Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Заражение эмбрионов данио рерио с внутриклеточные бактериальные патогены

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Прозрачный эмбрионов данио оказались полезными хостов модель для визуализации и функционально взаимодействия между врожденными исследование иммунных клеток и внутриклеточных бактериальных патогенов, таких как

Protocol

1. Подготовка инъекционных игл

  1. Подготовить боросиликатного стекла микрокапиллярных иглы для инъекций (Harvard аппарата, 300038, 1 мм, диаметр × 0,78 мм ID) с помощью устройства микропипетки съемник (Sutter Instruments Inc, Горячие / коричневый р-97 со следующими параметрами для более длинного наконечника: атмосферное давление 400; тепла 610; притяжения 40, скорость 50, 30 и времени со следующими настройками на более короткий совет: атмосферное давление 500; тепло 510; притяжение 100, скорость 200, время 60).
  2. Перерыв с кончика иглы с тонким пинцетом для получения диаметр кончика открытие 5-10 мкм. Желательно, чтобы скос открытия иглы под углом 45 градусов угол с микромельницу (Narishige Inc, EG-400), чтобы получить более четкое чаевые. Это будет способствовать прокалывание слоя эпидермиса и, следовательно, привести к более воспроизводимые инъекции с меньшим повреждением тканей, чем с тупыми иглами. Более наконечником иглы являются предпочтительными для хвостовую вену (шаг 5) и канальный Кювье (шаг 6.1), инъекции и короткие иглы наконечникомпредпочтительны для других протоколов инъекций (шаги 6.2-6.6).

2. Подготовка С. Typhimurium посевной

  1. Пластина из С. Typhimurium от -80 ° C глицерин акции на пластинах LB агар (с соответствующими антибиотиками, чтобы выбрать для флуоресцентной векторов экспрессии) и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° C.
  2. Выбор отдельных флуоресцентно положительный колоний и ресуспендируют их в нужной концентрации (см. протоколы 5 и 6) в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS), необязательно содержащий 0,085% (объем / объем) фенола красного (Sigma-Aldrich) для оказания помощи в визуализации процесса впрыска. Непосредственно использовать свежие суспензии для инъекций или глицерин подготовки запасов. Для подготовки глицерин акции, спином вниз свежеприготовленные инъекции акции с желаемой концентрации бактерий и сосредоточиться на складах по ресуспендированием гранул в два раза, начиная объем в стерильных 20% (объем / объем) глицерин (Sigma-Aldrich) в PBS. Хранить запасы глицерина при -80 ° C. Развести глицерин акции 1:1 (объем / объем) перед инъекцией в стерильной PBS, необязательно содержащий 0,17% фенола красного цвета.
  3. Vortex бактериальной суспензии и, чтобы избежать слипания.
  4. Загрузите посевной в микрокапиллярных иглы помощью microloader наконечник (Eppendorf, 5242956,003).
  5. Благодаря относительно большой размер S. Typhimurium бактерий и их яркие DS-красной флуоресценции при использовании pGMDs3 вектор экспрессии 3 (штамм предоставляется по запросу), отдельные бактериальные клетки могут легко считать с флуоресценции стереомикроскоп для того, чтобы установить инъекции дозы. С этой целью вводят 1 NL в капле PBS на агаре пластин, считать люминесцентные бактерии, и рассчитать объем инъекций, необходимых для получения желаемой дозы бактериальной (желательно держать объемом впрыска от 1-2 NL). Вводите эмбрионов с С. Typhimurium по выбранному маршруту (см. протоколы 5 и 6).

