Utholdenhetstrening protokoll og Langsgående Ytelse Analyser for Drosophila melanogaster

Summary

Vi beskriver det første utholdenhetstrening protokoll for en viktig genetisk modell arter,

Abstract

En av de mest presserende problemene moderne medisinske forskere er den buldrende nivåer av fedme, med påfølgende økning i tilknyttede lidelser som diabetes og hjerte-og karsykdommer ^1-3. Et viktig tema for forskning på disse tilknyttede helseproblemer innebærer rolle utholdenhetstrening som en gunstig intervensjon.

Trening er en billig, ikke-invasiv intervensjon med flere gode resultater, blant annet reduksjon i overkant kroppen fett ^4, økt insulinfølsomhet i skjelettmuskulaturen ^5, økt anti-inflammatorisk og antioksidative responser ^6, og forbedret kontraktile kapasitet i cardiomyocytes ^7. Lav intensitet er kjent for å øke mitochondrial aktivitet og biogenesis hos mennesker ⁸ og mus, med transcriptional coactivator PGC1-α som en viktig mellomliggende ^9,10.

DespiTe viktigheten av mosjon som et verktøy for å bekjempe flere viktige aldersrelaterte sykdommer, har omfattende longitudinelle genetiske studier blitt forhindret av mangel på en utholdenhetstrening protokoll for et kortvarig genetiske modellen arter. Variasjonen av genetiske verktøy for bruk med Drosophila, sammen med sin korte levetid og rimelig vedlikehold, gjør det til et attraktivt modell for videre studier av disse genetiske mekanismer. Med dette i tankene har vi utviklet en roman apparat, kjent som Power Tower, for storskala trening-trening i Drosophila melanogaster ^11. The Power Tower utnytter de fluene 'Choice instinktiv negativ geotaxis atferd til gjentagelser indusere rask klatring. Hver gang maskinen heiser, deretter synker, plattformen av fluer, er fluene overtalt til å klatre. Fluer fortsette å svare så lenge maskinen er i drift eller til de blir for slitne til å svare. Dermed kan forskeren bruke denne maskinen til å gi simultaneous opplæring til et stort antall av samme alder og genetisk identiske fluer. I tillegg beskriver vi tilhørende analyser nyttige å spore langsgående fremdriften av Fly kohorter under trening.

Protocol

1. Power Tower Oppsett og drift

1. Power Tower er plassert på et rektangulært stykke kryssfiner som er klemt fast i en tabell. En 4,5 rpm gear motor fra Grainger hviler på toppen av fire 2 "x6" styrer og en ¾ tomme kryssfiner bord. Motoren, en AC / DC hastighetskontroll, en sikring, og en av / på-bryter er kablet sammen til ett knutepunkt boks.
2. For å kjøle motoren, er et hull 3 inches i diameter kuttes i en vertikal ½ tommers stykke kryssfiner. På den ene siden, er en 3-tommers vifte festet til kryssfiner, og på den andre, er en 3-tommers diameter metallsylinder vedlagt.
3. En skreddersydd roterende arm med rulle montert på enden er koblet til motoren. Motoren og vedlagte arm rotere med klokken, presser nedover én side av en bøyd ¾ tomme firkantrør lager som er festet til kryssfinér med en dørhengsel. Et hjul er festet til oversiden av røret lager under plattformen for å la den rulle mot plattformen som er directly over det.
4. Armen presser ned på den ene enden av røret lager og løfter motsatt ende, heve en to-nivå-plattformen (figur 1D). Når valsen på armen fjerner røret lager det lar armen å gå tilbake til startposisjonen, slippe plattformen tilbake (figur 1F).
5. Plattformene består av reoler som er plassert på toppen av kryssfiner og sikret med strikk ledninger som er hektet på skrue øyne. Plattformene gli opp og ned langs skuff glidere som er festet til kryssfinér med parentes.
6. Hetteglass er plassert inn i kurvene, og sikret med en kvadratisk rutenett skjerm som holdes på plass med strikk ledninger.
7. En Styrofoam puten er plassert under plattformen for å dempe sjokket av dråpen.
8. Kraften av motoren er justert slik at en full rotasjon periode er 15 sekunder lang.

