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Immunology and Infection

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

투명 zebrafish의 배아는 다음과 같은 시각화하는 유용한 모델 호스트와 타고난 면역 세포와 세포 세균성 병원체 간의 기능상 학습 상호 작용을 증명했습니다

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) 배아는 점점 호스트 병원체 상호 작용 1 척추 타고난 면역 체계의 기능을 연구를위한 모델로 사용됩니다. 타고난 면역 체계의 주요 셀 유형, macrophages와 neutrophils은 사전 적응 면역 반응에 필요한 lymphocytes의 성숙에 embryogenesis의 첫 번째 일 동안 개발할 수 있습니다. 배아 다수를 획득 용이성은, 외부 개발, 배아 및 애벌레 단계의 광학 투명성으로 인해 그들의 접근은 유전자 도구, 유전자 변형 리포터 라인의 광범위한 돌연변이 자원과 콜렉션의 다양한 모든 zebrafish의 다양성에 추가 모델. 살모넬라 enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium)와은 Mycobacterium marinum는 macrophages에 intracellularly 거주하고 자주 zebrafish 배아에서 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 이 두 가지의 감염 과정세균성 병원균은 비교하는 흥미로운 때문에 S. typhimurium 감염은 M. 반면, 급성 하나 일 이내에 치명적입니다 marinum 감염 만성이고 애벌레의 단계 2, 3까지 몇 군데하실 수 있습니다. 배아 (그림 1)로 박테리아의 마이크로 주입의 사이트는 감염이 급속도로 전신이 될 것이다 또는 초기화된 상태로 유지됩니다 여부를 결정합니다. 급속한 조직 감염에 의해 설정할 수 마이크로 주입 직접 사후 혈액 섬의 꼬리 정맥을 통해 혈액 순환에 또는 Cuvier, 트렁크 vasculature로 마음을 연결하는 난황에 대한 광범위한 유통 채널의 덕트를 통해 박테리아를. 한 dpf에서이 단계의 배아는 phagocytically 활성 macrophages을 가지고 있지만 neutrophils 아직 혈액 섬에 주입, 성숙하지 않은 경우 사용하는 것이 좋습니다. 배아도 기능적 (myeloperoxidase 생산) neutrophils를 개발 2-3 dpf,시 주사의 경우 Cuvier의 덕트는 t으로 선호그는 주사 사이트. 지역의 감염에 대한 골수양 세포의 이동 마이 그 레이션을 공부하려면, 박테리아는 꼬리 근육, 귀의 소포, 또는 hindbrain 뇌실 4-6로 주입 할 수 있습니다. 또한, notochord, 골수양 세포에 정상적으로 접근할 것 같습니다 구조, 지역 감염 7 매우 쉽습니다. 높은 처리량 어플 리케이션을위한 유용한 대안은 기름지게 8 후 첫 시간 이내에 배아의 노른자로 박테리아의 주사입니다. 형광 macrophages 또는 neutrophils과 형광 박테리아와 유전자 변형 zebrafish 라인을 결합하면 호스트 병원체 상호 작용의 멀티 컬러 이미징을위한 이상적인 환경을 만듭니다. 이 비디오 기사는 S로 zebrafish 배아의 정맥과 지역 감염에 대한 자세한 절차를 설명합니다 typhimurium 또는 M. marinum 박테리아와 타고난 면역 계통의 세포와 상호 작용의 후속 형광 이미징을위한.

Protocol

1. 주입 바늘을 준비한다

  1. micropipette를 끌어당기는 장치 (셔터 인 스트 루먼트 주식 회사, 긴 팁에 대해 다음 설정을 / 브라운 P-97을 불타는 사용 borosilicate 유리 microcapillary 주사 바늘 (하버드 장치, 300038, 1mm OD × 0.78 mm ID를) 준비 : 공기압 400; 히트 610, 풀 40, 속도 50; 시간 30 짧은 팁에 대해 다음 설정으로 : 공기 압력 500, 가열 510, 풀 100, 속도 200, 시간 60).
  2. 5-10 μm의의 팁 오프닝 직경을 얻기 위해 고급 핀셋과 바늘 끝을 봐라. 그것은 베벨 선명 팁을 얻을 수있는 microgrinder (Narishige 주식 회사 EG-400)의 각도를 45도에서 바늘 팁 여는 것이 좋습니다. 이것은 표피 레이어를 펑쳐링 촉진하기 때문에 뭉툭한 바늘보다 적은 조직 손상을 더욱 재현할 주사집니다. 긴 스쳐 바늘은 꼬리 정맥 (5 단계)와 Cuvier의 덕트 (단계 6.1) 주사와 짧은 스쳐 바늘에 대한 선호다른 주사 절차 (단계 6.2-6.6)을 선호하고 있습니다.