3. Готовить

  1. Держите М. Marinum штамм растет на Difco агар Миддлбрук 7H10 (BD и компании) с добавлением 10% олеиновой кислоты, белка-глюкоза-каталазы (OADC, BD и компаний), 0,5% глицерина, а также с соответствующими антибиотиками, чтобы выбрать для флуоресцентной векторов экспрессии (штаммы доступны по запросу 9), так что всегда есть свежие запасы.
  2. Выберите колонии M. Marinum и ресуспендируют его в Difco Миддлбрук 7H9 бульон (BD и компании) с добавлением 10% альбумин, глюкоза, каталазы (АЦП, BD и компания) и 0,05% Твин-80 (Sigma-Aldrich) и соответствующих антибиотиков. Убедитесь, что оптическая плотность (ОП) при 600 нм составляет 0,2 - 0,3, и пусть она растет статически ночь на 28.5 ° C. Время генерации М. Marinum примерно 4-6 ч, варьируется в зависимости от штамма.
  3. Измерьте оптическую плотность при 600 нм снова в день инъекции. OD600 1 соответствует примерно 10 8 М. Marinum / мл(Это может варьироваться в зависимости от штамма бактерий используются и при этом должна быть основана на кривой роста для конкретного штамма).
  4. Урожай бактерии, когда они находятся в логарифмической фазе (не дай OD600 превышает 1.00) путем центрифугирования и промывки их три раза в стерильном PBS.
  5. Измерьте OD600 снова бактериальной суспензии в PBS, спином вниз, и ресуспендируют бактерий к желаемой концентрации (см. протоколы 5 и 6) в ФСБ или в 2% поливинилпирролидона (PVP40) в PBS (вес / объем), что улучшает однородность бактериальной суспензии. Фенол красный (Sigma-Aldrich) могут быть добавлены в концентрации 0,085% до оказания помощи в визуализации процесса впрыска. Непосредственно использовать свежие суспензии для инъекций или глицерин подготовки запасов. Для подготовки глицерин акции спином вниз свежеприготовленные инъекции акции с желаемой концентрации бактерий и сосредоточиться на складах по ресуспендированием гранул в два раза, начиная объем в стерильных 20% глицерина в PBS. Хранить glycЭрол акции при температуре -80 ° C. Развести глицерин акции 1:1 (объем / объем) в стерильном PBS, необязательно содержащий 4% PVP40 и / или 0,17% фенола красного цвета.

4. Подготовка эмбрионов данио рерио для инъекций

  1. Установка данио гнездящихся пар и собирать эмбрионы, как показано в другой видео статьи 10. Держите эмбрионов в чашке Петри заполнены яйца воды (60 мкг / мл соли моря,. Около 60 эмбрионов / блюдо) и инкубировать на 28,5 ° C.
  2. Если необходимо, добавить 0,003% N-фенилтиомочевиной (ПТУ, Sigma-Aldrich) в яйцо воду, когда эмбрионы примерно 12 HPF, чтобы предотвратить меланизации.
  3. Около 24 часов после оплодотворения (ФВЧ), dechorionate эмбрионов с мелкими пинцет (Fine науки Инструменты Inc, Дюмон # 5 щипцы - Inox биологии.
  4. Держите эмбрионов в чашке Петри заполнено яйцо водой и слоем 1% агарозы на дно, чтобы предотвратить эмбрионов от прилипания к поверхности пластика.
  5. Обезболить эмбрионов с 200 мкг / мл буферной 3-Аминобензойной кислоты (Tricaine, Sigma-Aldrich) около 10 мин до инъекции.

