キイロショウジョウバエのための持久力トレーニングのプロトコルと縦パフォーマンスアッセイ

Summary

我々は、重要な遺伝的モデル生物種の最初の持久力トレーニングのプロトコルについて説明します。

Abstract

現代医学の研究者が直面する最も差し迫った問題の一つは、糖尿病と^1-3心血管疾患などの関連疾患の結果として増加し、肥満の急増レベルです。これらの関連する健康上の問題への研究の重要なトピックでは、有益な介入として持久的運動の役割が​​含まれます。

運動トレーニングは、過剰な体脂肪⁴の減少など、いくつかの有益な結果、安価な、非侵襲的な介入である抗炎症作用と抗酸化反応^6、心筋⁷で改良された収縮能力を増加させ、骨格筋⁵にインスリン感受性を増加させた。低強度の運動は重要な中間体^9,10のように転写コアクチベーターPGC1-αで、人間^8、マウスのミトコンドリア活性と生合成を増加させることが知られています。

アンデスピTEは、いくつかの重要な加齢に伴う病気との闘いのためのツールと​​しての運動の重要性、広範な長手方向の遺伝学的研究は、短命の遺伝的モデル種の持久力トレーニングプロトコルの不足によって妨げられてきた。 ショウジョウバエで使用可能な遺伝子の様々なツールの組み合わせは、その寿 ​​命が短いと安価なメンテナンスと、それはこれらの遺伝的メカニズムのさらなる研究のための魅力的なモデルを確認します。このことを念頭に置いて我々は、大規模なキイロショウジョウバエの ¹¹の運動トレーニングのためのパワー·タワーと呼ばれる新規な装置を開発しました。パワータワーは繰り返し急速な登山を誘導するためのハエの本能的な負の走地性の動作を利用しています。その後たびにマシンリフト、滴、ハエのプラットフォームは、ハエを登るように誘導されています。ハエは限りマシンが動作中か、彼らはあまりにも応答するために疲労になるまでであるように応答し続けています。したがって、研究者は、sを提供するためにこのマシンを使用することができます年齢をマッチさせたと遺伝的に同一のハエの大量へimultaneousトレーニング。さらに、我々はトレーニング中にハエのコホートの長手方向の進行状況を追跡するために有用な、関連するアッセイを説明します。

Protocol

1。パワータワーセットアップと操作

1. パワータワーは、テーブルにクランプされ合板の長方形の部分に配置されます。グレインジャーから4.5回転ギアモータは、4つの2 "X6"ボードと1¾インチの合板の上にかかっている。スイッチのオン/オフモーター、AC / DCの速度制御、ヒューズ、接合ボックスに一緒に配線されています。
2. モーターを冷却するために、直径の穴3インチは、合板の縦方向の½インチ片にカットされます。一方の側に、3インチのファンは合板に取り付けられており、他方では、3インチ径の金属シリンダーが取り付けられている。
3. 端に取り付けられたローラーを使用したカスタムメイドの回転アームは、モータに接続されています。モータと接続されたアームがドアのヒンジの合板に取り付けられている曲がった¾インチ角チューブの株式の片側を押し下げ、時計回り方向に回転します。ホイールは、それがdirはプラットフォームに対してロールバックを可能にするために、プラットフォーム下にチューブ株式の上面に取り付けられているectlyその上。
4. 腕は、チューブの在庫の一方の端にプッシュダウンすると2つのレベルのプラットフォーム（図1D）を引き上げ、もう一方の端を持ち上げる。アームのローラーがチューブの株式をクリアしたときには、アーム（図1F）バックダウンプラットフォームをドロップし、開始位置に戻ることができます。
5. プラットフォームでは、合板の上に配置し、ネジの目にフックされているバンジーコードによって保護されているラックで構成されています。プラットフォームには、括弧で合板に取り付けられている引き出しのスライダに沿ってスライドさせ、ダウンします。
6. バイアルは、ラックに入れ、バンジーコードのある場所に保持されている正方形のグリッド画面で保護されています。
7. 発泡スチロールのクッションは、ドロップの衝撃を弱めるためのプラットフォームの下に配置されます。
8. モータの電源が完全に回転周期が15秒の長さになるように調整されます。