2. S. 준비 typhimurium Inoculum

  1. S. 아웃 플레이트 LB 한천 플레이트쪽으로 -80 ° C의 글리세롤 주식에서 typhimurium (형광 발현 벡터에 대해 선택할 수있는 적절한 항생제 포함)와 37에서 하룻밤 품어 ° C.
  2. 개별 fluorescently 긍정적인 식민지를 선택하고 멸균 인산 버퍼 식염수 (PBS)에서 원하는 농도 (프로토콜 5와 6 참조)에게 resuspend, 선택적으로 0.085 % (V / V)를 포함하는 페놀 레드 (시그마 - 알드리치)의 시각화를 투입 분사 과정입니다. 직접 분사에 대한 신선한 정학을 사용하거나 글리세롤의 주식을 준비합니다. 글리세롤 주식을 준비하기 위해 박테리아의 원하는 농도로 갓 만든 사출 주식을 다운 스핀과 PBS의 멸균 20% (V / V) 글리세롤 (시그마 - 올드 리치)의 절반이 시작 볼륨에 펠렛을 resuspending하여 주식을 집중. -8시 글리세롤 주식을 저장0 ° C. 선택적으로 0.17 % 페놀 레드가 들어있는 무균 PBS에서 주입 이전 글리세롤 주식 1시 1분 (V / V)를 희석.
  3. 와동은 세균 현탁액 잘 clumping 피할 수 있습니다.
  4. microloader 팁 (Eppendorf, 5242956.003)를 사용 microcapillary 바늘로 inoculum을로드합니다.
  5. S.의 비교적 큰 크기로 인해 typhimurium 박테리아와 그 밝은 DS-RED 형광 pGMDs3 발현 벡터 3 (요청시 사용 가능한 변형)을 사용하여 개별 세균 세포는 쉽게 사출 복용을 설정하기 위해 형광 stereomicroscope으로 계산 할 수 있습니다. 이를 위해, 한천 플레이트를 PBS 한 방울로 한 NL 주사 형광 박테리아를 계산하고, 원하는 세균성 복용량을 (기왕이면 1-2 NL 사이의 주사 량을 유지)을 구하는 데 필요한 사출 량을 계산합니다. S로 배아를 주사 선택한 경로 (프로토콜 5와 6 참조)를 통해 typhimurium.

3. 준비

  1. M. 유지 marinum는 Difco 미들 7H10 한천 배지에서 성장하는 부담 (BD 및 기업) (사용 가능한 변종 형광 발현 벡터에 대해 선택할 수 산성 - 알부민 - 덱스 트로 오스 - 카탈 라 아제 10 % 올레 (OADC, BD 및 회사), 0.5 % 글리세롤로하고 적절한 항생제 보충 요청 9)에 따라, 신선한 주식은 항상있다.
  2. M.의 식민지를 선택 10% 알부민 - 덱스 트로 오스 - 카탈 라 아제 (ADC, BD 및 회사)와 0.05 % 십대 초반 80 (시그마 - 올드 리치) 및 적절한 항생제로 보충 Difco 미들 7H9 국물 (BD 및 회사)에 marinum와 resuspend. 600 nm의의 광학 밀도 (OD)가 0.2인지 확인 - 0.3 및 28.5에서 그것이 정적으로 하룻밤 기르 ° C. M.의 세대 시간 marinum은 변형에 따라 각기 약 4-6 H이다.
  3. 주사 당일에 다시 600 NM에서 OD를 측정합니다. 1 OD600은 약 10 8 엠에 해당 marinum / ML(이것은 사용되는 박테리아 변종에 따라 달라질 수 있으며 따라서 특정 변형에 대한 성장 곡선에 기초하여야한다).
  4. 그들은 멸균 PBS로 세 번 centrifuging 그들을 세척하여 대수 상 (OD600가 1.00을 초과해서는 안된다)에있을 때 박테리아를 수확.
  5. PBS의 세균 현탁액으로 다시 OD600를 측정, 아래로 회전하고, 균질성을 향상 PBS의 PBS 또는 2 % Polyvinylpyrrolidone에서 원하는 농도 (프로토콜 5와 6 참조) (PVP40) (W / V)에게 세균을 resuspend 세균성 정지. 페놀 레드 (시그마 - 올드 리치)는 사출 공정의 시각화를 돕기 위해 0.085 %의 농도에 추가할 수 있습니다. 직접 분사에 대한 신선한 정학을 사용하거나 글리세롤의 주식을 준비합니다. 글리세롤 주식은 박테리아의 원하는 농도로 갓 만든 사출 주식을 다운 스핀 준비하고 PBS에서 무균의 20 % 글리세롤의 절반이 시작 볼륨에 펠렛을 resuspending하여 주식을 집중합니다. glyc를 저장-80시 erol 주식 ° C. 선택 PVP40 및 / 또는 0.17 % 페놀 레드 4 %가 들어있는 무균 PBS에서 글리세롤 주식 1시 1분 (V / V)를 희석.