5. Внутривенного введения бактерий в одно-дневных эмбрионов

  1. Этап эмбрионов на 28 HPF 11 на проверку соответствует циркуляции крови, начиная пигментации в глаза, прямой хвост, и сердце позиционируется только снизу в глаза.
  2. Обезболить эмбрионов, см. шаг 4.5.
  3. Загрузите иглы с использованием бактериальных посевной microloader чаевые.
  4. Установить загруженный иглы на микроманипулятор (Саттер инструмента, ММ-33) связано с подставкой (Всемирная точности инструментов, M10L магнитной подставкой) и поместите его в стерео микроскопа (Leica M50, ахромат 1x цель 0,15 Н.А., проходящем свете базы TL ST). Установите время впрыска до 0,2 с, а компенсация давления до 15 кПа (Eppendorf, Femtojet). Отрегулируйте давление впрыска от 700 до 900 гПа для получения правильного объем впрыска иглыиспользуется. Отрегулируйте размер капли в соответствии с желаемым диаметром с помощью масштабной линейки на предметном стекле микроскопа или в глаз. Для определения размеров капли могут быть введены в минеральное масло на предметное стекло, или размер можно оценить путем введения в воздух, который выходит из капли висели на кончике иглы. Радиус капли 1 NL является 0,062 мм (V = 4/3 π R 3).
  5. Установить микроманипулятор с загруженным иглу в правильном положении до инъекционные (то есть примерно на 45 ° по отношению к поверхности пластины инъекций) и двигаться только вперед и назад, чтобы придать.
  6. Наркоза эмбрионов пипеткой на плоскую 1% агарозном инъекционных пластины и лишнюю воду яйцо удаляется, позволяя поверхностное натяжение провести эмбрионов на месте во время инъекции. Используйте инструмент волос петли (рис. 2) выстроить эмбрионов. Восток введения пластины руку во время инъекции поместить эмбрионов в предпочтительное положение для insertiнг иглы, то есть с хвостами, указывающую на кончике иглы.
  7. Поместите кончик иглы непосредственно над хвостовой вены близко к мочеполовой открытия (рис. 1А), прокалывают перидермы с иглы и ввести желаемую дозу бактерий, мы используем ок. 250 КОЕ С. Typhimurium дикого типа (WT) штамм SL1027, содержащий DS-красный вектор экспрессии pGMDs3, и ок. 120 КОЕ М. Marinum штамм Mma20. Впрыском бактериальной суспензии будет следовать кровоток через хвостовую вену к сердцу. Монитор, если инъекция была выполнена правильно, проверив расширения объема сосудистой системы непосредственно после импульса 2. Для доза-реакция экспериментов, 2-3 последовательных инъекций могут быть выполнены без извлечения иглы.
  8. Часто убедиться, что инъекция объем остается неизменным в ходе эксперимента. Для обеспечения контроля за согласованность инъекции в течение всего эксперимента, придать дрор бактерий непосредственно в стерильных падение PBS на бактериальной питательной среде примерно через каждые 30 м эмбриона инъекций. Пластина из этого падения и подсчитать колонии бактерий после инкубации для определения колониеобразующих единиц (КОЕ) в Объем впрыска.
  9. Использование флуоресценции стереомикроскоп (протокол 7) соблюдать отдельных флуоресцентных С. Typhimurium клетки, циркулирующие в крови сразу после инъекции, и выбросить эмбрионы, которые должным образом не вводят. Индивидуальные люминесцентные М. Marinum бактерии не могут наблюдать стерео флуоресцентной микроскопии непосредственно после инъекции, а люминесцентные агрегатов инфицированных клеток должна быть видна на 2 дня после заражения (точек на дюйм) и расти с течением времени.

6. Альтернативные маршруты инфекции

  1. Канальные инъекции Кювье: линия под наркозом эмбрионов (2-3 DPF) на плоской 1% агарозном инъекционных пластины, как и для хвостовой вены инъекций (см. п. 5.6). Восток вводитьионный плита руки во время инъекции поместить эмбрионов в предпочтительное положение для введения иглы, то есть по диагонали под углом 45 °, так что Канальные Кювье можно подойти к иглы со спинной стороны зародыша (рис. 1б) . Вставьте иглу в начальную точку протока Кювье только спины в том месте, где канал начинает расширение в желточный мешок и вводят 100-200 бактерий (1-3 NL). Инъекций правильным, если объем в канал расширяется непосредственно после импульса и желточного мешка не разрывается. Что касается хвостовой вены инъекций (см. п. 5.7), несколько последовательных инъекций могут быть выполнены без извлечения иглы.
  2. Задний мозг желудочка инъекций: линия под наркозом эмбрионов (32 HPF) на плоской 1% агарозном инъекционных пластину так, что эмбрионы расположены с дорсальной стороны на кончике иглы. Вставьте иглу в задний мозг желудочка с передней позиции, не касаясь neuroepithelium (рис. 1С) и вводят 20-100 бактерии (0,5-1 NL). Чтобы практиковать процедуры, использование флуоресцентных красителей (например, штат Техас, Красная декстран), как показано в другой видео статьи 13.
  3. Хвост мышц инъекций: положение анестезии эмбрионов (1-2 DPF), как и для хвостовой вены инъекций (см. п. 5.6). Отрегулируйте микроманипулятор с загруженным иглы под углом около 65 ° по отношению к поверхности пластины инъекций. Вводите бактериальной суспензии (0,5-1 NL), содержащих 20 - 50 КОЕ в мышцу над мочеполовой открытия (рис. 1D), не причиняя ущерба хорды или кровеносные сосуды.
  4. Otic инъекции пузырьков: Позиция анестезии эмбрионов (2-3 DPF), как и для хвостовой вены инъекций (см. п. 5.6). Отрегулируйте микроманипулятор с загруженным иглы под углом около 65 ° по отношению к поверхности пластины инъекций. Вводите около 20 бактерий (0,5 нл) в слуховой пузырек (рис. 1Е) с низкой прессыЮр, чтобы избежать местных разрыв тканей.
  5. Хорды ​​инъекций: линия под наркозом эмбрионов (1-2 DPF) на плоской 1% агарозном инъекционных пластину так, что эмбрионы располагаются с хвоста направлен от иглы. Вставьте иглу через ткань хвостом мышцы в хорды (рис. 1F) и ввести около 20-50 бактерии (максимальная 0,5 NL). Будьте осторожны, чтобы не вводить слишком большой объем, чтобы избежать разрыва хорды.
  6. Желток инъекций: положение яйца, содержащие эмбрионов на 16 до 1000 клеточной стадии на 1% агарозном инъекционных пластина с прямоугольным или V-формы каналов сделано с каналом форме 12 или на сайте http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Пирс иглу через хориона в центре желтка (рис. 1С) и вводят 20-40 бактерии (1-2 NL). Использование 2% PVP40 носителя решения для бактериальной суспензии (см. п. 3.5)Важно, чтобы предотвратить распространение бактериальной рано в эмбрионе.

