Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Infeksjon av sebrafisk embryo med intracellulære bakterier

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Transparente sebrafisk embryoer har vist seg nyttige modell verter å visualisere og funksjonelt studere samspillet mellom medfødte immunceller og intracellulære bakterier, for eksempel

Abstract

Sebrafisk (Danio rerio) embryoer blir stadig mer brukt som modell for å studere funksjonen av virveldyr medfødte immunforsvaret i host-patogen interaksjoner 1. De viktigste celletyper i det medfødte immunforsvaret, makrofager og nøytrofile, utvikler i løpet av de første dagene av embryogenese før modningen av lymfocytter som er nødvendige for adaptive immunresponser. Den enkle å skaffe store mengder embryoer, deres tilgjengelighet på grunn av ytre utvikling, optiske åpenhet av embryonale og larvestadiet, et bredt spekter av genetiske verktøy, omfattende mutante ressurser og samlinger av transgene reporter linjer, alle legge til allsidighet av sebrafisk modell. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) og Mycobacterium marinum kan ligge intracellulært i makrofager og er ofte brukt for å studere host-patogen interaksjoner i sebrafisk embryoer. De infeksjon prosesser av disse tobakterielle patogener er interessant å sammenligne fordi S. typhimurium infeksjon er akutt og dødelig i løpet av en dag, mens M. marinum infeksjon er kronisk og kan avbildes opp til larvestadiet 2, 3. Stedet for mikro-injeksjon av bakterier inn i embryoet (Figur 1) avgjør om smitten vil raskt bli systemisk eller vil i utgangspunktet forbli lokalisert. En rask systemisk infeksjon kan etableres ved mikro-injisere bakterier direkte inn i blodsirkulasjonen via kaudal blodåre i bakre blod øya eller via Duct av Cuvier, et bredt sirkulasjon kanal på plommesekken kobler hjertet til stammen blodkar. På en DPF, når embryo på dette stadiet har phagocytically aktive makrofager men nøytrofile har ennå ikke modnet, injisere inn i blodet øya foretrekkes. For injeksjoner med 2-3 DPF, når embryo også har utviklet funksjonelle (myeloperoxidase-produserende) nøytrofile, den Duct av Cuvier foretrekkes som than injeksjonsstedet. Å studere rettet migrering av myeloide celler mot lokale infeksjoner, kan bakterier bli injisert i halen muskelen, otic vesikkel, eller hindbrain ventrikkel 4-6. I tillegg ryggstreng, en struktur som synes å være normalt utilgjengelig for myeloide celler, er svært utsatt for lokal infeksjon 7. Et nyttig alternativ for høy gjennomstrømning er injeksjon av bakterier i plommen av befruktede egg innen de første timene etter befruktning 8. Kombinere fluorescerende bakterier og transgene sebrafisk linjer med selvlysende makrofager eller nøytrofile skaper ideelle forhold for multi-farge avbildning av host-patogen interaksjoner. Denne videoen artikkelen vil beskrive detaljerte protokoller for intravenøs og lokal infeksjon av sebrafisk embryoer med S. typhimurium eller M. marinum bakterier og for påfølgende fluorescens avbildning av interaksjonen med cellene i det medfødte immunsystemet.

Protocol

1. Forbered injeksjonsnåler

  1. Forbered borsilikatglass microcapillary injeksjonsnåler (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm OD × 0,78 mm ID) ved hjelp av en mikropipette avtrekker enhet (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown p-97 med følgende innstillinger for en lengre tips: lufttrykk 400; varme 610, pull 40; hastighet 50; tid 30 og med følgende innstillinger for en kortere tips: lufttrykket 500, varme 510, pull 100; hastighet 200; tid 60).
  2. Bryt av nålespissen med fine pinsett for å få et tips åpning diameter på 5-10 mikrometer. Det er tilrådelig å bevel nålespissen åpningen i en 45 graders vinkel med en microgrinder (Narishige Inc., EG-400) for å gi et skarpere tips. Dette vil lette punktering av epidermal laget og dermed resultere i mer reproduserbar injeksjoner med mindre vevsskade enn med butte nåler. Lengre tipped nåler er å foretrekke for kaudal vene (trinn 5) og Duct av Cuvier (trinn 6,1) injeksjoner og kortere tipped nålerer foretrukket for de andre injeksjon protokoller (trinn 6.2-6.6).