4. 주입을위한 Zebrafish 배아를 준비

  1. zebrafish 번식 쌍을 설정하고 다른 동영상 제 10과 같이 배아를 수집합니다. 계란 물 (. 60 μg / ML 바다 소금, CA 60 배아 / 접시)로 가득 배양 접시에있는 배아 보관 및 28.5에서 품어 ° C.
  2. 필요한 경우 배아는 melanization을 막기 위해 약 12 hpf 때, 계란 물에 (PTU, 시그마 - 올드 리치) 0.003 % N-Phenylthiourea를 추가합니다.
  3. 24 시간 정도 포스트 기름지게 (hpf), dechorionate 고급 핀셋 (파인 과학 도구 주식 뒤몽 # 5 집게와 배아 - Inox 생물학.
  4. 달걀 물로 및 플라스틱 표면에 고집에서 배아를 방지하기 위해 바닥에 1퍼센트 아가로 오스의 레이어로 가득 배양 접시에있는 배아 보관하십시오.
  5. 200 μg / ML로 태아를 마취는 3 버퍼- 아미노 벤 산 (Tricaine, 시그마 - 올드 리치) 주사 이전 약 10 분.

5. 1 일 오래된 태아에 박테리아의 정맥 주사

  1. 눈, 바로 꼬리에 착색으로 시작하고, 마음은 눈에 막 ventrally 위치하고, 지속적인 혈액 순환을 검사하여 28 hpf 11시 배아를 무대.
  2. 태아를 마취 4.5 단계를 참조하십시오.
  3. microloader 팁을 사용하여 세균 inoculum로 바늘을로드합니다.
  4. 스탠드에 연결된 micromanipulator (셔터의 악기, MM-33) (세계 정밀 계측기, M10L 마그네틱 스탠드)에 로드된 바늘을 탑재하고 스테레오 현미경 (Leica M50, achromat 1X 객관적 0,15 NA, 전송 가벼운 기지 밑에 배치 TL ST). 0.2 s의 분사 시간과 보상 압력 15 고전력 증폭기 (Eppendorf, Femtojet)을 설정합니다. 바늘에 대한 올바른 사출 볼륨을 얻기 위해 700 900 고전력 증폭기 사이의 분사 압력을 조정사용됩니다. 현미경 슬라이드 또는 안구의 눈금 막대의 도움으로 원하는 직경이 일치하도록 방울 크기를 조정합니다. 크기 결정의 드롭은 현미경 슬라이드에 광유로 주입 할 수도 있고, 크기는 바늘 끝에 매달려 드롭을 떠나는 공기에 주입하여 추정 수 있습니다. 한 NL 한 방울의 반경은 0.062 mm (R 3 V = 3분의 4 π)입니다.
  5. 사전 (사출 플레이트 표면에 관하여 45 ° 각도로 예 약) 주입으로 올바른 위치로 로드된 바늘로 micromanipulator를 설정만을 주입 앞뒤로 그것을 이동합니다.
  6. anesthetized 배아는 표면 장력은 주사하는 동안 자리에 배아를 개최 있도록 제거되는 평면 1퍼센트 아가로 오스 주입 플레이트 및 초과 계란 물에 pipetted됩니다. 배아를 살해하기 위해 헤어 루프 도구 (그림 2)를 사용합니다. 동양 inserti 위해 원하는 위치로 배아를 삽입하기 위해 주사하는 동안 손으로 사출 플레이트NG 꼬리가 바늘 끝을 향해 가리키고있는 바늘 즉.
  7. 직접 urogenital 개장 (그림 1A), 바늘 끝과 피어스 periderm에 꼬리 정맥 주변 위의 바늘 팁을 놓고 박테리아의 원하는 복용량을 투입, 우리는 CA를 사용합니다. S. 250 cfu DS-RED 표현에게 벡터 pGMDs3 및 CA를 포함하는 typhimurium 야생 유형 (wt) 변형 SL1027. M. 120 cfu marinum 변형 Mma20. 주입 세균 현탁액은 심장을 향해 꼬리 정맥을 통해 혈액의 흐름을 따릅니다. 사출 직접 파동이 후 혈관 시스템의 확장 볼륨에 대해 확인하여 올바르게 수행되었는지 모니터링합니다. 선량 - 반응 실험의 경우, 2-3 연속 주사는 바늘을 추출하지 않고도 수행할 수 있습니다.
  8. 자주 실험 도중 분사 볼륨이 동일하게 유지되었는지 확인하십시오. 실험을하는 동안 주사의 일관성에 대한 컨트롤을 제공하기 위해 dro 투입직접 대략 매 30 번째 배아 주입 후 세균의 성장 배지에서 무균 PBS 드롭으로 박테리아의 P. 이 드롭 아웃 플레이트 및 사출 볼륨에서 콜로니 형성 단위 (cfu)을 결정하기 위해 부화 후 세균성 식민지를 계산합니다.
  9. 개별 형광 S.을 관찰하는 형광 stereomicroscope (7 번 프로토콜)를 사용 typhimurium 세포에 직접 주입 후 혈류에서 순환하고, 제대로 주입되지 않은 배아를 버리고. 개인 형광 M. marinum 박테리아 직접 주사 후 입체 형광 현미경으로 관찰되지 않을 수 있지만, 감염된 세포의 형광 집계는 2 일 포스트 감염 (DPI)로 표시하고 시간이 지남에 따라 더 큰 성장한다.