7. Стерео с инфекцией

  1. Обезболить зараженных эмбрионов в 1% агарозном слоистых Петри яйцо покрыто водой, содержащей Tricaine (см. 4.5).
  2. Совместите эмбрионов в правильное положение для работы с изображениями под флуоресцентным микроскопом стерео с помощью инструмента волос петли (рис. 2). Перед плавательного пузыря была завышенной (1-5 DPF), эмбрионы будут лежать на боку позволяет боковые изображения зрения.
  3. Если иное положение, чем сбоку не требуется, установите эмбрионов в 1,5% метилцеллюлозы. Манипулирование эмбриона в требуемое положение с помощью инструмента волос петли (рис. 2).
  4. Вернуться эмбрионов яйцо воды после съемки.

8. Конфокальной микроскопии с инфекцией

  1. Поместите каплю низкой температурой плавления агарозы (Lonza Inc, 1,5% (вес / объем) в яйце воды) на нижней части стеклаWillCo блюдо (WillCo Уэллс, GWSt-5040), если перевернутая конфокальной микроскопии используется, или на одном слайде депрессии полости (агар научно-L4090), если вертикально конфокальной микроскопии используется.
  2. Положите под наркозом эмбриона в каплю агарозы с ограниченным количеством воды яйцо и управления в положение эмбриона с помощью инструмента волос петли (рис. 2). При использовании инвертированного микроскопа, важно, чтобы регион эмбриона интерес плоское стекло нижней части изображения блюдо. Прямой микроскоп может быть использован в сочетании с погружением в воду или на большие расстояния сухой цели и эмбрион должен быть расположен так, что регион представляет интерес как можно ближе к цели насколько это возможно.
  3. Пусть агарозном укрепить и погрузиться капли агарозы в воде, содержащей яйца Tricaine (см. 4.5). Если прямой микроскоп используется, положите листок стеклянной крышкой в ​​верхней части депрессии полости (не позволяйте пузырьки воздуха с образованием).
  4. Последовательно приобрести гриппаценции и передачи изображений.
  5. Осторожно снимите агарозы из эмбрионов с мелкими пинцетом и поместить эмбрион яйца обратно в воду, если это необходимо для дальнейших экспериментов.