2。運動プロトコル

1. ハエは50％の湿度と12時間の明/ DAを使用して、25℃インキュベーターに収容されていますRKサイクル。運動トレーニングと運動能力の評価の両方を25°C恒温室で行われます。
2. ハエは、それぞれ他の1〜2日以内に収集し、年齢をマッチさせています。 240ハエの最小値は、耐久性と負の走地性（クライミング）能力、運動トレーニングの効果を反映する2つの生理学的指標の長手方向のモニタリングが必要となります。長手方向の監視は、コホート間の変化から交絡影響を与えることなく、各コホートの開始値に対して相対的に誘導される変化の分離を可能にします。必要に応じて追加の実験のためにハエを収集する必要があります。
3. コレクションした後、ハ​​エが行使されることはありません運動療法、および120のコントロールハエに供される120実験的なハエ、に分かれています。ハエは20ハエ、それぞれのバイアルに格納されています。実験的なハエのバイアルは、しっかりとしたセルロースアセテートFlugsとコントロールのバイアル（未行使）と接続されているハエは​​柔らかいSPOと接続されているパワータワーの間にハエを固定するためにプッシュダウンすることができゲイン誤差ストッパー。その適応サイズがバイアルの底の近くに簡単に配置することができますので、スポンジを固定化するために使用されます。柔らかいスポンジの材料はまた、より強固なFlugsによる傷害を減らすことができます。
4. パワータワーのハエは、空のバイアル中に行使されたハエより柔らかい着陸でそれらを提供する食品を5 mLを含むバイアルに格納され、行使されています。我々はトレーニングセッションの途中で頻繁に食べるハエを観察していないものの、食品は、通常、10％ショ糖、10％の酵母、水に2％の寒天で構成されています。空のバイアルは、トレーニング中に使用されている場合は、負傷ハエの割合は劇的に増加されています。
5. パワータワーは25℃に維持される温度制御室℃で運営されてい実験的なハエは、パワータワーの上に置き、登るために作られています。制御ハエもパワータワーに置かれますが、スポンジのストッパーがpusheあるさバイアルハエより約3ミリメートルの動きを制限するためにDにダウンします。このグループは、運動とは無関係であるパワー·タワーのいずれかの効果のコントロールとして機能します。いくつかの部屋はまだ操作にこれらのハエのために存在していますが、我々は繰り返しこれらの条件下でのハエはほとんど実行して行使する生理反応を示さないことを観察した。また、すべてにおいてパワー·タワー上に配置されていない追加の対照群を含めることが望ましいかもしれません。
6. ハエは、ランプのスケジュール（図2）を利用して、それぞれの週5日間連続を行使しています。週1の間にハエは、セッションごとに3時間のセッションごとに2時間、セッションあたり2.5時間週2、週3のために行使されています。他のレジメンがテストされているが、このプロトコルは、遺伝子間や分岐条件の下で一貫性のある結果を生成します。このプロトコルは、しかし、特定の実験に合わせて可能性のあるバリエーションの広い配列に従うものとします。

1. 持久運動時の疲労までの時間が与えられたコホートの運動能力を確認し、および/または定量するための有用な生理的な指標である。疲労のアッセイは、トレーニング実験に使用されるコホートで長手方向に実行することができます。アッセイは、トレーニングプロトコル、または両方が完了した後、トレーニング前にどちらかを行ってもよい。訓練中に増分進行状況をグラフ化が必要な場合は他の中間時点を追加することができます。疲労アッセイはまた、食事の変化（図3B）としてのトレーニングプロトコル以外の治療への応答として、運動の持久力を測定するために使用することができます。
2. 訓練が行われていない場合に疲労のアッセイは、日に実施されるべきである。実験と制御の両方のハエは、20のそれぞれのバイアルにパワータワーの上に置き、疲労まで登るに作られています。疲労はある登山と負の走地性の刺激に応答するための障害として認識されているhavior。疲労の動作が目視により採点される。
3. 5またはより少ないハエは4つの連続した​​ドロップの2インチよりも高い上昇することができたときにハエのバイアルは、 "疲れた"と見なされます。それはまだ動作している間に疲れたバイアルは、パワータワーから削除され、除去の時間が記録されます。除去の時間は、ネストされたヒストグラムとして、または "タイム·トゥ·失敗"としてプロットすることができます。 "タイム·トゥ·失敗"のプロットは、図3Bに示されるようにデータの例としては、プロットされます。
4. バイアルは10時間（図3B）の最大10分間隔で監視されています。