2. Trening protokoll

1. Fluer er plassert i en 25 ° C inkubator med 50% fuktighet og en 12-timers lys / mørke-syklusen. Both trening og vurdering av arbeidskapasiteten er gjennomført i en 25 ° C temperaturkontrollert rom.
2. Fluer er innsamlet og alder-matchet innen 1-2 dager etter hverandre. Et minimum av 240 fluer er nødvendig for langsgående overvåking av utholdenhet og negative geotaxis (klatring) evne, to fysiologiske indikatorer som gjenspeiler effekten av fysisk trening. Langsgående overvåking kan isolering av indusert endring i forhold til startverdiene for hver årsklasse, uten konfunderende effekter fra variasjon mellom kohortene. Fluer for flere eksperimenter bør samles etter behov.
3. Etter samlingen blir fluer fordelt på 120 eksperimentelle fluer, som vil bli utsatt for øvelsen diett, og 120 kontroll fluer, som ikke vil bli innløst. Fluene er lagret i hetteglass med 20 fluer hver. De hetteglass med eksperimentelle fluer er koblet med faste celluloseacetat Flugs og ampuller av kontroll (unexercised) fluer er koblet med myk svamp propper, which kan skyves ned til immobilize fluene mens på Power Tower. Svamp brukes for immobilisering fordi adaptive størrelse gir enkel plassering nær bunnen av flasken. Den mykere svamp materiale reduserer også skader forårsaket av de mer solide Flugs.
4. Fluer på Power Tower lagres og utøves i hetteglass som inneholder 5 ml av mat, som gir dem med en mykere landing enn fluer som er utøvet i tomme hetteglass. Maten er vanligvis består av 10% sukrose, 10% gjær, og 2% agar i vann, selv om vi ikke observerer fluer å spise ofte i løpet av en treningsøkt. Hvis tomme flasker blir brukt under trening, er prosentandelen av fluer som lider skader dramatisk økt.
5. The Power Tower drives i et temperaturkontrollert rom som holdes på 25 ° C. Eksperimentelle fluer er plassert på Power Tower og laget for å klatre. Kontroll fluer er også plassert på Power Tower, men svampen stopperen skyves ned i vIAL ca 3 mm over fluene for å begrense bevegelsen. Denne gruppen fungerer som en kontroll for eventuelle effekter av Power Tower som ikke er relatert til trening. Selv om noen plass fortsatt eksisterer for disse fluene til å manøvrere, har vi gjentatte ganger observert at fluer under disse forholdene kjøre veldig lite og ikke demonstrere en fysiologisk respons på trening. Det kan også være ønskelig å inkludere en ekstra kontroll gruppe som ikke er plassert på Power Tower i det hele tatt.
6. Fluer utøves fem påfølgende dager hver uke, bruk en trappet tidsplan (figur 2). I uke en fluene utøves i 2 timer per økt, uke to i 2,5 timer per økt, og uke tre i 3 timer per økt. Selv om andre regimer har blitt testet, produserer denne protokollen konsistente resultater på tvers av genotyper og under forskjellige forhold. Denne protokollen er imidlertid underlagt en rekke mulige varianter som kanskje passer til et bestemt eksperiment.

3. Trening og locomotor Fatigue

1. Tid til utmattelse under utholdenhets trening er en nyttig fysiologisk indikator for å bekrefte og / eller quantitate arbeidskapasiteten til en gitt kohort. Trøtthet analyser kan utføres i lengderetningen på årskull som skal brukes i opplæring eksperimenter. Analyser kan utføres enten før trening, etter ferdigstillelse av opplæringen protokollen, eller begge deler. Andre mellomtid poeng kan legges til hvis kartlegge inkrementell utvikling under trening er ønsket. Utmattelsen analysen kan også brukes til å måle utholdenhet som en respons på behandlinger andre enn trening protokoll, for eksempel kosthold endring (Figur 3B).
2. Trøtthet analyser bør gjennomføres på en dag når treningen ikke finner sted. Både eksperimentelle og kontroll fluer er plassert på Power Tower i hetteglass med 20 hver, og laget for å klatre helt til trett. Fatigue er anerkjent som svikt til å svare på en negativ geotaxis stimulus med klatring oppførsel. Trøtthet behavior lages av visuell observasjon.
3. Et hetteglass med fluer anses som "sliten" når 5 eller færre fluer er i stand til å klatre høyere enn 2 inches i fire påfølgende dråper. Slitne hetteglass fjernes fra Power Tower mens den fortsatt er i drift, og tidspunktet for fjerning er registrert. Times of fjerning kan plottes som en nestet histogram, eller som en "time-to-failure" plot. Et eksempel på data plottet som en "time-to-failure" tomten er vist i Figur 3B.
4. Ampuller overvåkes ved 10 minutters intervaller for maksimalt 10 timer (figur 3B).