9. Представитель Результаты

Инъекции Salmonella Typhimurium или Mycobacterium Marinum бактерий в кровь острова эмбрионов на 1 DPF приводит к быстрому фагоцитоза макрофагами. Ген mpeg1 недавно была идентифицирована как верный маркер эмбриональных макрофагов, colocalizing с устоявшейся макрофагов маркер csf1r (ФМС) и не дублировали маркеры, такие как нейтрофилы Мп (МПО) и 4 lyz, 14. Для живого изображения бактериального фагоцитоза использовали трансгенных линий, в которых mpeg1 промоутер диски люминесцентные экспрессии белка в макрофагах 14. Эти трансгенные линии либо mpeg1 промоутер енепосредственно с геном GFP, или использовать двухкомпонентную систему, в которой mpeg1 промоутер диски выражение дрожжи Gal4 транскрипционный фактор, который активирует второй трансгена с Gal4 последовательность признание (БАС, вверх по течению активации последовательности), слитый с Kaede ген. При инъекции крови острова (протокол 5; рис. 1А) выполняется правильно, бактерии сразу проходить через циркуляцию крови и распространяются по всему эмбриону. Распространение относительно больших и ярких флуоресцентных DS-красным помечены С. Typhimurium бактерии могут быть отображены непосредственно со стерео флуоресцентного микроскопа (рис. 3А) и конфокальной микроскопии в 2 показывает, ИНН, что многие бактерии фагоцитированы флуоресцентным макрофагов (рис. 3В-C). Введение всего за 25 КОЕ дикого типа С. Typhimurium бактерий может привести к смертельной инфекции, в то время как аналогичные дозы бактерий авирулентных сПоезд, как Ра, могут быть удалены по эмбриональных иммунной системы 3. Инъекций в дозе 250 КОЕ был использован для определения транскрипционных ответы на С. Typhimurium инфекции в эмбрион данио рерио и показали индукции сильного провоспалительных генов ответ 15. В отличие от внутривенного введения М. Marinum бактерий не вызывает сильного про-воспалительный ответ, но приводит к хронической инфекции, где инфицированные макрофаги образуют плотный агрегатов, которые рассматриваются как начальные стадии гранулемы, которые являются отличительным признаком туберкулеза 2. Конфокальной микроскопии такой гранулемы типа агрегата в Tg (mpeg1: EGFP) gl22 строке 14 на 5 точек на дюйм показывает, внутриклеточный рост mCherry-меченных М. Marinum бактерий внутри зеленого флуоресцентного макрофагов (рис. 3D-E).

Отее путями передачи инфекции являются полезными для различных целей. Бактерии могут быть введены в задний мозг желудочка на 32 HPF (рис. 1С), которая представляет собой отсек лишенный макрофагов. Инъекции 20-100 mCherry-меченных М. Marinum бактерий в этом отсеке приводит к быстрому проникновению макрофагами, что фагоцитируют бактерий (рис. 4а). Другой метод изучения миграции направлены иммунной клетки введения бактерии в мышцы хвоста (рис. 1D). Тем не менее, инъекции хвостом мышцы также может вызвать повреждение тканей, что само по себе вызывает некоторые привлечение лейкоцитов. Такие ранения ответ можно избежать, если тщательно инъекционных небольшого объема (0,5-1 NL) в слухового пузырька (рис. 1Е). Как показано здесь с помощью Tg (Мп: EGFP) i114 строке 16, инъекция примерно 20 КОЕ С. Typhimurium в слухового пузырька приводит к привлечению нейтрофилов в 3 ИНН ( (рис. 4E). Хорды, которая оказывается устойчивой к инфильтрации лейкоцитов, является разрешительным отсек для роста M. Marinum мутантов, которые сильно ослабляется при введении в других тканях 7; (рис. 4F). Наконец, раннее введение М. Marinum в желток эмбрионов обеспечивает альтернативный метод для достижения системной инфекции. Как правило, мы выполнять эти инъекции по 16-клеточной стадии (рис. 1С), но и бактериальные вливаний в желтке также может быть выполнена на более поздних этапах (до 1000-клеточной стадии) или выше (от 1 до 8 клеточной стадии) для совместной инъекции с morpholinos 8. После желток введения дозы 20-40 КОЕ, М. Marinum бактерии распространяются в течение нескольких дней в эмбриональных тканях и форму гранулемы типа агрегатов аналогичной тем, которые наблюдаются при обычномвнутривенные инъекции метод 8; (рис. 4G). Метод желток инъекций не подходят для S. Typhimurium инфекций, потому что его быстрый рост в желтке причиной ранней летальности. Метод желток инфекции M. Marinum инфекции будут полезны для высокой пропускной способности приложений, так как это можно автоматизировать с помощью инъекции робот 8.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обзор введение методов, используемых для создания системной или местной инфекции у эмбрионов данио рерио. (AB) внутривенные инъекции для создания быстрой системной инфекции проводится в хвостовую вену на задней острове крови на 1 DPF (А) или в канал Кювье в 2-3 DPF (B). (CE) Местные инъекции для изучения макрофагов и нейтрофилов, хемотаксис осуществляется в задний мозг желудочка на 1 DPF (C), Хвост мышцы на 1-2 DPF (D) или слухового пузырька на 2-3 DPF (E). (F) Инъекции для создания инфекции очевидно недоступны для фагоцитов осуществляется в хорды на 1-2 DPF. (G) Инъекции для создания ранней системной инфекции с медленным ростом бактерий, таких как М. Marinum могут быть выполнены в желтке на 16-1000 клеточной стадии. Все снимки были сделаны с Leica M165C, PLANAPO 1.0x связано с камерой Leica DFC420 (Leica 10446307 0,8).

