Endurance Training protocollo e saggi prestazioni longitudinali per Drosophila melanogaster

Summary

Descriviamo il primo protocollo allenamento di resistenza per una specie importante modello genetico,

Abstract

Uno dei problemi più urgenti moderni ricercatori medici è l'impennata dei livelli di obesità, con il conseguente aumento della patologie associate come il diabete e le malattie cardiovascolari ^1-3. Un tema importante della ricerca in questi problemi di salute associati riguarda il ruolo di esercizio di resistenza come un intervento benefico.

L'esercizio fisico è un poco costoso, non invasivo l'intervento con diversi risultati positivi, come la riduzione in grasso corporeo in eccesso ^4, aumento della sensibilità all'insulina nel muscolo scheletrico ^5, ha aumentato le risposte anti-infiammatorie e antiossidanti ^6, e una migliore capacità contrattile in cardiomiociti ^7. Esercizio a bassa intensità è noto per aumentare l'attività e la biogenesi mitocondriale ⁸ nell'uomo e nel topo, con la coattivatore trascrizionale PGC1-α come un importante intermedio ^9,10.

Despite l'importanza dell'attività fisica come strumento di lotta contro alcune importanti malattie legate all'età, ampi studi longitudinali genetici sono stati impediti dalla mancanza di un protocollo di allenamento di resistenza per una breve specie modello genetico. La varietà di strumenti genetici disponibili per l'uso con Drosophila, insieme ai suo mantenimento vita breve e poco costoso, ne fanno un modello attraente per un ulteriore studio di questi meccanismi genetici. Con questo in mente abbiamo sviluppato un apparecchio innovativo, conosciuta come la Power Tower, su larga scala di allenamento all'esercizio in Drosophila melanogaster ^11. Il Power Tower utilizza comportamento istintivo dei moscerini geotassi negative per indurre ripetutamente arrampicata rapido. Ogni volta che gli impianti di risalita della macchina, poi scende, la piattaforma delle mosche, le mosche sono indotti a salire. Mosche continuano a rispondere finché la macchina è in funzione o fino a diventare troppo affaticato per rispondere. Quindi, il ricercatore può utilizzare la macchina per fornire sformazione imultaneous un gran numero di mosche di pari età e geneticamente identici. Inoltre, si descrivono i saggi associati utili per monitorare i progressi longitudinale di coorte mosca durante l'allenamento.

Protocol

1. Potenza di installazione e funzionamento Torre

1. La torre di alimentazione è collocato su un pezzo rettangolare di compensato che è fissata ad una tabella. A rpm 4,5 motoriduttore da Grainger poggia sulla cima di quattro 2 "x6" tavole ¾ di pollice e una tavola di compensato. Il motore, un alimentatore AC / DC il controllo della velocità, un fusibile e un interruttore on / off sono collegati insieme in una scatola di giunzione.
2. Per raffreddare il motore, un foro 3 pollici di diametro è tagliata in verticale ½ pollice pezzo di compensato. Da un lato, un 3-pollici ventola è attaccato al compensato, e dall'altro, un 3-pollici cilindro di metallo di diametro è fissato.
3. Una misura braccio rotante con un rullo montato sulla estremità è collegata al motore. Il motore e braccio attaccato ruotare in senso orario, spingendo in basso un lato di un piegato ¾ di pollice quadrato archivio di tubo che è attaccato al compensato con una cerniera della porta. Una ruota è fissato al lato superiore del magazzino tubo sotto la piattaforma per permettere a rotolare contro la piattaforma che è dirRecuperare il liquido direttamente sopra di esso.
4. Il braccio spinge verso il basso su una estremità del magazzino tubo e solleva l'estremità opposta, sollevando a due livelli piattaforma (Figura 1D). Quando il rullo sul braccio cancella la fotografia tubo permette al braccio di ritornare alla posizione iniziale, la piattaforma cadere giù (figura 1F).
5. Le piattaforme sono costituiti da rack che sono posti sulla parte superiore del compensato e assicurata da corde elastiche che vengono agganciati occhi di vite. Le piattaforme far scorrere su e giù lungo cursori cassetto che sono attaccati al compensato con staffe.
6. I flaconi sono posti nelle rastrelliere e fissato da uno schermo griglia quadrata che si tiene a posto con corde elastiche.
7. Un cuscino Styrofoam è posto sotto la piattaforma per attenuare lo shock della caduta.
8. La potenza del motore è regolata in modo tale che un periodo completo di rotazione è di 15 secondi.