4. Trening, Alder, og locomotor Evne

1. Siden denne treninga protokollen er avhengig av indusert kjører atferd, er en primær analyse for quantitating effekten av trening for å lengderetningen måle endring i gjennomsnittlig turtall under trening. I løpet av treningen, er 120-fly årskull av utøvd og unexercised fluer testes daglig for deres reaksjon på en negativ geotaxis stimulans. Den RING teknikken described i Gargano et al. (2005) brukes for å måle fluene 'Choice klatring evne ^12. Kort, måler denne teknikken gjennomsnittlig høyde klatret med en ampulle med fluer i løpet av en definert tid etter induksjon av negative geotaxis. Høyden klatret i løpet av en definert tid tilsvarer klatring hastighet. Målinger utføres før du legger fluer på maskinen for daglig trening for å unngå komplikasjoner fra trøtthet etter dagens løp.
2. I vår standard protokoll, er fluer utøves i totalt tre uker og klatring evne er undersøkt for totalt fem uker: tre uker under trening-trening og to uker etter seponering av trening (figur 2). Dette gjør at eksperimentator å kartlegge hvorvidt effekten av trening på mobilitet vedvare etter avsluttet program.
3. Fire bilder av hver årsklasse daglige RING prestasjoner blir brukt for analyse av klatring evne. Seks ampuller er inkludert i hvert bilde. Negativ geotaxis er indusert, og ved hjelp av entidsbestemt kamera, et fotografi blir tatt etter et definert antall sekunder. Vi bruker vanligvis to sekunder, men dette kan varieres avhengig av eksperimentelle betingelser. For hvert bilde, er hvert hetteglass delt inn i fire kvadranter med lik høyde, og bildebehandling programvare brukes til å tildele hver flue en poengsum basert på kvadrant nådde innenfor den tildelte tid. Fluer som klatrer til det øverste kvadranten får en score på 4, flyr i den nest høyeste kvadranten motta en tre, flyr i den nest høyeste kvadranten motta en to, og fluer i laveste kvadrant får en. Fluer som ikke klatre ut av bunnen i det hele tatt er gitt en score fra 0.
4. For hvert hetteglass i en gitt fotografi, er en "klatring index" genereres ved gjennomsnitt resultatet av alle fluene i den hetteglass. Hver ampulle i indekser fra de fire bildene blir deretter gjennomsnitt for å gi en endelig klatring indeks for den dagen.
5. Alle negative geotaxis forsøk er utført lengderetningen. Resultatene er normaliserte to innledende «pre-øvelse" score for å redusere effekten av kohort variasjon i klatring evne og markere den relative langsgående endring i en kohort sin klatring kapasitet som følge av trening. Den første poengsum bestemmes av gjennomsnittet av de første tre dagers klatring indekser og tilordnes en verdi av 1. Påfølgende studier er da uttrykt som en prosentandel av den opprinnelige indeksen.

5. Representative Resultater

Wild-type fluer reagere på en utholdenhet protokoll med en redusert aldersrelatert nedgang i klatring evne som vedvarer etter avslutningen av opplæringen, noe som reflekteres i longitudinelle RING analyser på tvers av fem ukers alder (figur 3A). Dette forsinket nedgang i negative geotaxis er en standard fenotypisk respons som kan tjene som en positiv kontroll for å sikre at vill-type trening respons skjer normalt. Dette datasettet er presentert som et eksempel på hvordan induksjon av øvelsen ved Strøm TEffektforbruk Programmet kan brukes som et atferdsmessig inngang. Muligheten av ulike genetiske eller miljømessige faktorer å modulere denne effekten kan da bli vurdert.

Omvendt kan Power Tower også brukes som en effekt i ulike eksperimentelle design. For eksempel kan genotype, kosthold, eller andre forhold varieres. Deretter kan effekten av disse variasjonene på treningsfysiologi testes ved hjelp av Power Tower. Her viser vi et eksempel på denne tilnærmingen. Når flyr med en varierende andel av sukrose i sine dietter ble testet for tid til tretthet, økt sukrose innhold korrelert med økt utholdenhet kapasitet (Figur 3B).

Figur 1. Drift av Power Tower. (AC) Den motoriserte bøyd arm med påmontert hjul roterer med klokken til den kommer i kontakt med bøyd firkantrør. (D, E) Den armen presser ned på bøyd firkantrør , Forårsaker den plattform som er lastet med ampuller med fluer å løfte. (F) Som armen fjerner røret plattformen er lov til å falle ned igjen, tvinger fluene å gå tilbake til bunnen av flasken.

Figur 2. Foreslått Exercise Protocol. Flyr utsatt for opplæringen protokollen er laget for å trene fem dager hver uke under en tre ukers lang trappet regime som stadig øker varigheten av øvelsen fra de opprinnelige 2 timer med 30 minutter hver uke. Standard Analysene omfatter tretthet analyser før og etter treningsprogram og RING analysene fra uke 1 til uke 5. Alle analyser er utført i to eksemplarer på like mange unexercised fluer som en negativ kontroll. Andre ulike fysiologiske eller biokjemiske tester kan bli utført som bestemmes av forskeren.