Рисунок 2
Рисунок 2. Инструмент для волос цикла. Часть человеческого волоса вводится в виде петли в отверстие пипетки Пастера и закрепляется с помощью клея или супер Tipp-Ex. Это обеспечивает удобный инструмент для манипуляций мягко хрупкий эмбрионов данио.

Рисунок 3
Рисунок 3. Внутривенные инъекциикрасный флуоресцентный Salmonella Typhimurium и Mycobacterium Marinum. DS-RED-меченого С. Typhimurium SL1027 бактерии (AC) и mCherry-меченных М. Marinum Mma20 бактерии (DE) вводили в кровь острова Tg (mpeg1: Gal4-VP16) gl24; Tg (БАС-E1b: Kaede) s1999t (AC) или Tg (mpeg1: EGFP) gl22 (DE) эмбрионов данио на 28 HPF. (A) Стерео-флуоресценции и светлого поля наложения изображений показывает распространение С. Typhimurium в циркуляции крови в 2 ИНН (Leica MZ16FA микроскопа Leica DFC420C камеры). (BC) конфокальной Z-Stack прогнозов показывает красную С. Typhimurium бактерии фагоцитированы зеленых макрофагов в 2 ИНН (Leica TCS SPE, HCX APO цель 40x 0.8 Na). Бактерии, которые все еще внеклеточной можно наблюдать. (D) конфокальной Z-Stack проекция показывает гранулемы, как совокупности содержащих M. Marinum Mma20-инфицированных и неинфицированных макрофагов на 5 точек на дюйм (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0.8 Na). Макрофаги в зеленых и бактерий в красный цвет. (E) конфокальной Z-Stack проекции отдельных макрофагов (зеленый) с внутриклеточными М. Marinum бактерий (красный). Площадь изображен на D в белый прямоугольник удалось сфотографировать с более высоким увеличением цель (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 мкм.