2. Esercizio del protocollo

1. Le mosche sono alloggiati in un incubatore a 25 ° C con 50% di umidità e 12 ore di luce / dark ciclo. Sia l'esercizio fisico e la valutazione della capacità di esercizio si svolgano in 25 ° C a temperatura controllata ambiente.
2. Mosche vengono raccolti e di pari età entro 1-2 giorni l'uno dall'altro. Un minimo di 240 mosche è necessario per il monitoraggio longitudinale di geotassi resistenza e negativi (arrampicata) capacità, due indicatori fisiologici che riflettono gli effetti di allenamento. Monitoraggio longitudinale permette l'isolamento di cambiamento indotto relativo ai valori di base per ciascuna coorte, senza gli effetti confondenti di variazione tra coorti. Vola per ulteriori esperimenti devono essere raccolti in base alle esigenze.
3. Dopo la raccolta, mosche sono suddivisi in 120 mosche sperimentali, che saranno sottoposti al regime di esercizio, e 120 vola di controllo, che non verrà esercitata. Le mosche sono conservati in flaconi da 20 battono. Le fiale di mosche sperimentali sono collegate con Flugs fermi acetato di cellulosa e le fiale di controllo (non esercitate) mosche sono collegato con morbidi spotappi in ESN, che può essere spinta verso il basso per immobilizzare le mosche, mentre il Power Tower. Spugna viene usato per immobilizzare perché la dimensione adattativa facile posizionamento in prossimità del fondo della fiala. Il materiale spugna morbida riduce anche le lesioni causate dai Flugs più solide.
4. Mosche sul Power Tower sono memorizzati ed esercitato in fiale contenenti 5 ml di cibo, che fornisce loro un atterraggio più morbido di mosche che sono esercitate in flaconi vuoti. La cucina è tipicamente composto da 10% di saccarosio, 10% lievito, e il 2% agar in acqua, anche se non osserviamo le mosche da mangiare spesso durante il corso di una sessione di allenamento. Se flaconi vuoti vengono utilizzati durante l'addestramento, la percentuale di mosche che subiscono lesioni è aumentato drammaticamente.
5. La torre di alimentazione viene utilizzato in un ambiente a temperatura controllata che viene mantenuta a 25 ° C. Mosche sperimentali sono immessi sul Power Tower e fatto salire. Mosche di controllo sono anche posto sulla Torre Power, ma il tappo spugna è pushed giù nella fiala circa 3 mm sopra le mosche al fine di limitare il movimento. Questo gruppo serve come controllo per gli effetti del Power Tower che non sono correlate ad esercitare. Anche se esiste ancora un certo margine di queste mosche di manovra, abbiamo ripetutamente osservato che le mosche in queste condizioni correre molto poco e non dimostrano una risposta fisiologica di esercitare. Può anche essere desiderabile includere un ulteriore gruppo di controllo che non viene immesso sul Power Tower affatto.
6. Mosche sono esercitate cinque giorni consecutivi ogni settimana, utilizzando un programma rampa (Figura 2). Durante una settimana le mosche sono esercitati per 2 ore per ogni sessione, due alla settimana per 2,5 ore per sessione, e tre settimane per 3 ore per sessione. Anche se gli altri regimi sono stati testati, questo protocollo produce risultati coerenti tra genotipi e in condizioni divergenti. Questo protocollo è tuttavia soggetto a una vasta gamma di possibili variazioni che potrebbero soddisfare un particolare esperimento.

1. Tempo di stanchezza durante l'esercizio fisico di resistenza è un utile indicatore fisiologico per confermare e / o di quantificare la capacità di esercizio di una coorte dato. Saggi di fatica può essere eseguita longitudinalmente su coorti che verranno utilizzati in esperimenti di formazione. I saggi possono essere effettuate prima della formazione, dopo il completamento del protocollo di allenamento, o entrambi. Gli altri punti temporali intermedi può essere aggiunto se tracciare il progresso incrementale durante l'allenamento si desidera. Il dosaggio fatica può anche essere usato per misurare la resistenza fisica come risposta a trattamenti diversi dal protocollo di addestramento, come alterazione dieta (Figura 3B).
2. Test di fatica deve essere condotto su un giorno in cui la formazione non sta avvenendo. Mosche Sia il sperimentali e di controllo sono posizionati sulla Torre Potenza in fiale da 20 ciascuno e fatto salire fino affaticato. La fatica viene riconosciuta come la mancata risposta a uno stimolo negativo geotassi con l'arrampicata essereportamento. Comportamento a fatica è segnato da osservazione visiva.
3. Un flaconcino di mosche viene considerato "affaticato" quando 5 o meno mosche sono in grado di salire più in alto di 2 pollici per quattro gocce consecutivi. Fiale affaticati vengono rimossi dal Power Tower mentre è ancora in funzione, e il tempo di rimozione viene registrato. Tempi di rimozione può essere tracciata come un istogramma nidificato, o come un complotto "time-to-fallimento". Un esempio di dati tracciati come un complotto "time-to-fallimento" è mostrato in figura 3B.
4. I flaconi sono monitorati a intervalli di 10 minuti per un massimo di 10 ore (Figura 3B).

4. Esercizio, età e Locomotore Ability

1. Dal momento che questo protocollo di allenamento si basa su comportamenti indotti da corsa, un test primario per la quantificazione degli effetti della formazione è quello di misurare longitudinalmente il cambiamento, in media, velocità di esecuzione durante l'allenamento. Durante il corso di formazione, 120-fly coorti di mosche esercitato e non esercitate sono testati quotidianamente per la loro risposta ad una s geotassi negativotimulus. La tecnica descritta in ANELLO Gargano et al. (2005) viene utilizzato per misurare la capacità scalata delle mosche ^12. In breve, questa tecnica di misura altezza media salita da una fiala di mosche in un tempo definito dopo l'induzione di geotassi negativi. L'altezza scalato durante un tempo definito è equivalente alla velocità arrampicata. Le misure vengono effettuate prima di mettere le mosche sulla macchina per l'allenamento quotidiano in modo da evitare complicazioni dalla fatica dopo l'esecuzione del giorno.
2. Nel nostro protocollo standard, le mosche sono esercitati per un totale di tre settimane e la capacità di arrampicata viene esaminato per un totale di cinque settimane: tre settimane durante l'attività di formazione e due settimane dopo l'interruzione di esercizio (Figura 2). Ciò permette di tracciare lo sperimentatore se gli effetti dell'esercizio fisico sulla mobilità persistono anche dopo la cessazione del programma.
3. Quattro fotografie di prestazioni ANELLO giornaliero di ogni coorte sono utilizzati per l'analisi delle capacità di arrampicata. Sei flaconi sono inclusi in ogni fotografia. Negative geotaxis viene indotta, e utilizzando una fotocamera temporizzato, una fotografia viene presa dopo un determinato numero di secondi. Usiamo tipicamente due secondi, anche se questo può essere variato a seconda delle condizioni sperimentali. Per ogni fotografia, ogni flacone è diviso in quattro quadranti di eguale altezza, e software di elaborazione immagine viene utilizzato per assegnare ad ogni volo un punteggio basato sul quadrante ha raggiunto entro il periodo di tempo assegnato. Le mosche che si arrampicano per ricevere il quadrante più in alto un punteggio di 4, vola nel quadrante successivo più alto riceverà un 3, vola nel quadrante secondo più alto riceverà un 2, e vola a più basso riceverà un quadrante 1. Le mosche che non salgono fuori del fondo a tutti viene dato un punteggio di 0.
4. Per ogni flacone in una fotografia data, un "indice di climbing" è generato dalla media dei punteggi di tutte le mosche in quel flacone. Ogni flaconcino di indici dei quattro fotografie vengono poi conglobati a dare un indice finale di arrampicata per quel giorno.
5. Tutti gli esperimenti sono condotti geotassi negativi longitudinaledinally. I risultati sono normalizzati per il punteggio iniziale "pre-esercizio" al fine di ridurre l'effetto della variazione coorte in arrampicata capacità ed evidenziare la variazione relativa longitudinale della capacità arrampicata una coorte come risultato di allenamento. Il punteggio iniziale è determinato dalla media degli indici arrampicata i primi tre giorni e viene assegnato un valore di 1. Studi successivi vengono quindi espressi come percentuale dell'indice iniziale.

5. Risultati rappresentativi

Wild-type mosche rispondere ad un protocollo di resistenza con un minore riduzione correlata all'età nella scalata capacità che persiste dopo la fine della formazione, che si riflette nei saggi ANELLO longitudinali in cinque settimane di età (Figura 3A). Questo declino ritardato in geotassi negativi è una risposta standard fenotipica che può servire come controllo positivo per assicurare che wild-type di risposta esercizio sta avvenendo normalmente. Questo insieme di dati viene presentato come un esempio di come l'induzione di esercizio dal programma torre di alimentazione può essere utilizzato come ingresso comportamentale. La capacità di vari fattori genetici o ambientali per modulare questo effetto può essere valutato.

Viceversa, la torre di alimentazione può anche essere utilizzato come uscita in vari modelli sperimentali. Ad esempio, genotipo, la dieta, o altre condizioni possono essere variati. Quindi, l'effetto di queste variazioni su fisiologia possono essere testati con la torre di alimentazione. Qui vi mostriamo un esempio di questo approccio. Quando vola con una percentuale variabile di saccarosio nelle loro diete sono stati testati per il tempo di affaticamento, aumento del contenuto di saccarosio correlata con maggiore capacità di resistenza (Figura 3B).

Figura 1. Funzionamento del Power Tower. (AC) Il braccio piegato rullo motorizzato con annesso ruota in senso orario fino ad entrare in contatto con il tubo piegato quadrato. (D, E) Labraccio spinge verso il basso sul tubo piegato quadrato, provocando la piattaforma che è carica di fiale di mosche a sollevare. (F) Poiché il braccio cancella il tubo è consentita la piattaforma di ricadere, costringendo le mosche per tornare al fondo del flaconcino.

Figura 2. Consigliato protocollo di esercizio. Vola sottoposti al protocollo di allenamento sono fatti di esercitare per cinque giorni alla settimana, nel quadro di un regime di tre settimane lunga rampa che aumenta progressivamente la durata di esercizio dagli iniziali 2 ore di 30 minuti ogni settimana. Analisi standard includono test di fatica prima e dopo il programma di esercizi e test ANELLO dalla settimana 1 alla settimana 5. Tutti i saggi vengono eseguiti in duplicato su un numero uguale di mosche esercitate come controllo negativo. Altri vari test fisiologici o biochimici può essere condotto come determinato dal ricercatore.