6. 감염의 대체 경로

  1. Cuvier 주입 덕트 : 꼬리 정맥 주사 용과 같은 평면 1% 아가로 오스 주입 플레이트 (5.6 참조) anesthetized 배아 (2-3 dpf)까지 줄입니다. 동양이 투입즉 대각선 아래 바늘을 삽입 위해 원하는 위치로 배아 배치 주사하는 동안 손으로 이온 플레이트 Cuvier의 덕트는 (그림 1B) 배아의 지느러미 측면에서 바늘 끝에 나갈 수 있도록 45 ° 각도 . 덕트가 난황을 통해 확대 시작되고 100-200 박테리아 (1-3 NL)를 주입 위치에 단지 지느러미 Cuvier의 덕트의 시작 지점에 바늘을 삽입합니다. 덕트 내의 볼륨이 바로 파동 이후와 난황이 파열되지 않은 팽창 경우 주사 그렇습니다. 꼬리 정맥 주사 (5.7 참조​​)에 관해서는 여러 가지 연속 주사는 바늘을 추출하지 않고도 수행할 수 있습니다.
  2. Hindbrain의 뇌실 주입 : 배아가 바늘 끝을 향해 그들의 지느러미 측면으로 배치되는 등 평면 1% 아가로 오스 주입 접시 anesthetized 배아 최대 선 (32 hpf). neuroe을 건드리지 않고 앞쪽에 위치에서 hindbrain의 뇌실로 바늘을 삽입pithelium (그림 1C) 및 20-100 박테리아 (0.5-1 NL)를 투입. 다른 동영상 제 13과 같이 절차를 연습하려면, (예 : 텍사스 - 빨강 Dextran 등) 형광 염료를 사용합니다.
  3. 꼬리 근육 주사 : 위치 anesthetized 배아 (1-2 dpf) 꼬리 정맥 주사를위한 등 (5.6 참조). 사출 플레이트 표면에 대하여 약 65 °의 각도로 로드된 바늘로 micromanipulator를 조정합니다. notochord이나 혈관의 손상을 유발하지 않고 urogenital 오프닝 (그림 1D) 위의 근육에 50 cfu - 20를 포함하는 세균 현탁액을 (0.5-1 NL) 주사.
  4. 귀의 소포 주입 : 꼬리 정맥 주사 용과 같은 위치 anesthetized 배아 (2-3 dpf) (5.6 참조). 사출 플레이트 표면에 대하여 약 65 °의 각도로 로드된 바늘로 micromanipulator를 조정합니다. 낮은 기자 귀의 소포 (그림 1E)으로 약 20 박테리아를 (0.5 NL) 주사지방 조직 파열을 피하기 위해 우레.
  5. Notochord 주입 : 배아 그들의 꼬리가 바늘 끝에서 떨어져 포인팅으로 배치되는 등 평면 1퍼센트 아가로 오스 주입 접시 anesthetized 배아 최대 라인 (1-2 dpf). notochord (그림 1 층)에 꼬리 근육 조직을 통해 바늘을 삽입하고 약 20-50 박테리아를 (최대한의 0.5 NL) 주사. notochord의 파열을 피하기 위해 너무 많은 양을 주입하지 않도록주의를 기울입니다.
  6. 노른자 주입 :에서 채널 금형 12 온라인으로 만든 직사각형이나 V 자형의 채널을 가진 1 % 아가로 오스 주입 접시에 16-1000 세포 단계에서 배아를 포함하는 위치 계란 http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . 피어스는 노른자 (그림 1G)의 중심에 chorion 통해 바늘과 (1-2 NL) 20-40 박테리아를 주입. 세균 현탁액을위한 2퍼센트 PVP40 캐리어 솔루션의 사용 (단계 3.5 참조)배아에 초기 세균 전염을 예방하는 것이 중요합니다.

7. 감염의 스테레오 이미징

  1. Tricaine을 (4.5 참조)가 들어있는 달걀 물로 덮여 1 % 아가로 오스 계층 배양 접시에 감염된 태아를 마취.
  2. 헤어 루프 도구 (그림 2)와 형광 스테레오 현미경 이미징을위한 올바른 위치에 배아를 맞춥니다. 수영 방광이 비정상적으로 증가되기 전에 (1-5 dpf), 배아는 측면 뷰 이미징을 가능하게 그들의 면이 평평하게 누워 있습니다.
  3. 측면보기보다는 다른 위치가 필요한 경우, 1.5 %의 메틸 셀룰로오스에서 배아를 탑재합니다. 헤어 루프 도구 (그림 2)와 필요한 위치로 배아를 조작.
  4. 이미징 후 계란 물을 배아를 반환합니다.

