Summary
우리는 중요한 유전자 모델 종족에 대한 최초의 지구력 훈련 프로토콜을 설명
Abstract
현대 의학 연구자가 직면하고있는 가장 중요한 문제 중 하나는 당뇨병과 1-3 심혈관 질환 등 관련 질환의 논리상 필연의 증가로, 비만의 서징 수준이다. 이러한 관련 건강 문제에 대한 연구의 중요한 주제 유익한 개입과 같은 지구력 운동의 역할을 포함한다.
운동 훈련은 과도한 신체 지방 4의 감소 등 여러 유익한 결과와 저렴한, 비침습 개입니다 안티 염증과 산화 방지 반응 6 및 cardiomyocytes 7의 향상된 수축성 용량을 증가, 골격근 5에서 인슐린 감도를 증가했다. 낮은 강도의 운동은 중요한 중간 9,10로 transcriptional coactivator PGC1-α와 함께 인간 8 생쥐의 mitochondrial 활동과 biogenesis을 높이는 것으로 알려져 있습니다.
Despi그런데 몇 가지 중요한 연령과 관련된 질병을 퇴치하기위한 도구로서 운동의 중요성, 광범위한 종방향 유전자 연구는 수명이 짧은 유전자 모델 종족에 대한 지구력 훈련 프로토콜의 부족에 의해 장애가되었습니다. 함께 자사의 짧은 수명과 저렴한 유지 보수와 Drosophila에서 사용할 유전 도구의 다양성은 그것이 유전 메커니즘 진학을위한 매력적인 모델을 확인합니다. 이 염두에 우리는 대규모 Drosophila melanogaster 11에서 운동 훈련을위한 파워 타워로 알려진 소설 장치를 개발했습니다. 파워 타워 반복적으로 신속한 등반을 일깨우는 파리 '무조건적인 부정 geotaxis 동작을 활용합니다. 때마다 기계 리프트는, 그때 들어가게되고, 파리의 플랫폼, 파리는 등반에 시달릴 수 있습니다. 파리가 한 기계가 가동하거나 너무 반응 피곤이 될 때까지 그대로 대응할 것을 계속한다. 따라서 연구원의에게 제공하기 위해이 시스템을 사용할 수 있습니다연령 일치 및 유전자 동일 파리 다수에 imultaneous 훈련. 또한, 우리는 훈련 기간 동안 파리 무리들이 세로 진행 상황을 추적할 유용한 관련 assays을 설명합니다.
Protocol
1. 파워 타워 설치 및 운영
- 파워 타워는 테이블에 채워되는 합판의 사각형 부분에 위치합니다. Grainger의 4.5 RPM이 기어 모터 네 개의 2 "X6"보드와 하나 잡았다 인치 합판 보드의 상단에 달려있다. 모터, AC / DC 속도 제어, 퓨즈 및 스위치 오프에 /이 시점 상자에 함께 유선됩니다.
- 모터를 냉각하기 위해 직경 구멍 3인치은 합판의 수직 ½ 인치 조각으로 절단된다. 한쪽에서 3 인치 팬을는 합판에 부착하고 있으며, 다른 한편으로는, 3 인치 직경의 금속 실린더가 장착됩니다.
- 끝부분에 장착된 롤러와 맞춤 회전 팔이 모터에 연결됩니다. 모터와 연결된 팔이 도어 힌지와 합판에 부착되는 휘어 잡았다 인치 정사각형 튜브 주식 한쪽을 밀어, 시계 방향으로 돌린다. 바퀴는 그것이 디렉토리는 플랫폼에 대한 롤 수 있도록 플랫폼 아래 튜브 주식의 상단 측면에 첨부되어ectly 그 위에.
- 팔이 튜브 주식의 한쪽 끝을 아래로 밀어 올려진 두 수준의 플랫폼 (그림 1D)를 높여, 반대쪽 끝은 올렸어. 팔에 롤러가 튜브 주식을 정리할 때 그것은 팔이 (그림 1 층)로 내려 플랫폼을 포기, 시작 위치로 돌아갈 수 있습니다.
- 플랫폼은 합판 위에 위치하며 나사 눈에 매혹 번지 코드에 의해 확보되는 랙에 구성되어 있습니다. 플랫폼은 괄호와 합판에 연결된 서랍 슬라이더를 따라 밀어 올렸다가 아래로.