Figura 3. Esercizio di resistenza altera molteplici aspetti della mobilità. (A) saggi ANELLO eseguita longitudinalmente attraverso le età in una coppia di sesso maschile Y ¹ W ^67C23 coorti. Di pari età, geneticamente identiche di controllo esercitato e mosche non esercitati sono stati misurati tutti i giorni per la velocità media di arrampicata. I risultati sono espressi in termini di un indice di arrampicata che è normalizzata all'altezza media salendo attraverso i primi tre giorni di misurazione. Esercizio addestrati mosche mostrato una diminuita declino relativo all'età nella capacità geotassi negativo rispetto ai pari età fratelli non esercitati attraverso le età (2-way ANOVA, p <0,005). (B) test di fatica condotte per 8 ore pari età femminile Canton S mosche mostrano un effetto significativo del tenore di saccarosio nella dieta in tempo per la fatica (Log-rank, p <0,0001). Prima di sperimentare, le mosche sono stati alimentati con un lievito / saccarosio / agar dieta, con il 10% in peso / volume yeast concentrazione e una percentuale variabile di saccarosio nella dieta. Cinque fiale di 20 mosche ciascuno sono stati testati per ogni dieta. Il grafico mostra il numero di fiale ancora cinque o più mosche in esecuzione in un punto determinato momento. Questi risultati possono essere trattate statisticamente e graficamente come una sopravvivenza (o tempo di guasto) curva, con "guasto" per un flacone definito come un momento in cui meno di cinque mosche continuano a rispondere a stimoli geotassi negativo. Si noti che molti altri disegni di studio possibili e dei trattamenti statistici sono possibili, e il trattamento dei dati e di valutazione devono essere adattata per soddisfare scopi individuali.

Discussion

Il protocollo generale qui presentato è riuscita a documentare gli effetti fisiologici dopo l'allenamento. Tuttavia, diverse aree di questo protocollo sono soggetti a modifiche per soddisfare particolari esigenze sperimentali. Ad esempio, la lunghezza di formazione e il numero di attacchi potrebbe essere variata per rendere il programma più o meno impegnativo, come desiderato. L'altezza del contenitore in cui viene misurata la capacità geotassi negativa potrebbe essere modificato per aumentare l'area disponibile per il miglioramento essere documentata. Vari metodi di automatizzare quantificazione di salita velocità può anche essere applicabile. In linea di principio, qualsiasi programma software in grado di distinguere una mosca da sfondo può essere utilizzato per accelerare la raccolta dei dati di processo.

Alcuni aspetti del protocollo deve essere modificato solo con grande cautela, però. Ad esempio, esperimenti preliminari indicano fortemente che almeno un giorno di riposo a settimana tende a favorire una maggiore improvement di incessante esercizio quotidiano. Inoltre, i ritmi circadiani e la temperatura sono noti per influenzare il movimento di animali a sangue freddo. Il momento della giornata che la formazione si svolge può essere variata, ma deve sempre essere coerenti all'interno di particolari gruppi a confronto, al fine di evitare la possibilità di effetti confondenti di ritmi circadiani. Il controllo della temperatura è essenziale, e si consiglia una sala dedicata a temperatura costante di attrezzature da palestra a casa. Infine, maschi e femmine devono essere allevati e misurato separatamente, al fine di evitare il potenziale di effetti confondenti delle differenze di fertilità e del sesso in capacità di esercizio.

Le potenziali applicazioni di questa metodologia sono limitate solo dalla fantasia del ricercatore. Nel lavoro preliminare, abbiamo utilizzato questa metodologia in tre applicazioni principali:

1. Per misurare l'effetto di esercizio di resistenza su vari aspetti della biologia di tipo selvatico in tutta le età.
2. TO misurare l'effetto di esercizio di resistenza su specifici fenotipi mutanti.
3. Per lo screening per i fattori genetici che sono necessarie per eseguire i benefici dell'attività fisica

Ciascuna di queste applicazioni comprendono un'ampia varietà di possibilità specifiche. Sulla base della nostra esperienza preliminare, fenotipi mutanti tendono a variare con il livello di esercizio fisico, per quanto essi variano con la dieta. L'uso di modelli di invertebrati per capire meglio la relazione tra dieta, esercizio fisico, e la fisiologia dell'invecchiamento è forse l'applicazione più importante generale di questo protocollo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dayton Gearmotor	Grainger	1LRA6A
Raco Electrical Box	Grainger	5A052
Raco Cover	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fuse	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder	Grainger	1DD33
Carling Technologies Switch	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC Speed	Grainger	4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102