3786fig3.jpg "/>
Figur 3. Utholdenhets trening endrer flere aspekter av mobilitet. (A) Ring analysene ble utført langsgående tvers aldre i en enkelt par mannlige Y ¹ W ^67C23 kohorter. Age-matchet, genetisk identisk utøvd og unexercised kontroll fluer ble målt daglig for gjennomsnittlig klatring hastighet. Resultatene er uttrykt i form av en klatring indeks som er normalisert til gjennomsnittlig klatring høyde over de tre første dagene av måling. Trening trente fluer vist en redusert aldersrelatert nedgang i negativ geotaxis evne i forhold til alder-matchede unexercised søsken tvers aldre (2-veis ANOVA, p <0,005). (B) Fatigue analyser utført i 8 timer på alders-matchet kvinnelig Canton S fluer viser en signifikant effekt av kosttilskudd sukrose innhold på tide å tretthet (Log-rank, p <0,0001). Før eksperimentet ble fluer matet en gjær / sukrose / agar kosthold, med 10% vekt / volum gjær konsentrasjon, og en varierende andelav kosttilskudd sukrose. Fem hetteglass med 20 fluer hver ble testet for hver diett. Grafen viser hvor mange ampuller fortsatt ha fem eller flere fluer kjører på et gitt tidspunkt. Disse resultatene kan behandles statistisk og grafisk som en overlevelse (eller tid til å mislykkes) kurve, med "feil" for et hetteglass som blir definert som et punkt i tid da mindre enn fem fluene fortsetter å reagere på negativ geotaxis stimulans. Vær oppmerksom på at mange andre mulige studiedesign og statistiske behandlinger er mulig, og data behandling og måling bør skreddersys for å passe individuelle formål.

Discussion

Den generelle protokollen presenteres her har vært vellykket i å dokumentere fysiologiske effekter etter trening. Men flere områder i denne protokollen er underlagt endringer for å passe spesielle eksperimentelle behov. For eksempel kan lengden på treningen og antall kamper potensielt varieres for å gjøre programmet mer eller mindre utfordrende, som ønsket. Høyden på beholderen som negativ geotaxis evne måles kunne endres for å øke tilgjengelig areal for forbedring skal dokumenteres. Ulike metoder for å automatisere kvantifisering av klatre fart kan også være aktuelt. I prinsippet kan hvilken som helst program som kan skille en flue fra bakgrunnen brukes til å øke hastigheten på datainnsamling prosessen.

Noen aspekter av protokollen bør endres bare med stor forsiktighet, imidlertid. For eksempel, gangsetting sterkt indikerer at minst én hviledag per uke tendens til rette for større Visnovement enn nådeløse daglig mosjon. I tillegg er døgnrytme og temperatur kjent for å påvirke bevegelsen av vekselvarme dyr. Tidspunktet for dagen at treningen foregår kan varieres, men bør alltid være konsekvent innenfor bestemte grupper under sammenligning, for å unngå muligheten for konfunderende effekter av døgnrytme. Temperaturkontroll er også viktig, og vi anbefaler en dedikert rom ved konstant temperatur til huset treningsutstyr. Endelig, må menn og kvinner bli oppdratt og måles separat, for å unngå potensielle av konfunderende effekter av fruktbarhet og sex forskjeller i arbeidskapasiteten.

Potensielle anvendelser av denne metodikken er begrenset bare av fantasien av forskeren. I forarbeidet har vi benyttet denne metodikken i tre brede programmer:

1. For å måle effekten av utholdenhetstrening på ulike aspekter av villtype biologi tvers aldre.
2. To måle effekten av utholdenhetstrening på bestemte mutante fenotyper.
3. Å screene for genetiske faktorer som er nødvendige for å utføre fordelene ved trening

Hver av disse programmene omfatter et bredt spekter av spesifikke muligheter. Basert på vår foreløpige erfaring, mutante fenotyper en tendens til å variere med trening nivå så mye som de varierer med diett. Bruken av virvelløse modeller for bedre å forstå forholdet mellom kosthold, mosjon og aldring fysiologi er kanskje den viktigste allmenngjøring av denne protokollen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dayton Gearmotor	Grainger	1LRA6A
Raco Electrical Box	Grainger	5A052
Raco Cover	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fuse	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder	Grainger	1DD33
Carling Technologies Switch	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC Speed	Grainger	4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102