4。運動、年齢、自発運動能力

1. このトレーニングプロトコルが誘導される実行挙動に依存しているので、トレーニングの効果を定量化するための主要なアッセイは、長手方向にトレーニング中の平均走行速度の変化を測定することである。訓練の過程で、行使し、未行使のハエ120オンザフライコホートは、負の走地性のへの応答のために毎日テストされていますtimulus。リング技術は、ガルガーノらで説明しています。 （2005）は、ハエのクライミング能力^12を測定するために使用されています。簡単に言えば、この手法は、負の走地性の誘導の後に定義された時間の間にハエのバイアル増の平均身長を測定します。定義された時間の間に登った高さは、速度を登ると同等です。測定は、一日の実行後に疲労から合併症を避けるように毎日の訓練のためにマシン上でハエを配置する前に実行されます。
2. 当社の標準プロトコルでは、ハエは三週間の合計で行使されたと登山能力は、5週間の合計を検討されています（図2）演習の中止後、運動トレーニングと2週間の間に三週間。これは、実験者はモビリティに対する運動の効果は、プログラムの停止後も持続するかどうかをグラフ化することができます。
3. 各コホートの毎日のRINGの性能つの写真が能力を登るの分析のために使用されています。シックス·バイアルは、それぞれの写真に含まれています。負のグラムeotaxisが誘導され、時限カメラを使用して、写真が定義した秒数後に撮影されます。これは実験条件に応じて変化させることができますが、我々は通常、2秒を使用しています。すべての写真については、各バイアルは同じ高さの4つの象限に分割され、画像処理ソフトウェアは、各々がそれが割り当てられた期間内に到達象限に基づいてスコアを飛ぶ割り当てるために使用されます。一番上の象限は、4のスコアを受け取るために登るハエは、次の最高の象限に飛ぶ3を受け取り、2番目に高い受信象限に飛んで、最低の象限にハエが1を受け取ります。すべての下部から上昇しませんハエが0のスコアを与えられている。
4. 与えられた写真の各バイアルについては、 "登山インデックス"はそのバイアル内のすべてのハエのスコアを平均することにより生成されます。 4の写真から各バイアルの指標は、その日の最終的な登山のインデックスを与えるために平均化されます。
5. すべての負の走地性実験は、長手を実施していますdinally。結果は、能力を登山にコホートの変動の影響を軽減し、運動トレーニングの結果として、コホートの登山能力の相対的な長手方向の変化を強調するために初期の "事前運動"得点に正規化されます。最初のスコアは、最初の3日間の登山の指標の平均値によって決定され、1の値が割り当てられています。その後の試験は、初期インデックスのパーセンテージとして表されている。

5。代表的な結果

野生型のハエは、年齢の5週間（図3A）の向こう側に長手方向のリングアッセイに反映されているように、研修終了後の持続する能力を登山に減少した加齢に伴う減少と耐久性プロトコルに対応しています。負の走地性で、この遅延の減少は、野生型の運動応答が正常に行われていることを保証するために、ポジティブコントロールとして使用できる標準的な表現型の応答です。このデータセットは方法の例として提示されパワータワープログラムによる運動の誘導は、行動の入力として使用することができます。この効果を調節するための様々な遺伝的または環境的要因の能力は、その後、評価することができます。

逆に、パワー·タワーは、さまざまな実験的なデザインで出力として使用することができます。たとえば、遺伝子型、食事、またはその他の条件を変化させることができます。その後、運動生理学上でこれらの変動の影響は、パワータワーを使用してテストすることができます。ここでは、このアプローチの例を示します。ときに彼らの食事中のスクロースのさまざまな割合で飛んでは、増加持久力（図3B）と相関して疲労、増加したショ糖含有量までの時間を試験した。

図1。パワータワーの操作。それは曲がった角管と接触するまで、付属のローラー（AC）電動曲がったアームが時計回りに回転します（D、E）アームが持ち上げてハエのバイアルを積んでプラットフォームを引き起こして、曲がった角管を下にプッシュします。（F）腕のようにハエの一番下に戻すには、強制的にプラットフォームが戻って落ちるように許可されているチューブをクリアバイアル。

図2。運動プロトコルを提案した 。徐々に30分ごとに週単位で最初の2時間から運動の持続時間を増加させ3週間の長い傾斜のレジメンの下にそれぞれの週5日間の演習に加えられたトレーニングプロトコルにさらさ​​飛ぶ。標準分析では、前に疲労アッセイが含まれており、週〜5週1日から運動プログラムとリングアッセイを以下。すべてのアッセイは陰性対照として未行使のハエの数と同じ数の複製で実行されます。研究者によって決定された他の様々な生理学的または生化学的検査を行うことができる。

図3。持久的運動は、モビリティの複数の側面を変更します。（a）リングアッセイは、男性のY ¹ W ^67C23コホートの単一ペアでの年齢を越えて縦方向に実行されます。年齢をマッチさせ、遺伝的に同一行使し、未行使のコントロールハエは、平均上昇速度を毎日測定した。結果は、測定の最初の3日間にわたって平均登山の高さに正規化されている登山のインデックスで表現されています。運動訓練されたハエは、年齢（2ウェイANOVA、P <0.005）全体の年齢をマッチさせた未行使の兄弟に比べ負の走地性能力の低下、年齢関連の低下を表示します。 （B）年齢をマッチさせた女性のカントンSハエで8時間行った疲労のアッセイは、疲労（ログランク、P <0.0001）までの時間に食事ショ糖含有量の有意な効果を示しています。実験に先立って、ハエはいや10％重量/容量で、酵母/スクロース/アガー飼料を与えたセント濃度、食事ショ糖の変化割合。 20ハエ各五バイアルは、各食事のためにテストされています。グラフは、まだ与えられた時点で5以上のハエを実行しているどのように多くのバイアルに表示されます。これらの結果は、5人未満のハエは負の走地性刺激に応答し続ける時間のポイントとして定義されているバイアルの "失敗"と、生存（または失敗になるまでの時間）曲線として統計的に、グラフィカルに扱うことができます。他の多くの可能性の研究デザインと統計的治療が可能であり、データ処理と測定は、個々の目的に合わせて調整する必要があることに注意してください。

Discussion

ここで紹介する一般的なプロトコルでは、トレーニング後の生理作用を文書化することに成功してきました。しかし、このプロトコルにはいくつかの領域が特定の実験のニーズに合わせて変更の対象となります。必要に応じて、例えば、発作のトレーニングや数の長さは潜在的に、プログラムが多かれ少なかれ困難なように変えることができます。負の走地性の能力が測定されるコンテナの高さは文書化されるように改善のための利用できる領域を増やすように変更することができます。スピード登山の定量を自動化するさまざまな方法でも適用可能である。原理的には、背景からハエを区別することができる任意のソフトウェアプログラムは、データ収集プロセスを高速化するために使用することができます。

プロトコルのいくつかの側面は、しかし、慎重でのみ変更する必要があります。たとえば、予備実験を強く週の残りの少なくとも一日が大きく表示回数を容易にする傾向があることを示している執拗な毎日の運動よりovement。さらに、概日リズムと温度は冷血動物の動きに影響を及ぼすことが知られています。訓練が行われた日の時間は、概日リズムの交絡影響の可能性を避けるために、変化することができますが、常に比較の下に特定のグループ内で一貫している必要があります。温度制御も不可欠であり、我々は家の運動器具に一定の温度で、専用の部屋をお勧めします。最後に、雄と雌が運動能力の出生や性別の違いの交絡影響の可能性を避けるために、別々に飼育して測定する必要があります。

この方法の潜在的なアプリケーションは、研究者の想像力によって制限されます。予備研究では、3つの広範なアプリケーションでこの方法を利用してきた。

1. 年齢を越え、野生型の生物学のさまざまな側面に関する持久力運動の効果を測定します。
2. T特定の変異体の表現型上の持久的運動の効果を測定するO。
3. 運動の利点を実行するために必要な遺伝的要因のために画面に

これらの各アプリケーションは、特定の可能性は多種多様を網羅しています。我々の予備的経験に基づいて、変異体の表現型は、食事によって変わるできるだけ運動レベルに応じて変化する傾向があります。良い食事、運動、老化生理の間の関係を理解するために無脊椎動物モデルの使用は、おそらく、このプロトコルの中で最も重要な一般的なアプリケーションです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dayton Gearmotor	Grainger	1LRA6A
Raco Electrical Box	Grainger	5A052
Raco Cover	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fuse	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder	Grainger	1DD33
Carling Technologies Switch	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC Speed	Grainger	4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102