2. Forbered S. typhimurium podestoff

  1. Plate ute S. typhimurium fra en -80 ° C glyserol lager på LB agar plater (med passende antibiotika å velge for fluorescens uttrykk vektorer) og inkuber natten ved 37 ° C.
  2. Plukk individuelle fluorescently positive kolonier og resuspender dem til ønsket konsentrasjon (se protokoller 5 og 6) i sterile fosfat-bufret saltvann (PBS), eventuelt som inneholder 0,085% (v / v) fenol rødt (Sigma-Aldrich) for å hjelpe visualisering av injeksjon prosess. Direkte bruke fersk suspensjon for injeksjon eller forberede glyserol aksjer. For å forberede glyserol aksjer, spinne ned nystekte injeksjon lager med ønsket konsentrasjon av bakterier og konsentrere aksjen ved resuspending pelleten i halve start volumet i sterile 20% (v / v) glyserol (Sigma-Aldrich) i PBS. Oppbevar glyserol aksje på -80 ° C. Fortynn glyserol lager 1:1 (v / v) før injeksjon i steril PBS, eventuelt som inneholder 0,17% fenol rødt.
  3. Vortex bakteriell suspensjon godt for å unngå klumper.
  4. Legg podestoff i microcapillary nålen med en microloader tips (Eppendorf, 5242956.003).
  5. På grunn av den relativt store størrelsen S. Typhimurium bakterier og deres lyse DS-RED fluorescens når du bruker pGMDs3 uttrykk vektor 3 (belastning tilgjengelig på forespørsel), kan individuelle bakterieceller lett bli regnet med en fluorescens stereomikroskop for å sette injeksjonen dose. For dette formål, injisere en nL inn en dråpe PBS på en agar plate, telle fluorescerende bakterier, og beregne injeksjonsvolum som kreves for å oppnå den ønskede bakteriell dose (fortrinnsvis holde injeksjonsvolum mellom 1-2 NL). Injiser embryoene med S. typhimurium via den valgte ruten (se protokoller 5 og 6).

3. Forbered

  1. Hold M. marinum belastning vokser på Difco Middlebrook 7H10 agar (BD og selskap) supplert med 10% oljesyre-albumin-dekstrose-katalase (OADC, BD og selskap), 0,5% glyserol, og med passende antibiotika å velge for fluorescens uttrykk vektorer (stammer tilgjengelige ved forespørsel 9), så det er alltid en frisk lager.
  2. Plukk en koloni av M. marinum og resuspender det i Difco Middlebrook 7H9 kjøttkraft (BD og selskap) supplert med 10% albumin-druesukker-katalase (ADC, BD og selskap) og 0,05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) og de ​​aktuelle antibiotika. Sjekk at den optiske tettheten (OD) ved 600 nm er 0,2 til 0,3 og la det vokse statisk overnatting på 28,5 ° C. Den generasjonen tid M. marinum er ca 4-6 timer, varierende etter belastningen.
  3. Mål OD ved 600 nm igjen den dagen injeksjoner. En OD600 av en tilsvarer ca 10 8 M. marinum / ml(Dette kan variere i henhold til bakteriestammen brukt og derfor bør være basert på en vekstkurve for den aktuelle belastning).
  4. Høste bakteriene når de er i logaritmisk fase (ikke la den OD600 overstige 1,00) ved sentrifugering og vaske dem tre ganger i sterile PBS.
  5. Mål OD600 igjen av bakteriell suspensjon i PBS, spinne ned, og resuspender bakteriene til ønsket konsentrasjon (se protokoller 5 og 6) i PBS eller 2% Polyvinylpyrrolidone (PVP40) i PBS (w / v), som forbedrer homogenitet av bakteriell suspensjon. Fenol rødt (Sigma-Aldrich) kan legges til en konsentrasjon på 0,085% til hjelp visualisering av injeksjon prosessen. Direkte bruke fersk suspensjon for injeksjon eller forberede glyserol aksjer. For å forberede glyserol aksjer spinne ned nystekte injeksjon lager med ønsket konsentrasjon av bakterier og konsentrere aksjen ved resuspending pelleten i halve start volumet i sterile 20% glyserol i PBS. Oppbevar glycErol lager ved -80 ° C. Fortynn glyserol lager 1:1 (v / v) i sterile PBS, eventuelt som inneholder 4% PVP40 og / eller 0,17% fenol rødt.