Рисунок 4
Рисунок 4. Альтернативные маршруты для заражения эмбрионов данио рерио. (A) mCherry-меченных М. Marinum Mma20 бактерии вводили в задний мозг желудочка на 32 HPF. Флуоресценции и передачи наложение изображение, показывающее mCherry-меченых бактерий фагоцитированы макрофагами в 5 HPI (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (Б) С. Typhimurium вводили в хвостовую мышц на 1 денье. Привлечение миелоидных клеток в месте инъекции (белый круг) показан на 3 ИНН по еluorescent в гибридизация 4, (C), тогда как в uninjected эмбрионов там, как правило, не миелоидных клеток при этом морфологические сайта. Хотя эмбрионов не содержат зрелых нейтрофилов на данном этапе, две популяции клеток миелоидной можно выделить один выразить макрофагов маркер mfap4 (красный) и одного выражения нейтрофилов маркер Мп (зеленый) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x 0,3 нА). Флуоресценции бактерий теряется после процедуры на месте гибридизации. (D) DS-RED-меченого С. Typhimurium бактерии вводились в слуховым пузырьком ТГ (Мп: EGFP) i114 данио в 2 денье. Стерео-флуоресценции и светлого поля наложение изображений показывает, что Мп: EGFP меченых клеток нейтрофилов привлекает к зараженному слухового пузырька (пунктирная эллипс) в 3 ИНН, (E), тогда как контроль инъекции PBS в слуховым пузырьком ТГ (Мп: EGFP ) i114 данио не показывает привлечения нейтрофилов неинфицированных ушной весерповидно (пунктирная эллипс) (Leica MZ16FA с камерой Leica DFC420C). (F) mCherry-меченных М. Marinum бактерий ослабленный E11 eccCb1 :: т мутантного штамма 17 были введены в хорды на 1 денье. Распространение внутри хорды удалось сфотографировать на 5 точек на дюйм (Leica MZ16FA микроскоп с камерой DC500). (G) mCherry-меченных М. Marinum E11 бактерии вводились в желтке 16-клеточной стадии эмбрионов данио рерио в Tg (fli1a: EGFP) линии, которая выражает GFP в эндотелиальных клетках кровеносных и лимфатических сосудов. Формирование гранулемы типа агрегатов инфицированных клеток в хвостовой области наблюдается в 5 точек на дюйм (Leica MZ16FA микроскоп с камерой Leica DFC420C, изображение из 8).

Discussion

Инфекция методы, описанные в этой статье, которые часто используются для изучения функций генов хозяин врожденный иммунитет или бактериальных генов вирулентности 1. Внутривенное введение микро-методы (протоколы 5 и 6.1), которые используются чаще всего для таких исследований. Хвостовой вены на задней острове крови является наиболее удобным местом для внутривенного введения 1-дневных эмбрионов. В хвостовой вены становится все труднее проникать на более поздних стадиях, мы предпочитаем Канальные Кювье, как внутривенная инъекция сайт для эмбрионов на 2-3 DPF. Во всех случаях важно, чтобы ввести эмбрионы с постоянным количеством бактерий, которые должны быть проверены на покрытие посевного материала для инъекций для подсчета КОЕ. Следующие аспекты должны быть рассмотрены для достижения воспроизводимых инъекций. Во-первых, необходимо иметь высококачественное стекло микрокапиллярных игл инъекции. Если кончик иглы слишком велик, введение создаст прокола отверстие достаточно большой для кровотечение происходит ивводили бактерии будут поступать из кровообращения. Во-вторых, бактерии должны быть введены непосредственно в кровообращение. Если кончик иглы не в вену или если инъекция жидкости распространяется на продление желточного мешка, эмбрион должен быть исключены из эксперимента. В-третьих, использование PVP40 в качестве носителя для потребителей инъекционных М. Marinum будет оказывать помощь в предотвращении бактерий погружается в стеклянной иглы. PVP40 улучшает однородность суспензии, в результате чего более воспроизводимые посевного материала в течение всего срока инъекции. PVP40 также может быть использован для S. Typhimurium инъекций, но здесь это менее важно, так как больший размер и яркие флуоресценции бактерий позволяет визуально контролировать впрыск посевной в ходе экспериментов. Для практикующих инъекции мы рекомендуем использовать фенола красного красителя (1% об / об) или 1 мкм флуоресцентные сферы доступны в различных цветах (Invitrogen). Как только техника освоена, она занимает около 30 Minutэс вводить 50-100 эмбрионов, включая время, необходимое для выравнивания эмбрионов на пластинах агарозы и регулирования бактериальных объем инъекций.

В то время как внутривенные инъекции в кровь острова (протокол 5) или в канал Кювье (протокол 6.1) наиболее часто используются, альтернативных путей заражения, описанные в этой статье видео оказались полезными для изучения макрофагов и нейтрофилов, хемотаксис (протоколы 6.2, 6.3 и 6.4), для изучения роста ослабленных штаммов бактерий (протокол 6.5), и адаптировать модель данио инфекции для высокой пропускной способности приложений (протокол 6.6) 4-8. Описанные микро-инъекционные методы могут быть применены для инъекций вирусы 18, 19, грибковых спор 14, 20 или простейших паразитов (Мария Forlenza, личное сообщение). Полезным дополнением к инъекции процедур, описанных в этом видео, статьи недавно описанной процедуры для подкожного введения бактерий в zebrafish эмбрионов 21. Эта процедура была применена к изучению фагоцитоза бактерий нейтрофилы, которые были найдены эффективно поглощают бактерии на поверхности ткани, но, в отличие от макрофагов, практически не в состоянии фагоцитируют бактерии при введении в кровь или в заполненных жидкостью полостей тела. Для подкожных инъекций эмбрионов расположены аналогично, как и для мышц хвоста инъекции, описанные в этой статье видео, но игла вводится под кожу, чтобы ввести бактерий на сегмент.

Важно учитывать, что микро-инъекции, по существу искусственным путем передачи инфекции. Тем не менее, ранние эмбрионы обладают высокой устойчивостью к внешнему воздействию болезнетворных бактерий. На самом деле, погружение анализов, где эмбрионы купаются в бактериальной суспензии, не воспроизводимые в наших руках 22. Хотя некоторые эмбрионы могут заразиться при погружении, мы наблюдаем большой разброс в показателях смертности и экспрессионных воспалительных маркеров генов между отдельными эмбрионами в таких анализов. Микро-инъекционные методы, описанные в этой статье получения воспроизводимых инфекции и особенно полезны для изучения бактериальных взаимодействия с принимающей иммунной клетки. Эффективный подход к количественной бактериальной инфекции в отдельных эмбрионов является анализ флуоресцентных изображений зараженных эмбрионов на заказ, специализированное программное обеспечение количественного пикселя 17, 23. Этот подход был показан на хорошо коррелируют с результатами подсчета КОЕ после покрытия зараженных эмбрионов. Кроме того, относительные изменения в лейкоцитарной номеров в зародыше были количественно цифрового анализа изображений в трансгенных линий флуорофора лейкоцитов репортер, этот подход будет применяться к количественному принимающей leukopoietic ответ на инфекцию 24.

Функция принимающих иммунной генов может быть исследована эффективность в естественных условиях путем объединения описанных моделей инфекциис морфолино нокдаун. Morpholinos синтетические олигонуклеотиды антисмысловых которые предназначаются для определенных РНК и снижение экспрессии гена продукции при введении в 1-клетки эмбрионов данио этапа, как показано в других статьях, видео в этом журнале, 10, 25. В исследованиях морфолино нокдаун, это имеет большое значение, что все эмбрион групп в сравнении которые поставил правильно до бактериальных инъекций. Это особенно важно, потому что у эмбрионов развивается иммунная система, которая становится все более компетентными с течением времени.

Есть несколько трансгенных линий репортер в настоящее время выделить основные иммунной подмножества, макрофагов и нейтрофилов, у эмбрионов данио рерио. Мп и lyz промоутеров были использованы для создания нейтрофилов линии репортер 16, 26, 27 и csf1r (ФМС) и mpeg1 промоутеров были использованы для производства макрофагов журналистам 14, 28. В то время как CSF1R (ФМС) дополнительно выражается в xanthophores, mpeg1 выражение исключительно в макрофагах. Как показано в этом видео статьи, недавно разработанный mpeg1 линии репортер очень полезны для работы с изображениями бактериального фагоцитоза макрофагами.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Чао Кюи, этаж де Корт, Эстер Stoop и Ральф Карвалью изображений на рисунке 4, Ульрике Nehrdich и Дави де Витта для ухода рыбы и других членов лаборатории за полезные обсуждения. Эта работа поддерживается Смарт Программа Mix в Нидерландах Министерство экономики и Министерство образования, культуры и науки, Европейская комиссия 7-ая рамочная проект ZF-ЗДОРОВЬЕ (HEALTH-F4-2010-242048), Европейский Марии Кюри Начальная подготовка сети FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), а также австралийский NHMRC (637 394). Австралийский Институт регенеративной медицины при поддержке грантов от правительства штата Виктория и австралийского правительства.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

Tags

Иммунологии выпуск 61 данио рерио эмбриона врожденный иммунитет макрофаги инфекции сальмонеллы микобактерии микро-инъекции флуоресценции,
Заражение эмбрионов данио рерио с внутриклеточные бактериальные патогены
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E. L., van der Sar, A. M.,… More

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter