 5 HPI (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (B) S. typhimurium è stata iniettata nel muscolo coda a 1 dpf. Attrazione di cellule mieloidi al sito di iniezione (cerchio bianco) è mostrato a 3 hpi da fluorescent ibridazione in situ 4, (C), mentre in embrioni non iniettati delle cavie normalmente non ci sono le cellule mieloidi in questo sito morfologica. Sebbene gli embrioni non contengono neutrofili maturi in questa fase, due popolazioni di cellule mieloidi possono essere distinti, uno esprime il macrofago marcatore mfap4 (rosso) e uno esprimendo il marcatore mpx neutrofili (verde) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x 0,3 NA). Fluorescenza dei batteri si perde dopo la procedura di ibridazione in situ. (D) Ds-RED-marcato S. typhimurium batteri sono stati iniettati nella vescicola otica di Tg (MPX: EGFP) I114 zebrafish a 2 dpf. Immagini sovrapposte stereo-fluorescenza e luminoso campo mostrano che mpx: EGFP cellule marcate neutrofili sono attratti alla vescicola infetta otic (ellisse tratteggiata) a 3 HPI, (E), mentre le iniezioni di controllo di PBS nella vescicola otica dei Tg (mpx: EGFP ) I114 zebrafish non mostra attrazione di neutrofili al ve infetto oticSicle (ellisse tratteggiata) (Leica MZ16FA con fotocamera Leica DFC420C). (F) mCherry-marcato M. batteri marinum del E11 attenuato eccCb1 :: tn ceppo mutante 17 sono stati iniettati nel notocorda a 1 dpf. Proliferazione all'interno della notocorda è stato ripreso a 5 dpi (Leica microscopio MZ16FA con fotocamera DC500). (G) mCherry marcato M. marinum batteri E11 sono stati iniettati nel tuorlo di embrioni allo stadio 16-cellule zebrafish del (fli1a: EGFP) Tg linea che esprime GFP in cellule endoteliali di vasi sanguigni e linfatici. La formazione di granuloma-come aggregati di cellule infettate nella regione della coda si osserva a 5 dpi (microscopio Leica MZ16FA con la macchina fotografica Leica DFC420C; immagine da 8).

Discussion

I metodi di infezione descritti in questo articolo sono spesso usati per studiare la funzione dei geni dell'immunità innata di accoglienza o geni di virulenza batterica 1. Le micro-iniezione per via endovenosa metodi (protocolli 5 e 6.1) vengono utilizzati più spesso per tali studi. La vena caudale presso l'isola di sangue posteriore è la posizione più conveniente per iniezione endovenosa di 1-giorno-vecchi embrioni. Come la vena caudale diventa più difficile da penetrare nelle fasi successive, si preferisce il dotto di Cuvier, come sito di iniezione per via endovenosa per gli embrioni a 2-3 dpf. In tutti i casi è fondamentale per iniettare gli embrioni con un numero consistenti di batteri, che dovrebbe essere controllato da inoculi placcatura ad iniezione per il conteggio cfu. I seguenti aspetti devono essere considerati per ottenere iniezioni riproducibili. In primo luogo, è essenziale disporre di alta qualità aghi di iniezione microcapillari vetro. Se la punta dell'ago è troppo grande, l'iniezione creerà un foro puntura abbastanza grande per sanguinamento si verifichi ei batteri iniettati fluirà fuori della circolazione sanguigna. In secondo luogo, i batteri devono essere iniettato direttamente nella circolazione sanguigna. Se la punta dell'ago non si trova all'interno della vena, o se si diffonde iniezione di fluidi in pratica l'estensione sacco vitellino, l'embrione deve essere scartato dall'esperimento. In terzo luogo, utilizzando PVP40 come supporto per l'iniezione di M. marinum aiuterà a prevenire i batteri di affondare l'ago di vetro. PVP40 migliorare l'omogeneità della sospensione, con conseguente inoculi più riproducibile per tutta la durata di iniezioni. PVP40 possono anche essere utilizzati per S. iniezioni typhimurium, ma qui è meno importante perché la dimensione più grande e fluorescenza dei batteri permette un controllo visivo l'inoculo di iniezione durante gli esperimenti. Per praticare le iniezioni si consiglia l'uso del colorante rosso fenolo (1% v / v) o di 1 micron sfere fluorescenti disponibili in diversi colori (Invitrogen). Una volta che la tecnica è padroneggiata, ci vogliono circa 30 minutes per iniettare 50-100 embrioni, incluso il tempo necessario per allineare le embrioni su piastre di agarosio e regolando il volume di iniezione batterica.

Mentre iniezioni endovenose nel isola sangue (protocollo 5) o nel condotto di Cuvier (protocollo 6,1) sono più comunemente utilizzati, i percorsi alternativi di infezione descritti in questo articolo video sono dimostrati utili per studiare macrofagi e neutrofili chemiotassi (protocolli 6,2, 6,3 , e 6.4), per studiare la crescita di ceppi batterici attenuati (protocollo 6.5), e ad adeguare il modello di zebrafish infezione per applicazioni ad elevato throughput (protocollo 6.6) 4-8. Le descritte micro-iniezione metodi possono essere applicati anche per le iniezioni di virus 18, 19, spore fungine 14, 20 o protozoi parassiti (Maria Forlenza, comunicazione personale). Un accessorio utile per le procedure di iniezione descritte in questo articolo il video è una procedura descritta di recente per l'iniezione sottocutanea di batteri in zebrembrioni afish 21. Questa procedura è stata applicata per studiare fagocitosi dei batteri da parte di neutrofili, che sono stati trovati per batteri efficiente fuo su superfici tessuto ma, a differenza di macrofagi, sono praticamente in grado di fagocitare i batteri dopo l'iniezione nel sangue o in piene di liquido cavità del corpo. Per gli embrioni iniezioni sottocutanee sono posizionati simile a quello per le iniezioni muscolari di coda descritti in questo articolo video, ma l'ago viene inserito sotto la pelle per iniettare i batteri nel corso di un somite.

È importante considerare che il micro-iniezione è essenzialmente un percorso artificiale di infezione. Tuttavia, gli embrioni precoci sono altamente resistenti alla esposizione esterna agli agenti patogeni batterici. In realtà, saggi immersione, in cui gli embrioni sono immerse in una sospensione batterica, non sono riproducibili nelle nostre mani 22. Mentre alcuni embrioni possono essere infettati al momento immersione, abbiamo osservato una grande variazione nei tassi di mortalità e l'espressoione di geni marcatori infiammatori tra embrioni individuali in tali dosaggi. Le micro-iniezione metodi descritti in questo articolo raggiungere infezioni riproducibili e sono particolarmente utili per studiare le interazioni delle cellule batteriche con ospiti immunitarie innate. Un approccio efficace per quantificare l'infezione batterica in embrioni individuali è quello di analizzare le immagini fluorescenti di embrioni infetti con misura, software dedicato quantificazione pixel 17, 23. Questo approccio è stato dimostrato che correla bene con i risultati della conta cfu dopo placcatura di embrioni infetti. Allo stesso modo, variazioni relative al numero dei leucociti embrioni sono stati quantificati mediante analisi di immagini digitali in linee transgeniche leucociti fluorofori reporter; questo approccio sarebbe applicabile a quantificare la risposta leukopoietic ospite alle infezioni 24.

La funzione di geni ospitanti immune innato può essere studiata in modo efficiente in vivo combinando i modelli di infezione descrittecon knockdown morfolino. Morpholinos sono oligonucleotidi antisenso che colpiscono RNA sintetici specifici e ridurre l'espressione dei prodotti genici quando iniettate in embrioni allo stadio 1-cellule zebrafish come mostrato in articoli altre video in questa rivista 10, 25. Negli studi atterramento morpholino, è di grande importanza che tutti i gruppi di embrioni da confrontare sono in scena correttamente prima di iniezioni batteriche. Questo è particolarmente importante perché embrioni avere un sistema di sviluppo immunitario che diventa sempre più competente nel tempo.

Ci sono diverse linee transgeniche giornalista attualmente disponibili per distinguere le principali sottoinsiemi innata del sistema immunitario, i macrofagi e neutrofili, in embrioni di zebrafish. Il mpx e promotori LYZ sono stati utilizzati per generare linee giornalista neutrofili 16, 26, 27, e la csf1r (FMS) e MPEG1 promotori sono stati utilizzati per produrre reporter macrofago 14, 28. Mentre CSF1r (FMS) è inoltre espresso in xanthophores, mpeg1 espressione è esclusivamente in macrofagi. Come mostrato in questo articolo video, MPEG1 recentemente messo a punto le linee del reporter sono molto utili per l'imaging fagocitosi batterica da parte dei macrofagi.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Cui Chao, Piano de Kort, Stoop Esther e Ralph Carvalho per le immagini in Figura 4, Ulrike Nehrdich e Davy de Witt per la cura dei pesci e altri membri di laboratorio per le discussioni utili. Questo lavoro è supportato dal Programma Mix intelligente del Ministero olandese degli Affari economici e del Ministero dell'Istruzione, della Cultura e della Scienza, la Commissione europea settimo progetto quadro ZF-sanitaria (salute-F4-2010-242048), il Parlamento europeo Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289.209), e dal NHMRC australiano (637.394). L'australiano Istituto di Medicina Rigenerativa è supportato da sovvenzioni da parte del Governo dello Stato del Victoria e il governo australiano.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

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Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

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