4. Forbered sebrafisk Embryoer til injeksjonsvæsker

  1. Sett opp sebrafisk hekkende par og samle embryo som vist i en annen video artikkel 10. Hold embryo i en petriskål fylt med egg vann (60 mikrogram / ml Hav salter;. Ca 60 embryo / oppvask) og inkuber ved 28,5 ° C.
  2. Om nødvendig, legg 0,003% N-Phenylthiourea (PTU, Sigma-Aldrich) til egget vannet når embryoene er ca 12 HPF å hindre melanization.
  3. Rundt 24 timer etter befruktning (HPF), dechorionate embryoene med fine pinsett (Fin Science Tools Inc., Dumont # 5 tang - Inox biologi.
  4. Hold embryoene i en petriskål fylt med egg vann og med et lag på 1% agarose på bunnen for å hindre at fostre fester seg til plast.
  5. Anesthetize embryoene med 200 mikrogram / ml bufret 3-Aminobenzoic syre (Tricaine, Sigma-Aldrich) ca 10 min før injeksjoner.

5. Intravenøs injeksjon av bakterier i en-dags gamle embryo

  1. Stage embryoene ved 28 HPF 11 ved å sjekke for konsekvent blodsirkulasjon, begynnelsen av pigmentering i øyet, en rett hale, og hjertet blir plassert bare ventrally for øyet.
  2. Anesthetize embryoene, se trinn 4.5.
  3. Legg nålen med bakteriell podestoff med en microloader tips.
  4. Monter loaded nålen på en micromanipulator (Sutter Instrument, MM-33) koblet til et stativ (World presisjonsinstrumenter, M10L magnetisk fot) og plassere den under en stereo mikroskop (Leica M50, Akromat 1x objektiv 0,15 NA, overføres lys basen TL ST). Sett injeksjon tid til 0,2 s og kompensasjon trykket til 15 hPa (Eppendorf, Femtojet). Juster injiseringstrykk mellom 700 og 900 hPa å få riktig injeksjonsvolum for nålenbrukt. Juster dråpestørrelse for å matche den ønskede diameter ved hjelp av en skala bar på et objektglass eller i okulær. For størrelse besluttsomhet fallet kan injiseres i mineralolje på et objektglass, eller størrelsen kan estimeres ved å injisere i luften, som forlater dråpen som henger på nålespissen. Radius av en dråpe en nL er 0.062 mm (V = 4/3 π r 3).
  5. Sett micromanipulator med ladd nålen inn i riktig posisjon før injisering (dvs. ca i 45 ° vinkel i forhold til injeksjon plate overflate) og bare flytte den frem og tilbake å injisere.
  6. De anesteserte Embryoene pipetteres på en flat 1% agarose sprøytebruk plate og overflødig egg vann er fjernet, slik at overflatespenningen å holde embryoene på plass i løpet av injeksjoner. Bruk et hår sløyfe verktøy (figur 2) til å stille opp embryoene. Orient injeksjonen plate med hånden under injeksjoner å plassere embryoene inn ønsket posisjon for inserting nålen, dvs. med halene pekende mot nålespissen.
  7. Plasser nålespissen rett over kaudal blodåre nær urogenitale åpning (figur 1A), pierce periderm med nålespissen og injisere ønsket dose av bakterier, vi bruker ca. 250 cfu av S. typhimurium villtype (wt) belastning SL1027, inneholder DS-RED uttrykk pGMDs3 vektor, og ca. 120 cfu av M. marinum belastning Mma20. Den injiserte bakteriell suspensjon vil følge blodstrømmen gjennom kaudal blodåre til hjertet. Overvåk hvis injeksjonen ble utført korrekt ved å se etter en voksende volumet av karsystemet direkte etter pulsen to. For dose-respons forsøk, kan 2-3 sammenhengende injeksjoner utføres uten utpakking nålen.
  8. Ofte kontrollere at injeksjonsvolum forblir den samme under forsøket. Å gi en kontroll for konsistensen av injeksjonene hele eksperimentet, injisere en DROp av bakterier direkte inn i en steril PBS dråpe på bakterievekst medium etter ca hver 30. embryo injeksjon. Plate ut denne dråpe og tell bakterie kolonier etter inkubering å bestemme koloni dannende enheter (CFU) i injeksjonsvolum.
  9. Bruk en fluorescens stereomikroskop (protokoll 7) for å observere enkelte fluorescerende S. Typhimurium celler som sirkulerer i blodet rett etter injeksjon, og kast embryoer som ikke er riktig injisert. Individuell fluorescerende M. marinum bakterier ikke kan observeres av stereo fluorescensmikroskopi rett etter injeksjoner, men fluorescerende aggregater av infiserte cellene skal være synlig ved to dager etter smitte (dpi) og vokse seg større over tid.