8. 감염의 공촛점 이미징

  1. 의 유리 바닥에 낮은 녹는 점 아가로 오스 (Lonza 주식, 달걀 물에 1.5 % (W / V))의 방울을 넣습니다거꾸로 공촛점 현미경을 사용하는 경우 WillCo-요리 (WillCo 웰스 GWSt-5040) 또는 단일 캐비티의 우울증 슬라이드 (한천 과학, L4090)에서 직립 공촛점 현미경을 사용하는 경우.
  2. 계란 물을 제한된 금액으로 아가로 오스 드롭으로 anesthetized 배아를 넣은 헤어 루프 도구 (그림 2)와 위치로 배아를 조작. 거꾸로 현미경을 사용하면 그것은 관심 배아의 지역 이미징 요리의 유리 바닥에 대한 평면 것이 중요합니다. 직립 현미경은 물이 침수 또는 장거리 건조 목표와 함께 사용될 수 있으며, 배아는 관심 영역이 최대한 객관적으로 가까이는 그러한 위치해야합니다.
  3. 아가로 오스는 Tricaine을 (4.5 참조)가 들어있는 달걀 물에 아가로 오스 드롭을 고체화하고 잠수함합시다. 직립 현미경를 사용하는 경우, 우울증의 캐비티 (공기 방울이 형성하는 것을 허용하지 않습니다) 위에 유리 커버 슬립을 배치.
  4. 순차적으로 독감을 획득orescence 및 전송 이미지.
  5. 조심스럽게 고급 핀셋으로 배아에서 아가로 오스를 제거하고 그것을 더 시험을 위해 필요한 경우 계란 물로 다시 배아를 놓습니다.

9. 대표 결과

macrophages에 의해 급속한 phagocytosis 1 dpf 결과에서 태아의 혈액 섬에 살모넬라균 typhimurium 또는 marinum은 Mycobacterium 박테리아의 주사. MPEG1 유전자는 최근 탄탄한 대식 세포 마커 csf1r (FMS)로 colocalizing와 같은 mpx (mpo)와 lyz 4, 14와 같은 호중구 표식과 중복되지, 배아 macrophages의 충실한 마커로 확인되었습니다. 세균성 phagocytosis의 라이브 영상을 보려면 우리는 MPEG1 발기인이 macrophages 14 형광 단백질 표현을 운전하는 형질 전환 라인을 사용. 이러한 유전자 변형 라인 중 MPEG1 발기인 F 조이GFP 유전자에 직접 사용하거나, MPEG1 발기인이 kaede 유전자에 융합 Gal4 인식 순서 (UAS, 상류 순서를 활성화)와 두 번째 transgene 활성화 효모 Gal4 전사 인자의 표현을 드라이브 두 구성 요소가 시스템을 사용합니다. 혈액 섬 주입 (프로토콜 5; 그림 1A)이 때 제대로 수행되면 박테리아는 즉시 혈액 순환을 통해 흐름과 배아에 걸쳐 분산됩니다. 비교적 크고 밝게 형광 DS-RED 분류 S. 보급 typhimurium 박테리아는 많은 세균이 형광 macrophages (그림 3B-C)에 의해 phagocytosed되는 두 hpi 쇼에서 스테레오 형광 현미경 (그림 3A) 및 공촛점 이미징과 직접 몇 군데하실 수 있습니다. 야생 유형 S. 중 최소 25 cfu의 주입 typhimurium 박테리아가 치명적인 감염을 초래할 것입니다 한동안 avirulent s의 박테리아와 비슷한 복용같은 라스와 같은 열차는, 태아의 면역 체계 3 지워 수 있습니다. 250 cfu의 주입 선량은 S.로 transcriptional 응답을 결정하는 데 사용되었다 zebrafish 배아 및 typhimurium 감염이 강한 프로 염증성 유전자 발현 반응 15 유도를 보여주었다. 엠의 대조적으로, 정맥 주사 marinum 박테리아는 강력한 프로 염증 반응을 유도하지만, 감염된 macrophages는 결핵 2의 특징입니다 granulomas의 초기 단계로 간주됩니다 꽉 집계를 형성 지속적인 감염에 이르게하지 않습니다. DPI는 mCherry-레이블 엠의 세포 성장을 보여주는 5 시에 gl22 라인 14 : TG 이러한 granuloma 같은 집계 (EGFP MPEG1)의 공촛점 이미징 marinum 박테리아 녹색 형광 macrophages 내부 (그림 3D-E).