- 튜브는 랙에에 위치하고 번지 코드와 장소에서 개최되는 사각형 그리드 화면을 확보할 수있다.
- 스티로폼 쿠션은 드롭의 충격을 저해할 수있는 플랫폼을 아래에 배치됩니다.
- 모터의 힘은 완전한 회전 기간이 15 초 길이와 같은 것을 조정됩니다.
2. 운동 프로토콜
- 파리는 50 % 습도와 12 시간 라이트 / 검사와 25 ° C 배양기 안에 보관되어있다RK주기. 운동 교육과 운동 능력의 평가는 모두 25 ° C 온도 조절 실에서 실시하고 있습니다.
- 파리는 서로 1-2 일 내에 수집 및 나이에 일치됩니다. 240 파리의 최소 지구력과 부정 geotaxis (등반) 능력, 운동 훈련의 효과를 반영하는이 생리적 지표의 세로 모니터링이 필요합니다. 세로 모니터링은 동료 간의 편차의 혼란함을 주죠 효과없이, 각 일대에 대해 시작 값과 비교한 유발 변경의 격리 수 있습니다. 필요에 따라 추가적인 실험을위한 파리가 수집되어야한다.
- 수거 후, 파리가 행사되지 않습니다 운동 처방, 120 제어 파리,를 받게됩니다 120 실험적인 파리,으로 나뉩니다. 파리는 각을 날아 20 튜브 안에 저장됩니다. 실험 파리의 튜브는 확고한 셀룰로스 아세테이트 Flugs 및 제어 튜브 (unexercised)과 연결되어있는 파리 부드러운 spo와 연결되어 있습니다파워 타워에있는 동안 파리를 고정하기 위해 엎드리게 수 nge의 stoppers. 그 적응력 크기 유리병의 하단에 쉽게 배치를 허용하기 때문에 스폰지가 고정에 사용됩니다. 부드러운 스폰지 재질도 더 단단한 Flugs로 인한 부상을 줄여줍니다.
- 파워 타워에 파리가 저장되고 빈 튜브 안에 행사하고 파리보다 부드러운 착륙 그들을 제공하는 음식의 5 ML을 포함 튜브 안에 행사하고 있습니다. 우리가 훈련 과정 중에 자주 먹는 파리를 관찰하지는 않지만 음식은 일반적으로 10 %의 자당, 10 % 효모, 그리고 물에 2 % 한천로 구성되어 있습니다. 빈 유리병이 훈련 중에 사용하는 경우 부상의 고통을 파리의 비율이 급격히 증가하고 있습니다.
- 파워 타워 25 유지되며 온도 제어 룸 ° C로 운영하고 있습니다 실험 파리는 파워 타워에 위치하고 오르려고 만들어집니다. 컨트롤 파리는 또한 파워 타워에 놓여 있지만, 스폰지 마개가 pushe가있다유리병 파리 위에 약 3mm 움직임을 제한하는 순서로 D 내려. 이 그룹은 운동 관련이없는 파워 타워의 효과에 대한 제어 역할을합니다. 일부 방은 아직도 책략에이 파리에 존재하지만, 우리는 반복적으로 이러한 조건 하에서 파리는 거의 실행하고 행사할 생리적 반응을 설명하지 않는 것이 관찰되었습니다. 또한 전혀 파워 타워에 게재되지 않은 추가 컨트롤 그룹을 포함시키는 것이 바람직하다 수 있습니다.
- 파리는 ramped 일정 (그림 2)를 활용, 매주 다섯 경기를 연속 일 행사하고 있습니다. 일주일에 동안 파리는 세션 당 2.5 시간 2 시간 세션 당, 주 두 행사되며, 세션 당 3 시간 동안 매주 3. 다른 regimens가 테스트한 있지만,이 프로토콜은 genotypes 전역하고 분기하는 조건 하에서 일관성있는 결과를 생산하고 있습니다. 이 프로토콜은 그러나, 특정 실험에 적합한 수 가능한 유사 콘텐츠의 다양한 적용을받습니다.
- 지구력 운동 중에 피로에 시간이 주어진 일대의 운동 능력을 확인 및 / 또는 quantitate 수있는 유용한 생리적 지표입니다. 피로 assays는 교육 실험에 사용됩니다 동료에 길이 방향을 수행할 수 있습니다. Assays은 훈련 프로토콜, 또는 두 가지 모두의 완료 후, 훈련에 대한 사전 중 실시됩니다. 훈련 기간 동안 점진적 진보를 차트 것이 필요한 경우에는 다른 중간 타임 포인트는 추가할 수 있습니다. 피로 분석은 또 다이어트 변조 (그림 3B)와 같은 훈련 프로토콜 이외의 치료에 대한 반응으로 운동 지구력을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
- 훈련이 진행되지 않을 때 피로 assays는 하루에 실시해야합니다. 실험 및 제어 모두 파리 20 각각의 튜브 안에 파워 타워에 위치하고 피로까지 오르려고 만들어집니다. 피로는이 등반과 함께 부정적인 geotaxis의 자극에 반응하는 실패로 인식되고havior. 피로 행동은 시각적 관찰에 의해 채점된다.
- 5 개 이하 파리가 연속 4 술을 높이보다 2 인치 올라갈 수있을 때 파리의 유리병은 "피로"로 간주됩니다. 아직도 작동하는 동안 피곤 튜브는 파워 타워에서 제거되며, 제거 시간이 기록됩니다. 제거 시간은 중첩된 히스토그램과 같은, 또는 "시간 - 투 - 실패"플롯으로 꾸몄다 수 있습니다. "시간 - 투 - 실패"플롯이 그림 3B에 나와있는 데이터의 예는 꾸몄다.
- 튜브는 10 시간 최대 10 분 간격 (그림 3B)에서 모니터링하고 있습니다.
4. 운동, 연령 및 운전하는 능력
- 이 훈련 프로토콜 유도된 실행 행위에 의존하고 있기 때문에, 훈련의 효과를 quantitating위한 주요 분석은 길이 방향 훈련을하는 동안 속도를 평균적으로 실행의 변화를 측정하는 것입니다. 교육의 과정 동안 행사 및 unexercised 파리의 120 비행 동료들은 부정적인 geotaxis s의 그들의 응답을 매일 테스트됩니다timulus. 링 기술은 Gargano 외에 설명되어. (2005)가 파리 '등반 능력 12 측정하는 데 사용됩니다. 간단히,이 기술은 부정적인 geotaxis의 유도 후 정의된 시간 동안 파리의 유리병으로 올라왔다는 평균 높이를 측정합니다. 정의된 시간 동안 올랐다 높이는 속도를 등반하는 것과 같습니다. 성능은 그날의 실행 후에 피로 합병증을 피할 수있는만큼 매일 훈련 시스템에 파리를 삽입하기 전에 수행됩니다.
- 우리의 표준 프로토콜에서는 파리의 세 주 총 운동하고 등산 능력 다섯 주 총 검사됩니다 (그림 2) 운동 정지 후 운동 훈련에 2 주 동안 3 주후에요. 이것은 실험자들이 이동성에 대한 운동의 효과는 프로그램의 중단 후에도 지속 여부 차트하실 수 있습니다.
- 각 일대의 일상 링의 성능 네 사진이 능력을 등산의 분석에 사용됩니다. 여섯 튜브는 각 사진에 포함되어 있습니다. 마이너스 geotaxis을 유발하고, 시간이 초과되었습니다 카메라를 사용하고, 사진은 초 정의된 숫자 뒤에 가져옵니다. 이것은 실험 조건에 따라 변경될 수 있지만 우리는 일반적으로 두 개의 초를 사용합니다. 모든 사진은 각 유리병이 동일한 높이 네 가지 quadrants로 나누어져 있으며, 영상 처리 소프트웨어는 각각의 플라이에게 그것이 할당된 기간 내에 도달 사분면을 기준으로 점수를 할당하는 데 사용됩니다. 최상위 분면, 4의 점수를받을 오르 파리는 다음 가장 높은 사분면에 날아 3 수신, 2를받을 두 번째로 높은 사분면에 날아, 그리고 가장 낮은 사분면에 파리가 1 받게됩니다. 모두 하단에 떨어져서 않아 파리는 0의 점수가 부여됩니다.
- 주어진 사진의 각 유리병 들어, "등산 색인"그 유리병에있는 모든 파리의 점수를 평균하여 생성됩니다. 네 가지 사진에서 각 유리병의 인덱스 그러면 그날을위한 최종 등산 색인을주고 평균값이됩니다.
- 모든 부정적인 geotaxis 실험은 longitu을 실시하고dinally. 결과는 능력을 등산에 일대 변화의 영향을 줄이고 운동 훈련의 결과로 일대의 등반 능력의 상대적 길이 변화를 강조하기 위해 초기 "사전 운동"점수로 정규화됩니다. 초기 점수는 첫 3 일 등산 인덱스의 평균에 의해 결정되며 값 1을 할당됩니다. 후속 실험은 다음 초기 색인의 비율로 표현됩니다.
5. 대표 결과
야생 형 파리는 나이 다섯 주 (그림 3A) 전체 길이 링 assays에 반영, 교육의 끝을 따라 지속 능력을 등산으로 줄었 연령과 관련된 감소와 지구력 프로토콜에 대응. 부정적인 geotaxis이 지연 하락은 야생 형 운동 반응이 정상적으로 발생되도록 긍정적인 컨트롤 역할을 수있는 표준 phenotypic 반응이다. 이 데이터 집합은 방법의 예로 설명하고있다파워 타워 프로그램에 의한 운동 유도는 행동 입력으로 사용할 수 있습니다. 이 효과를 조절하기 위해 다양한 유전이나 환경 요인의 기능은 다음 평가를 할 수 있습니다.
반대로, 파워 타워도 다양한 실험적인 디자인을 출력으로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 유전자형,식이 요법, 또는 다른 조건이 변경될 수 있습니다. 그렇다면, 운동 생리학에서 이러한 변형의 효과는 파워 타워를 사용하여 테스트할 수 있습니다. 여기서는이 방법의 예를 보여줍니다. 그들의 다이어트에 자당의 다양한 비율로 날아가 증가 내구 용량 (그림 3B)와 상호 피로, 증가 자당 내용의 순간을 시험 때.
1 그림. 파워 타워의 운영. 그것이 굽은 사각형 튜브와 접촉에 와서까지 연결된 롤러와 (AC) 동력 구부러진 암은 시계 방향으로 회전합니다. (D, E)은팔을 들어올리하는 파리의 튜브와 라덴은 플랫폼을 초래 구부러진 사각 튜브에 엎드려 못살게 굴지. (F) 팔로서 파리는 맨 아래로 돌아가려면 강제로, 플랫폼을 다시 아래로 떨어질 수있는 튜브를 지웁니다 유리병.
그림 2. 운동 프로토콜을 제안했습니다. 훈련 프로토콜에 노출 날아은 점차적으로 삼십분 매주 의해 초기 이시간부터 운동 지속 시간을 증가 3 주 동안 ramped 처방하에 매주 5 일 동안 운동 만들어집니다. 표준 분석 전에 피로 assays를 포함하고 주 1-5 주 1에서 운동 프로그램 및 링 assays를 따라. 모든 assays는 부정적인 컨트롤과 같은 unexercised 파리의 동등한 수를 중복으로 수행됩니다. 연구원에 의해 결정으로 다른 여러 가지 생리적 또는 생화 학적 검사를 실시 할 수 있습니다.
그림 3. 지구력 운동은 이동성의 여러 측면을 바꿀지도 모르겠어. () 링 assays는 남성 Y 1 W 67C23 무리들이 한 쌍의에서 연령대에 걸쳐 길이 방향 수행했습니다. 연령 일치, 유전적으로 동일 행사 및 unexercised 컨트롤 파리가 평균 등반 속도를 위해 매일 측정되었다. 결과는 측정의 첫 삼일에 걸쳐 평균 등반 높이로 정규화되어 등산 색인의 측면에서 표현됩니다. 운동 훈련 파리 한참 (2 방향 ANOVA, P <0.005)에 걸쳐 연령 일치 unexercised 형제 자매에 비해 부정적인 geotaxis 능력의 줄었 연령과 관련된 감소 표시됩니다. (B) 피로 assays는 8 시간 동안 실시 나이에 일치하는 여성 광동 S 파리가 피로 (로그인 순위, P <0.0001)로 시간에식이 자당 내용의 상당한 효과를 보여줍니다. 실험에 앞서, 파리는 터무니없이 10 %의 무게 / 부피로, 효모 / 자당 / 한천 다이어트 먹힌세인트 농도 및식이 자당의 다양한 비율입니다. 20 파리 각각 다섯 병은 각 식단에 대해 검사되었습니다. 그래프는 여전히 주어진 시점에서 실행되는 5 개 이상의 파리가 얼마나 많은 병을 표시됩니다. 이러한 결과는 이하보다 네다섯 파리는 부정적인 geotaxis의 자극에 대응하기 위해 지속적으로 시간에 지점으로 정의되는 유리병은 "실패"로 생존 (또는 실패에 시간) 곡선으로 통계 및 그래픽 처리하실 수 있습니다. 많은 다른 가능한 연구 설계 및 통계 치료가 가능하며, 데이터 처리 및 측정은 각각의 목적에 맞게 맞게 조정해야합니다.
Discussion
여기에 제시된 일반적인 프로토콜은 훈련을 다음과 생리적 효과를 문서화에 성공했다. 그러나,이 프로토콜의 여러 부분 특히 실험적인 요구에 맞게 변경이 적용됩니다. 예를 들어, 관찰 훈련과 전화 번호의 길이는 잠재적으로 프로그램이 더 많거나 적은 도전, 원하는대로 만들기 위해 변경될 수 있습니다. 부정적인 geotaxis 능력 측정되는 컨테이너의 높이는 문서화하도록 개선을위한 가능한 지역을 높이기 위해 변경될 수 있습니다. 속도 등반의 quantitation을 자동화하는 다양한 방법도 적용할 수 있습니다. 원칙적으로, 배경에서 파리를 구별 할 수있는 소프트웨어 프로그램은 데이터 수집 과정을 빠르게하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜의 일부 측면은 있지만, 아주 신중하게에만 수정해야합니다. 예를 들어, 예비 실험 강력히 주당 휴식 중 최소 한 하루 더 노출수을 촉진하는 경향이 있음을 나타냅니다잔인한 매일 운동보다 ovement. 또한, circadian 리듬과 온도는 냉혈 동물의 움직임에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 교육이 이루어지는 것이 하루 중 시간이 circadian 리듬의 혼란함을 주죠 효과의 가능성을 피하기 위해, 변경될 수 있지만, 항상 비교 하에서 특히 그룹 내에서 일치해야합니다. 온도 제어는 필수적이며, 우리는 집에서 운동기구로 일정한 온도에서 전용 공간을 권장합니다. 마지막으로, 남성과 여성은 운동 능력의 다산과 성별 차이의 혼란함을 주죠 효과의 가능성을 방지하기 위해 별도로 reared 및 측정되어야한다.
이 방법론의 잠재적인 응용 프로그램은 연구자의 상상력에 의해 제한됩니다. 초기 작품에서는 세 가지 광범위한 애플 리케이션에서이 방법론을 활용했습니다
- 연령대에 걸쳐 야생 형 생물학의 다양한 측면에 지구력 운동의 효과를 측정하는 수단으로 활용합니다.
- 티특정 돌연변이 phenotypes에 인내 운동의 효과를 측정 O.
- 운동의 이점을 실행하는 데 필요한 유전적 요인에 대한 화면으로
이러한 응용 프로그램들은 각각 특정한 가능성을 다양하게 구성되어 있습니다. 우리의 예비 경험을 바탕으로 돌연변이 phenotypes들은 식단에 따라 달라질 수만큼 운동 수준에 따라 달라질하는 경향이있다. 좋은식이 요법, 운동, 그리고 노화 생리학의 관계를 이해하는 invertebrate 모델의 사용은 아마도이 프로토콜의 가장 중요한 일반적인 응용 프로그램입니다.
Disclosures
나는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NHLBI에서 RW에 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dayton Gearmotor | Grainger | 1LRA6A | |
| Raco Electrical Box | Grainger | 5A052 | |
| Raco Cover | Grainger | 5A053 | |
| Cooper Bussmann Fuse | Grainger | 6F043 | |
| Cooper Bussmann Fuse Holder | Grainger | 1DD33 | |
| Carling Technologies Switch | Grainger | 2X464 | |
| Dayton Control, AC/DC Speed | Grainger | 4X796 | |
| Flugs for Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 |
References
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