6. Alternative Ruter på infeksjon

  1. Duct av Cuvier injeksjon: line up anesteserte embryoer (2-3 DPF) på et flatt 1% agarose injisering plate som for kaudal vein injeksjoner (se 5.6). Orienter injisereion plate hånd under injeksjoner plassere embryoene inn i ønsket posisjon for innsetting av nålen, dvs. diagonalt under en 45 ° vinkel slik at Duct av Cuvier kan bli kontaktet av nålespissen fra dorsal siden av embryoet (Figur 1B) . Sett nålen inn i startpunktet for Duct av Cuvier bare dorsal til stedet der kanalen starter utvidelsen over plommesekken og injisere 100-200 bakterier (1-3 NL). Injeksjonen er riktig hvis volumet innenfor kanalen utvider rett etter puls og plommesekken er ikke sprukket. Som for kaudal vein injeksjoner (se 5.7), kan flere påfølgende injeksjoner utføres uten utpakking nålen.
  2. Hindbrain ventrikkel injeksjon: line up anesteserte embryoer (32 HPF) på et flatt 1% agarose injisere plate slik at embryoene er plassert med sin dorsal side mot nålespissen. Sett nålen inn i hindbrain ventrikkelen fra en fremre posisjon uten å berøre neuroepithelium (figur 1C) og injiserer 20-100 bakterier (0,5-1 NL). For å øve prosedyren, bruke et fluorescerende fargestoff (som Texas-Rød Dextran) som vist i en annen video artikkel 13.
  3. Tail muskel injeksjon: Stilling anesteserte embryoer (1-2 DPF) som for kaudal vein injeksjoner (se 5.6). Juster micromanipulator med ladd nålen til en vinkel på ca 65 ° i forhold til injeksjon plate overflaten. Injiser en bakteriell suspensjon (0,5-1 nL) inneholder 20-50 cfu inn i muskelen over urogenitale åpning (figur 1D) uten å forårsake skade på ryggstreng eller blodkar.
  4. Otic vesicle injeksjon: Stilling anesteserte embryoer (2-3 DPF) som for kaudal vein injeksjoner (se 5.6). Juster micromanipulator med ladd nålen til en vinkel på ca 65 ° i forhold til injeksjon plate overflaten. Injiser ca 20 bakterier (0,5 NL) i otic vesikkel (figur 1E) med lav trykkure å unngå lokale vev ruptur.
  5. Ryggstreng injeksjon: line up anesteserte embryoer (1-2 DPF) på et flatt 1% agarose injisere plate slik at embryoene er plassert med halen pekende vekk fra nålespissen. Stikk nålen gjennom halen muskelvev i ryggstreng (figur 1F) og injisere ca 20-50 bakterier (maksimal 0,5 NL). Pass på ikke å injisere for mye volum for å unngå ruptur av ryggstreng.
  6. Eggeplomme injeksjon: posisjonsdata egg inneholder embryo på 16-1000 celle scenen på en 1% agarose injisere plate med rektangulære eller V-formede kanaler laget med en kanal mugg 12 eller online på http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Pierce nålen gjennom chorion inn til sentrum av eggeplomme (figur 1G) og injisere 20-40 bakterier (1-2 NL). Bruken av 2% PVP40 transportør løsning for bakteriell suspensjon (se trinn 3.5)er viktig å forebygge tidlig bakteriell spredning til fosteret.

7. Stereo Imaging av infeksjonen

  1. Anesthetize de infiserte embryoene i en 1% agarose lagdelt petriskål dekket med egg vann som inneholder Tricaine (se 4.5).
  2. Rett embryoene i riktig posisjon for avbildning under et fluorescens stereo mikroskop med en hår sløyfe verktøy (Figur 2). Før svømmeblæren har oppblåst (1-5 DPF), vil embryoene ligge flatt på sine sider slik at sideutsikt bildebehandling.
  3. Hvis en annen posisjon enn den laterale syn er nødvendig, monter embryoene i 1,5% metyl cellulose. Manipulere embryoet inn i ønsket posisjon med en hår sløyfe verktøy (Figur 2).
  4. Returner embryoene egg vann etter bildebehandling.

8. Confocal Imaging av infeksjonen

  1. Plasser en dråpe lavt smeltepunkt agarose (Lonza Inc., 1,5% (w / v) i egg vann) på glasset bunnen av enWillCo-antenne (WillCo Wells, GWSt-5040) hvis en omvendt confocal mikroskop brukes, eller på en enkelt hulrom depresjon lysbilde (Agar Scientific, L4090) hvis en stående confocal mikroskop brukes.
  2. Plasser bedøvet embryoet inn i agarose dråpe med begrenset mengde egg vann og manipulere embryoet på plass med en hår sløyfe verktøy (Figur 2). Når du bruker en invertert mikroskop er det viktig at fosteret er regionen i området er flatt mot glasset bunnen av bildebehandling parabolen. En oppreist mikroskop kan brukes i kombinasjon med vann nedsenking eller langdistanse tørre mål og embryoet bør plasseres slik at regionen i området er så nær målet som mulig.
  3. La agarose stivne og senk agarose dråpe i egg vann tilsatt Tricaine (se 4.5). Dersom en oppreist mikroskop brukes, plasserer en glass dekkglass på toppen av depresjon hulrom (ikke la luftboblene til å danne).
  4. Sekvensielt erverve influensaorescence og overføring bilder.
  5. Fjern forsiktig agarose fra embryoet med fine pinsett og legg embryoet tilbake i egg vann hvis det er nødvendig for videre eksperimenter.

9. Representative Resultater

Injeksjon av Salmonella typhimurium eller Mycobacterium marinum bakterier i blodet øya embryoer ved 1 DPF resultater i rask fagocytose av makrofager. Den MPEG1 genet er nylig blitt identifisert som en trofast markør av embryonale makrofager, colocalizing med den veletablerte macrophage markør csf1r (FMS) og ikke overlapper med nøytrofile markører som MPX (MPO) og 4 lyz, 14. For levende bilder av bakteriell fagocytose brukte vi transgene linjer der MPEG1 arrangøren driver fluorescerende protein uttrykk i makrofager 14. Disse transgene linjer enten ha MPEG1 promoter fbrukes direkte til GFP-genet, eller ansette en to-komponent system der MPEG1 promoter driver uttrykk av gjær Gal4 transkripsjonsfaktor som aktiverer en andre transgene med Gal4 anerkjennelse sekvensen (UAS, oppstrøms aktivere sekvens) smeltet til Kaede genet. Når blodet øya injeksjon (protokoll 5, figur 1A) er utført korrekt, vil bakteriene umiddelbart strømme gjennom blodsirkulasjonen og spredt over hele embryoet. Formidling av den relativt store og lyst fluorescerende DS-RED merket S. Typhimurium bakterier kan avbildes direkte med en stereo fluorescens mikroskop (figur 3A), og confocal bildebehandling ved 2 HPI viser at mange bakterier er phagocytosed av fluorescerende makrofager (Figur 3B-C). Injeksjon av så lite som 25 cfu av villtype S. Typhimurium bakterier vil resultere i en dødelig infeksjon, mens en tilsvarende dose av bakterier av en avirulent stog, slik som Ra, kan slettes ved embryonale immunsystemet tre. En injeksjon dose av 250 cfu ble brukt til å bestemme transcriptional svar på S. typhimurium infeksjon i sebrafisk embryo og demonstrerte induksjon av en sterk proinflammatorisk genuttrykk respons 15. I kontrast, intravenøs injeksjon av M. marinum bakterier ikke framprovosere ikke en sterk pro-inflammatorisk respons, men fører til en vedvarende infeksjon der infiserte makrofager danner tette aggregater som regnes som de første stadiene av granulomer, som er kjennemerket på tuberkulose to. Confocal avbildning av en slik granulom-lignende aggregat i Tg (MPEG1: EGFP) gl22 linje 14 på 5 dpi viser den intracellulære veksten av mCherry-merket M. marinum bakterier inne de grønne fluorescerende makrofagene (Figur 3D-E).

Othennes ruter på infeksjon er nyttige for ulike formål. Bakterier kan bli injisert i hindbrain ventrikkelen ved 32 HPF (figur 1C), som er en kupé blottet for makrofager. Injeksjon av 20-100 mCherry-merket M. marinum bakterier inn i denne avdelingen fører til rask infiltrasjon av makrofager som phagocytose bakterier (figur 4a). En annen metode for å studere rettet migrering av medfødte immunceller er injeksjon av bakterier i halen muskelen (figur 1D). Men hale muskel injeksjoner også forårsake vevsskade som i seg selv utløser noen tiltrekning av leukocytter. Et slikt sår respons kan unngås når nøye injisere et lite volum (0,5-1 nL) i otic vesikkel (figur 1E). Som vist her ved hjelp av Tg (MPX: EGFP) i114 linje 16, injeksjon av ca 20 cfu av S. typhimurium i otic vesicle fører til tiltrekningen av nøytrofile på tre HPI ( (Figur 4E). Den ryggstreng, som synes å være motstandsdyktig mot infiltrasjon av leukocytter, er en ettergivende rom for vekst av M. marinum mutanter som er sterkt svekket når injiseres i andre vev 7, (Figur 4F). Til slutt, tidlig injeksjon av M. marinum inn eggeplomme av befruktede egg gir en alternativ metode for å oppnå en systemisk infeksjon. Vi generelt utføre disse injeksjonene rundt 16 celle stadiet (figur 1G), men bakterielle injeksjoner i eggeplomme kan også utføres på senere stadier (opp til 1000 cellen scenen), eller tidligere (1 til 8 cellers stadiet) for co-injeksjoner med morpholinos 8. Etter eggeplomme injeksjon av en dose på 20-40 CFU, M. marinum bakterier spres over flere dager inn i embryonale vev og danner granulom-lignende aggregater ligner de som ble observert ved den konvensjonelleintravenøs injeksjon metode 8; (figur 4G). Den eggeplomme injeksjon metode er ikke egnet for S. typhimurium infeksjon, fordi den raske veksten i eggeplomme forårsaker tidlig dødelighet. Den eggeplomme infeksjon metode for M. marinum infeksjon vil være nyttig for høy gjennomstrømning ettersom det kan automatiseres ved hjelp av en injeksjon robot 8.