OT감염의 그녀 노선은 다른 용도로 유용합니다. 박테리아는 macrophages의 찾아볼 수없는 구획은 32 hpf (그림 1C)에서 hindbrain의 뇌실에 주입 할 수 있습니다. 20-100 mCherry-레이블 엠의 분사 이 구획에 marinum 박테리아는 박테리아를 (그림 4A) phagocytose macrophages에 의해 급속한 침투로 안내합니다. 타고난 면역 세포의 이동 마이 그 레이션을 공부하는 또 다른 방법은 꼬리 근육 (그림 1D)로 박테리아의 주사입니다. 그러나 꼬리 근육 주사는 또한 자체적으로 leukocytes의 일부 매력 elicits되는 조직 손상의 원인이됩니다. 신중하게 귀의 소포 (그림 1E)로 작은 볼륨 (0.5-1 NL)를 주입했을 때 이러한 남긴 상처 응답 피할 수 있습니다. i114 라인 16, S.의 약 20 cfu의 주입 :으로 TG를 (EGFP mpx)를 사용하여 여기에 표시 귀의 소포로 typhimurium은 3 hpi에 neutrophils의 매력에 이르게 ( (그림 4E)에서 관찰되지 않는 동안. leukocytes에 의한 침투에 강한 것 같습니다 notochord은, M.의 성장을위한 허용 구획이다 다른 조직 7에 주입했을 때 강력하게 감쇠 있습니다 marinum의 돌연변이, (그림 4 층). M.의 마지막으로, 초기 주입 배아의 노른자로 marinum는 전신 감염을 달성하기위한 대체 방법을 제공합니다. 우리는 일반적으로 16 세포 단계 (그림 1G) 주변이 주사를 수행하지만, 노른자로 세균 주사도 (최대 1,000 세포 단계까지) 나중 단계에서 수행될 수도 있고, 초기 (1-8 세포 단계)에 대한 공동 주사 morpholinos 8. 20-40 cfu, M의 복용량에 따라 노른자 분사 marinum 박테리아는 기존 따라 관찰 유사 배아 조직과 형태 granuloma 같은 집계로 며칠에 걸쳐정맥 주사 방법 8, (그림 4G). 노른자 주입 방법은 S. 위해 적당하지 않다 typhimurium 감염이 있기 때문에 노른자에서의 급속한 성장은 초기에 보여 주죠을 초래합니다. M. 대한 노른자 감염 방법 그것은 사출 로봇 8을 사용하여 자동화할 수 있기 때문에 marinum 감염은 높은 처리량 어플 리케이션에 유용합니다.

그림 1
1 그림. 빠른 전신 감염을 설립 zebrafish 배아에서 전신 또는 현지 감염을 구축에 사용되는 분사 방식의 개요. (AB) 정맥 주사는 1 dpf ()에서 사후 혈액 섬이나 Cuvier의 덕트에에 꼬리 정맥에 수행됩니다 2-3 dpf (B). (CE) 대식 세포와 호중구 chemotaxis을 공부에 대한 지역 주사는 1 dpf (C)에서 hindbrain의 뇌실로 수행됩니다, 1-2 dpf (D) 또는 2-3 dpf (E)에 귀의 소포에 꼬리 근육. (F) phagocytes에 확실히 액세스할 감염을 만드는 주입은 1-2 dpf에서 notochord으로 수행됩니다. (사) 주입은 M. 같은 느린 성장하는 박테리아에 일찍 체계적 감염을 만드는 방법 marinum는 16-1000 세포 단계에서 노른자로 수행할 수 있습니다. 모든 이미지는 Leica DFC420 카메라 (Leica 10,446,307 0.8x)에 연결된 Leica M165C, PLANAPO 1.0x로 찍은되었다.

그림 2
그림 2. 헤어 루프 도구입니다. 머리카락 조각은 파스퇴르 피펫의 개통으로 루프로 삽입 강력 접착제로 또는 Tipp - 전직과 장소에서 해결되었습니다. 이것은 부드럽게 연약한 zebrafish의 배아를 조작을위한 편리한 도구를 제공합니다.

그림 3
그림 3. 의 정맥 주사적색 형광 살모넬라균 typhimurium과은 Mycobacterium marinum. DS-RED-라벨 S. typhimurium SL1027 박테리아 (AC)와 mCherry-라벨 M. gl22 (DE) zebrafish의 배아는 28시 : s1999t (AC) 또는 TG (EGFP MPEG1) : TG (Kaede UAS-E1b); gl24 : marinum Mma20 박테리아 (DE)은 TG의 혈액 섬 (Gal4-VP16 MPEG1)에 주입했다 hpf. S.의 보급을 보여주는 () 스테레오-형광 밝은-필드 오버레이 이미지 이 hpi (Leica DFC420C 카메라 Leica MZ16FA 현미경)의 혈액 순환에 typhimurium. 붉은 S.을 보여주는 (BC) 공촛점 Z-스택 전망 typhimurium 박테리아 2 hpi (Leica TCS SPE, HCX APO 목표 40x 0.8 NA)에서 녹색 macrophages에 의해 phagocytosed. 아직 세포가 박테리아도 볼 수 있습니다. M.을 포함 granuloma 같은 집계를 보여주는 (D) 공촛점 Z-스택 투영 5 DPI (Leica TCS SPE, HCX APO 40x에서 marinum Mma20에 감염된과 감염되지 않은 macrophages0.8 NA). 빨간색에서 녹색 박테리아의 Macrophages. 세포내 M으로 개별 대식 세포의 (E) 공촛점 Z-스택 투영 (녹색) marinum 박테리아 (빨간색). 흰색 직사각형으로 D에 그려진 지역은 높은 배율 목표 (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1.2 NA)로 몇 군데했습니다. Scalebars : 20 μm의.

그림 4
4 그림. zebrafish 배아의 감염에 대한 대체 경로. () mCherry-라벨 M. marinum Mma20 박테리아는 32 hpf에서 hindbrain의 뇌실에 주입했다. 형광 및 5 hpi (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA)에서 macrophages에 의해 phagocytosed mCherry-라벨이 박테리아를 보여주는 전송 오버레이 이미지입니다. (B) S. typhimurium은 1 dpf에서 꼬리 근육에 주입되었다. 주사 사이트 (흰색 동그라미)에 골수양 세포의 매력은 F로 3 hpi에 표시됩니다(C) uninjected 배아 반면이 형태학의 사이트에 전혀 골수양 세포가 정상적 없습니다 원위치 하이브리드화 4에서 luorescent. 배아는이 단계에서 성숙 neutrophils가 포함되어 있지 않지만, 골수양 세포의 두 집단을 구분할 수, 호중구 마커 mpx (녹색) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x을 표현 대식 세포 마커 mfap4 (적색)와 하나를 표현 한 0.3 NA). 박테리아의 형광은 원위치 하이브 리다이 제이션 절차 후 손실됩니다. (D) DS-RED-라벨 S. 이 dpf에서 i114 zebrafish : typhimurium 박테리아는 TG의 귀의 소포 (EGFP mpx)에 주입했다. EGFP 분류 neutrophils 전지 3 hpi에 감염된 귀의 소포 (점선 타원)에게 매력을, (E) TG의 귀의 소포로 PBS를 제어 분사 반면 (mpx 있습니다 : EGFP 스테레오-형광 밝은-필드 오버레이 이미지 mpx는 것을 보여줄 ) i114 zebrafish은 감염되지 않은 귀의했는지으로 neutrophils의 매력을 보여주지 않는다sicle (점선 타원) (Leica DFC420C 카메라와 Leica MZ16FA). (F) M. mCherry-라벨 감쇠 E11 eccCb1 :: TN 돌연변이 스트레인 17 marinum 균은 1 dpf에서 notochord으로 주입되었다. notochord 내부 확산은 5 DPI (DC500 카메라 Leica MZ16FA 현미경)에 몇 군데했습니다. (사) M. mCherry-라벨 혈액과 림프 혈관의 내피 세포에 GFP를 표현 라인 : marinum E11 박테리아는 TG (EGFP fli1a)의 16 세포 단계 zebrafish의 배아의 노른자로 주입되었다. 꼬리 지역에 감염된 세포의 granuloma 같은 집계의 형성은 5 DPI에서 관찰된다 (Leica DFC420C 카메라와 Leica MZ16FA 현미경, 이미지를 8 일부터).

Discussion

이 문서에서 설명하는 감염 방식은 주로 호스트 타고난 면역 유전자 또는 세균성 독성 유전자 하나의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 정맥 마이크로 주입 방법 (프로토콜 5, 6.1)과 같은 공부를 가장 자주 사용됩니다. 사후 혈액 섬의 꼬리 정맥은 1 일 된 배아의 정맥 주사를위한 가장 편리한 위치입니다. 꼬리 정맥 나중 단계에서 침투하기가 더 어려워집니다로서 2-3 dpf에서 배아의 정맥 주사 사이트로 Cuvier의 덕트를 선호합니다. 모든 경우에 그것은 cfu의 계산을위한 도금 사출 inocula으로 선택되어야 박테리아의 일관성있는 번호로 배아를 주입하는 것이 중요합니다. 다음과 같은 측면 재현할 주사를 달성하기 위해 고려되어야합니다. 첫째, 이것은 고품질의 유리 microcapillary 주사 바늘을 가지고 필수적입니다. 바늘 끝이 너무 클 경우 주사가 발생하는 출혈을 위해 충분히 큰 바늘 구멍을 만들 것입니다주입된 박테리아가 혈액 순환의 돈은 절대 나오지 않습니다. 둘째, 박테리아는 혈액 순환에 직접 주입해야합니다. 바늘 끝은 난황 확장으로 분사 유체 확산 정맥 안쪽 아니면되지 않으면 배아는 실험에서 폐기되어야합니다. 셋째, M. 주입을위한 캐리어로 PVP40를 사용하여 marinum은 유리 바늘에 가라앉고에서 세균을 방지에 도움이 될 것입니다. PVP40 주사 기간에 걸쳐 더 재현할 inocula 그 결과 현탁액의 균질성 향상됩니다. PVP40 또한 S. 위해 사용될 수있다 큰 크기와 박테리아의 밝은 형광이 실험 중에 분사 inoculum 이상의 시각적 제어를 허용하기 때문에 typhimurium 주사하지만, 여기서는 덜 중요하다. 주사 연습을 위해 우리는 페놀 붉은 염료 (1 % V / V) 또는 1 μm의 다양한 색상 (Invitrogen)에서 사용 가능한 형광 분야의 사용을 권장합니다. 기술이 마스터되면, 그것은 약 30 minut 소요초밖에는 아가로 오스 플레이트에 배아를 정렬하고 세균성 사출 볼륨을 조정하는 데 필요한 시간을 포함하여 50-100 배아를 주입합니다.