Figur 1
Figur 1. Oversikt over injeksjon metoder som brukes for å etablere systemiske eller lokale infeksjoner i sebrafisk embryoer. (AB) intravenøse injeksjoner for å etablere en rask systemisk infeksjon er utført i kaudal blodåre i bakre blodet øya på en DPF (A) eller i Duct av Cuvier på 2-3 DPF (B). (CE) Lokale injeksjoner for å studere macrophage og nøytrofile chemotaxis utføres i hindbrain ventrikkelen ved en DPF (C), Halen muskel 1-2 DPF (D) eller otic vesikkel på 2-3 DPF (E). (F) Injeksjoner med å skape en infeksjon tilsynelatende utilgjengelige for fagocytter er utført i ryggstreng på 1-2 DPF. (G) injeksjoner for å skape en tidlig systemisk infeksjon med langsom voksende bakterier som M. marinum kan utføres i eggeplomme på 16-1000 cellen scenen. Alle bildene ble tatt med en Leica M165C, PLANAPO 1.0x koblet til et Leica DFC420 kamera (Leica 10446307 0,8 x).

Figur 2
Figur 2. Hair sløyfe verktøy. Et stykke av menneskehår settes inn som en sløyfe inn i åpningen på en Pasteur pipette og festes med superlim eller med Tipp-Ex. Dette gir et praktisk verktøy for forsiktig manipulere skjøre sebrafisk embryoer.

Figur 3
Figur 3. Intravenøse injeksjoner avrød fluoriserende Salmonella typhimurium og Mycobacterium marinum. DS-RED-merket S. typhimurium SL1027 bakterier (AC) og mCherry-merket M. marinum Mma20 bakterier (DE) ble injisert i blodet øya Tg (MPEG1: Gal4-VP16) gl24; Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t (AC) eller Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) sebrafisk embryoer ved 28 HPF. (A) Stereo-fluorescens og lyse-feltet overleggsbildet viser spredning av S. typhimurium i blodsirkulasjonen ved 2 HPI (Leica MZ16FA mikroskopet med Leica DFC420C kamera). (BC) confocal z-stack framskrivinger som viser rødt S. Typhimurium bakterier phagocytosed av grønne makrofager ved 2 HPI (Leica TCS SPE, HCX APO objektiv 40x 0,8 NA). Bakterier som fortsatt ekstracellulært kan også observeres. (D) confocal z-stack projeksjon viser en granulom-lignende tilslag inneholder M. marinum Mma20-infiserte og ikke-infiserte makrofager ved 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0,8 NA). Makrofager i grønt og bakterier i rødt. (E) confocal z-stack projeksjon av en individuell makrofag (grønn) med intracellulære M. marinum bakterier (rød). Området avbildet i D av den hvite rektangelet ble fotografert med en høyere forstørrelse objektiv (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 mikrometer.

Figur 4
Figur 4. Alternative ruter for infeksjon av sebrafisk embryoer. (A) mCherry-merket M. marinum Mma20 bakterier ble injisert i hindbrain ventrikkelen ved 32 HPF. Fluorescens og overføring overleggsbildet viser mCherry-merkede bakterier phagocytosed av makrofager ved 5 HPI (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (B) S. typhimurium ble sprøytet inn i halen muskelen på en DPF. Attraksjon av myeloide celler til injeksjonsstedet (hvit sirkel) er vist på tre HPI ved fluorescent in situ hybridisering 4, (C), mens i uninjected embryoer er det normalt ingen myeloide celler på dette morfologiske nettstedet. Selv om embryoene ikke inneholder modne nøytrofile på dette stadiet, kan to populasjoner av myeloide celler skilles, en uttrykker macrophage markør mfap4 (rød) og en uttrykker nøytrofile markør MPX (grønn) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x 0,3 NA). Fluorescens av bakteriene er tapt etter at in situ hybridisering prosedyre. (D) DS-RED-merket S. Typhimurium bakterier ble injisert i otic vesicle av Tg (MPX: EGFP) i114 sebrafisk ved 2 DPF. Stereo-fluorescens og lyse-feltet overleggsbilder viser at MPX: EGFP merket nøytrofile celler er tiltrukket til den infiserte otic vesikkel (stiplet ellipse) på 3 HPI, (E), mens kontroll injeksjon av PBS i otic vesicle av Tg (MPX: EGFP ) i114 sebrafisk viser ikke tiltrekning av nøytrofile til infisert otic vesicle (stiplet ellipse) (Leica MZ16FA med Leica DFC420C kamera). (F) mCherry-merket M. marinum bakterier av svekket E11 eccCb1 :: tn mutert stamme 17 ble injisert i ryggstreng på en DPF. Proliferation inni ryggstreng ble fotografert på 5 dpi (Leica MZ16FA mikroskop med DC500 kamera). (G) mCherry-merket M. marinum E11 bakterier ble injisert i plommen av 16-celle stadium sebrafisk embryoer av TG (fli1a: EGFP) linje som uttrykker GFP i endotelceller i blod og lymfeårer. Dannelse av granulom-lignende aggregater av infiserte celler i halen regionen er observert ved 5 dpi (Leica MZ16FA mikroskopet med Leica DFC420C kamera; bilde fra 8).

Discussion

De infeksjon metodene som beskrives i denne artikkelen er ofte brukt for å studere funksjonen til verten medfødt immunitet gener eller bakteriell virulens gener 1. De intravenøse mikro-injeksjon metoder (protokoller 5 og 6.1) brukes oftest for slike studier. Den kaudal blodåre i bakre blodet øya er den mest passende sted for intravenøs injeksjon av 1-dag-gamle embryoer. Som kaudal venen blir vanskeligere å trenge gjennom på senere stadier, foretrekker vi Duct av Cuvier som intravenøs injeksjon området for embryoer med 2-3 DPF. I alle tilfeller er det avgjørende å injisere embryoer med konsekvente antall bakterier, som bør sjekkes av platekledning injeksjon inocula for cfu telling. Følgende forhold må vurderes for å oppnå reproduserbare injeksjoner. For det første er det viktig å ha høy kvalitet glass microcapillary injeksjonsnåler. Hvis nålen spissen er for stor, vil injeksjonen skape en punktering hull stort nok for blødninger kan forekomme ogden injiserte bakteriene vil strømme ut av blodsirkulasjonen. Dernest må bakterier injiseres direkte inn i blodsirkulasjonen. Hvis nålen spissen er ikke inne i venen eller om sprøyterom væske sprer inn plommesekken forlengelse, må embryoet kastes fra forsøket. For det tredje, ved hjelp PVP40 som en transportør for å injisere M. marinum vil bistå i å hindre bakterier fra å synke i glasset nål. PVP40 forbedrer homogenitet av suspensjonen, noe som resulterer i mer reproduserbar inocula hele varigheten av injeksjoner. PVP40 kan også brukes til S. Typhimurium injeksjoner, men her er det mindre viktig fordi større og lyse fluorescens av bakteriene gir en visuell kontroll over injeksjonen podestoff under eksperimenter. For å praktisere injeksjoner anbefaler vi bruk av fenol rødt fargestoff (1% v / v) eller 1 mikrometer fluoriserende kuler tilgjengelig i forskjellige farger (Invitrogen). Når teknikken er mestret, tar det ca 30 minutes å injisere 50-100 embryoer, inkludert tiden som kreves for å justere de embryoene på agarose plater og justering av bakteriell injeksjonsvolum.