혈액 섬 (프로토콜 5)로 또는 Cuvier (프로토콜 6.1)의 덕트로 정맥 주사가 가장 일반적으로 사용되고 있지만,이 비디오 문서에서 설명한 감염의 대안 노선 (프로토콜 6.2, 6.3 대식 세포 및 호중구 chemotaxis을 공부하는 데 유용 증명했습니다 및 6.4), 감쇠 박테리아 변종 (6.5 프로토콜)의 성장을 공부하고, 높은 처리량 어플 리케이션 (프로토콜 6.6) 4-8 대한 zebrafish 감염 모델을 적용할 수 있습니다. 설명 마이크로 사출 방법도 바이러스 18, 19, 곰팡이 포자 14, 20, protozoan의 기생충 (마리아 Forlenza, 개인 커뮤니케이션)의 주사에 대해 적용할 수 있습니다. 이 비디오 문서에서 설명하는 분사 절차에 유용한 첨가 zebr로 박테리아의 피하 주입에 대해 최근에 설명된 절차입니다금부어의 배아 21. 이 절차는 조직 표면에 효율적으로 빨아들이다 세균을 찾았으나되었다 neutrophils에 의한 세균의 phagocytosis를 공부하기 위해 적용되었다 macrophages과는 달리, 혈액 또는 외부로 유체가 노니는 신체 충치로 주입시 박테리아를 phagocytose 것이 거의 없었습니다. 피하 주사의 배아이 동영상에 대한 문서에서 설명한 꼬리 근육 주사 용과 비슷한 위치되지만, 바늘은 체절을 통해 박테리아를 주입하기 위해 단지 피부 아래에 삽입됩니다.

그것은 마이크로 사출은 본질적으로 감염의 인위적인 경로는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 그러나, 초기 배아는 세균성 병원체에 대한 외부 노출에 매우 저항력이 있습니다. 실제로 태아가 세균 현탁액 목욕을하고 침지 assays는 우리 손에 22 재현할 수 없습니다. 일부 배아는 침수시 감염 될 수 있지만, 우리는 사망률 요금과 특급에 큰 변화를 관찰했습니다이러한 assays에서 개별 배아 간의 염증 마커 유전자의 이온. 이 문서에서 설명하는 마이크로 사출 방법은 재현성 감염을 달성하며 호스트 타고난 면역 세포와 세균의 상호 작용을 연구하는 데 특히 유용합니다. 각각의 배아에서 세균 감염을 계량하기위한 효율적인 접근법은 맞춤 전용 픽셀 부량 소프트웨어 17, 23에 감염된 태아의 형광 이미지를 분석하는 것입니다. 이 접근법은 감염된 태아의 도금 후 cfu 카운트의 결과와 잘 상관 관계를 보여왔다. 마찬가지로 태아 당 백혈구 수치의 상대적인 변화는 유전자 변형 백혈구의 형광단 기자 라인의 디지털 이미지 분석에 의해 계량되어,이 방법은 감염 24 호스트 leukopoietic 응답을 quantifying에 적용되는 것입니다.

호스트 타고난 면역 유전자의 기능을 설명하는 감염 모델을 결합하여 생체내에 효율적으로 조사 수morpholino를 최저로. Morpholinos 특정 RNAs을 타겟으로하고이 저널 10, 25의 다른 동영상 기사와 같이 1-세포 단계 zebrafish의 배아에 주입하면 유전자 제품의 표현을 줄이고 합성 안티 센스 oligonucleotides입니다. morpholino의 최저 연구에서는 비교되는 모든 배아 그룹이 세균 주사 이전 올바르게 개최되는 매우 중요합니다. 배아는 시간이 지남에 따라 점차 유능한되는 개발 면역 체계를 가지고 있기 때문에 이것은 특히 중요합니다.

zebrafish 배아의 주요 타고난 면역 하위 집합, macrophages와 neutrophils를 구분하는 현재 사용할 수있는 여러 가지 유전자 변형 기자 라인이 있습니다. mpx 및 lyz의 발기인은 호중구 기자 노선 16, 26, 27을 생성하는 데 사용되었으며 csf1r (FMS)과 MPEG1 발기인은 대식 세포 기자에게 14, 28, 생산하는 데 사용되었다. 동안 csf1r (FMS)가 추가 xanthophores로 표현되며, MPEG1 표현이 macrophages에 독점적이다. 이 동영상을 문서에 나타난 바와 같이, 최근에 개발된 MPEG1 기자 라인 macrophages에 의해 영상 세균성 phagocytosis에 대한 매우 유용합니다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자 물고기 보호를위한 그림 4, Ulrike Nehrdich 및 데비 드 위트의 이미지 및 유용한 토론을 위해 다른 연구실 회원, 차오의 Cui에게 감사 층 드 Kort, 에스더의 웅크리다과 랄프 카르 발료주세요. 이 작품은 경제의 네덜란드 사역의 스마트 믹스 프로그램과 교육, 문화, 과학, 유럽위원회 일곱째 프레임 워크 프로젝트 ZF-건강 (보건-F4-2010-242048), 유럽 마리 퀴리의 교육부에 의해 지원됩니다 초기 교육 네트워크 FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), 그리고 호주 NHMRC (637394)에 의해. 호주의 재생 의료 연구소는 빅토리아와 호주 정부의 주 정부의 보조금에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

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References

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면역학 이슈 61 Zebrafish의 배아 타고난 면역 macrophages 감염 살모넬라,은 Mycobacterium 마이크로 사출 형광 이미징,
세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염
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Benard, E. L., van der Sar, A. M.,… More

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

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