Mens intravenøse injeksjoner i blodet øya (protokoll 5) eller i kanalsystem av Cuvier (protokoll 6.1) er mest brukt, har de alternative rutene for infeksjon er beskrevet i denne videoen artikkelen vist seg nyttig å studere macrophage og nøytrofile chemotaxis (protokoller 6.2, 6.3 og 6.4), for å studere vekst av svekkede bakteriestammer (protokoll 6.5), og å tilpasse sebrafisk smitte modell for høy gjennomstrømning (protokoll 6.6) 4-8. De beskrevne mikro-injeksjon metoder kan også brukes til injeksjon av virus 18, 19, soppsporer 14, 20 eller protozo parasitter (Maria Forlenza, personlig kommunikasjon). Et nyttig tillegg til de injeksjonsprosedyrer beskrevet i denne videoen artikkelen er en nylig beskrevet prosedyre for subkutan injeksjon av bakterier i zebrafish embryoer 21. Denne prosedyren ble brukt til å studere fagocytose av bakterier ved nøytrofile, som ble funnet å effektivt sluker bakterier på vev flater, men i motsetning til makrofager, var praktisk talt ikke phagocytose bakterier ved injeksjon i blodet eller i væskefylte kroppens hulrom. For subkutane injeksjoner embryoer er plassert tilsvarende som for de halen muskel injeksjoner beskrevet i denne videoen artikkel, men nålen er satt inn like under huden for å injisere bakterier over en somitt.

Det er viktig å tenke på at mikro-injeksjon er egentlig en kunstig smitteveien. Men tidlige embryoer er svært motstandsdyktig mot ytre eksponering for bakterier. Faktisk, nedsenking analyser, hvor embryo er badet i en bakteriell suspensjon, er ikke reproduserbare i våre hender 22. Mens noen embryoer kan bli smittet ved nedsenkning, har vi observert en stor variasjon i dødelighet og i den uttrykteion av inflammatoriske markører gener mellom individuelle embryo i slike analyser. Mikro-injeksjon metodene som beskrives i denne artikkelen oppnå reproduserbare infeksjoner og er spesielt nyttig å studere bakterielle interaksjoner med verten medfødte immunceller. En effektiv tilnærming til å kvantifisere bakteriell infeksjon i enkelte embryoer er å analysere de selvlysende bilder av infiserte fostre med skreddersydd, dedikert pixel kvantifisering programvare 17, 23. Denne tilnærmingen har vist seg å korrelere godt med resultatene fra cfu teller etter plating av infiserte embryoer. Tilsvarende har relative endringer i leukocytter numre per embryoet blitt kvantifisert ved digital bildeanalyse i transgene leukocytter fluoroforen reporter linjer; denne tilnærmingen ville være aktuelt å kvantifisere verten leukopoietic respons på infeksjon 24.

Funksjonen vert medfødte immunsystemet gener kan undersøkes effektivt in vivo ved å kombinere de beskrevne infeksjon modellenemed Morpholino knockdown. Morpholinos er syntetiske antisens oligonukleotider som er rettet mot spesifikke RNA og redusere uttrykket av genet produktene når de blir sprøytet inn i en celle trinns sebrafisk embryoer som vist i andre video artikler i denne 10 tidsskriftet, 25. I Morpholino knockdown studier, er det av stor betydning at alle embryo gruppene som sammenlignes er iscenesatt riktig før bakterielle injeksjoner. Dette er spesielt viktig fordi embryoene har et utviklingsland immunsystem som blir stadig mer kompetente over tid.

Det er flere transgene reporter linjer som er tilgjengelige for å skille de store medfødte immunsystemet undergrupper, makrofager og nøytrofile, i sebrafisk embryoer. MPX og lyz arrangører har blitt brukt til å generere nøytrofile reporter linjer 16, 26, 27, og csf1r (FMS) og MPEG1 arrangører ble brukt til å produsere macrophage reportere 14, 28. Mens CSF1R (FMS) er i tillegg uttrykt i xanthophores, er MPEG1 uttrykk utelukkende i makrofager. Som vist i denne videoen artikkelen, den nylig utviklede MPEG1 reporter linjene er svært nyttig for bildebehandling bakteriell fagocytose av makrofager.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Chao Cui, Floor de Kort, Esther Stoop og Ralph Carvalho for bilder i figur 4, Ulrike Nehrdich og Davy de Witt for fisk omsorg og andre lab medlemmer for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet støttes av Smart Mix Program av Nederland Ministry of Economic Affairs og Kunnskapsdepartementet, Kultur og vitenskap, EU-kommisjonen 7. rammeprogram prosjekt ZF-HELSE (HELSE-F4-2010-242048), den europeiske Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), og av den australske NHMRC (637 394). Den australske regenerativ medisin Institute er støttet med tilskudd fra staten regjering Victoria og den australske regjeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

Tags

Immunologi sebrafisk embryo medfødt immunitet makrofager infeksjon Salmonella Mycobacterium mikro-injeksjon fluorescens bildebehandling,
Infeksjon av sebrafisk embryo med intracellulære bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E. L., van der Sar, A. M.,… More

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter