Выносливость протокол Обучение и продольные анализы производительности для дрозофилы MELANOGASTER

Summary

Мы описываем первые выносливость протокол подготовку важного генетического вида модели,

Abstract

Одной из наиболее острых проблем, стоящих перед современной медицинской исследователей растущие уровни ожирения, с последующим увеличением в ассоциированные заболевания, такие как диабет и сердечно-сосудистые заболевания ^1-3. Важной темой исследований в этих связанных с ними проблем здоровья включает в себя роль упражнения на выносливость, как благотворное вмешательство.

Учения является недорогим, неинвазивным вмешательство с несколькими положительные результаты, в том числе сокращение избыточного жира ^4, увеличилась чувствительность к инсулину в скелетных мышцах ^5, увеличилось противовоспалительными и антиоксидантными ответов ^6, и улучшение сократительной способности кардиомиоцитов ^7. Низкая интенсивность упражнения как известно, повышает активность митохондриальных и биогенеза у человека ⁸ и мышей, с транскрипционной коактиватора PGC1-α как важный промежуточный ^9,10.

ДеспиТе важность осуществления в качестве инструмента для борьбы с нескольких важных возрастных заболеваний, обширная продольная генетические исследования было затруднено из-за отсутствия выносливости протокол подготовки недолго генетический вид модели. Разнообразие генетических инструментов, доступных для использования с дрозофилы, вместе с коротким сроком службы и техническое обслуживание недорогое, сделать ее привлекательной моделью для дальнейшего изучения этих генетических механизмов. С этой целью мы разработали новое устройство, известное как Power Tower, для крупных упражнения обучения у дрозофилы MELANOGASTER ^11. Power Tower использует мух инстинктивное негативное поведение geotaxis к повторно вызвать быстрое восхождение. Каждый раз, когда машина лифтов, затем падает, платформа мух, мухи вынуждены подниматься. Мухи продолжать реагировать, пока машина находится в эксплуатации или пока они не станут слишком усталым, чтобы ответить. Таким образом, исследователь может использовать эту машину, чтобы обеспечить сimultaneous обучение большого числа соответствующего возраста и генетически идентичных мух. Кроме того, мы расскажем связанные тесты полезны для отслеживания продольного хода лету когорты во время тренировки.

Protocol

1. Мощность установки башни и эксплуатации

1. Power Tower расположен на прямоугольный кусок фанеры, который крепится к столу. 4,5 оборотов в минуту мотор-редуктора с Грейнджер покоится на вершине четыре 2 "x6" плат и один ¾ дюйма фанеры. Двигатель, AC / DC скорости, предохранитель, и включения / выключения соединены вместе в момент окно.
2. Для охлаждения двигателя, отверстие 3 дюйма в диаметре, разрезают на вертикальной ½ дюйма кусок фанеры. С одной стороны, 3-дюймовый вентилятор крепится к фанере, а с другой стороны, 3-дюймовый металлический цилиндр диаметром прилагается.
3. Заказные вращающиеся руки с роликом установлен на конец соединен с двигателем. Двигатель и навесное руки вращать по часовой стрелке, снижая одной стороны изогнутым ¾ дюйма квадратных акции труба, которая крепится к фанере с дверных петель. Колесо крепится к верхней части трубы запас под платформу, чтобы позволить ему катиться по отношению к платформе, directlу него выше.
4. Рука нажимает на одном конце трубы акций и поднимает на противоположном конце, повышение двухуровневой платформой (рис. 1D). Когда ролик на руку сбрасывает трубку, она позволяет рукой, чтобы вернуться в исходное положение, опустив платформу вниз (рис. 1F).
5. Платформы состоят из стоек, которые размещаются на верхней части фанеры и обеспеченные банджи шнуры, которые подключены на винт глаза. Платформы скользить вверх и вниз вдоль ящика ползунки, которые крепятся к фанере при помощи планок.
6. Флаконы помещают в стойках и закрепляется на квадратный экран сетка, которая удерживается на месте с банджи шнуры.
7. Подушка из пенопласта расположен ниже платформы, чтобы ослабить шок от падения.
8. Мощность двигателя регулируется таким образом, что полный период вращения составляет 15 секунд.

2. Упражнение протокол

1. Мухи расположены в 25 ° C инкубаторе с 50% влажности и 12-часовой светлый / темный цикл. Ботч учений и оценки физической работоспособности проводится в 25 ° C температура контролируемого помещения.
2. Мухи собираются и соответствующего возраста в течение 1-2 дней друг от друга. Минимум 240 мух, необходимых для продольного мониторинга выносливость и отрицательные geotaxis (восхождение) способность, два физиологических показателей, отражающих последствия учений. Продольные мониторинга позволяет изоляции индуцированных изменений по сравнению с начальными значениями для каждой когорты, не смешивая эффекты от различия между когортами. Мухи дополнительные эксперименты должны быть собраны при необходимости.
3. После сбора мух делятся на 120 экспериментальных мух, которые будут подвергаться режим осуществления и 120 мух управления, которые не будут осуществляться. Мух хранятся во флаконах по 20 летает каждый. Флаконы экспериментальных мух подключены с фирмой ацетата целлюлозы Flugs и флаконов управления (нетренированного) мух подключены с мягкой губкой, пробки, соакие можно сдвинуть вниз, чтобы обездвижить мух, а на Power Tower. Губка используется для иммобилизации, потому что его адаптивные размер позволяет легко разместить в нижней части флакона. Мягкие губки материала и уменьшает повреждения, вызванные более прочной Flugs.
4. Мухи на Power Tower хранятся и осуществляется во флаконах, содержащих 5 мл пищи, которая предоставляет им более мягкие посадки, чем мух, которые осуществляются в пустых ампул. Пища, как правило, состоит из 10% сахарозы, 10% дрожжей и 2% агара в воде, хотя мы не наблюдаем мух есть часто в ходе тренировки. Если пустые флаконы используются в процессе обучения, процент мух, которые страдают от травм резко возрастает.
5. Power Tower работает в контролируемой температурой комнаты, которая поддерживается при 25 ° C. Экспериментальные мух расположены на Power Tower и заставили подняться. Управление мухи также размещена на Power Tower, но губка пробка выталкивается вниз, в VIAL около 3 мм над мухами, чтобы ограничить движение. Эта группа выступает в качестве контроля для любых последствий Power Tower которые не связаны с физическими упражнениями. Хотя некоторые комнаты по-прежнему существует для этих мух для маневра, мы неоднократно наблюдали, что мух в этих условиях работать очень мало и не проявляют физиологическую реакцию на прогулку. Он также может быть целесообразным включить дополнительные контрольной группы, которые не размещены на Power Tower вообще.
6. Мухи осуществляют пять дней подряд каждую неделю, используя увеличили графика (рис. 2). В течение недели один из мухи осуществляется в течение 2 часов на сессии, недели две в течение 2,5 часов за сессию, а недели три в течение 3 часов за одну сессию. Хотя другие схемы были опробованы, этот протокол дает стабильные результаты по генотипов и под различные условия. Этот протокол, однако, с учетом широкого спектра возможных вариантов, которые могли бы удовлетворить конкретного эксперимента.

3. Физические упражнения и опорно-двигательного усталости

1. Время усталости во время упражнений на выносливость является полезным индикатором физиологического для подтверждения и / или количественного дееспособность данной когорты. Усталость тесты могут быть выполнены по продольной когорты, которая будет использоваться в подготовке эксперимента. Тесты могут проводиться как до тренировки, после завершения подготовки протокола, или обоих. Другие промежуточные моменты времени могут быть добавлены, если графиков постепенный прогресс в процессе обучения желательно. Усталость анализ также может быть использован для измерения физической нагрузки в качестве ответа на лечение, кроме подготовки протоколов, таких как изменение диеты (рис. 3В).
2. Усталость анализы должны проводиться в день, когда обучение не происходит. Оба экспериментальных и контрольных мух расположены на Power Tower во флаконах по 20 штук и сделал, чтобы подняться до усталости. Усталость признана неспособность реагировать на отрицательные стимулы geotaxis с восхождением поведения. Усталость behavioг забил путем визуального наблюдения.
3. Флакон мух считается "усталости", когда 5 или меньше мухи в состоянии подняться выше, чем 2 дюйма в течение четырех капель. Усталость флаконах удаляются из Power Tower, пока он все еще работает, и время удаления записи. Время удаления могут быть построены в виде вложенного гистограммы, или, как «время до отказа" сюжет. В качестве примера данные отображаются в виде "время до отказа" сюжет показанный на рисунке 3b.
4. Флаконы контролируется с 10-минутными интервалами в течение максимум 10 часов (рис. 3В).

4. Упражнения, возраст, и опорно-двигательного Возможность

1. Так как эта подготовка протоколов зависит от индуцированной работает поведения, первичный анализ для количественного эффекта обучения заключается в продольном измерять изменение средней скорости движения во время тренировки. В ходе обучения, 120 лету когорты осуществляется и неосуществленный мух проверяется ежедневно в течение их реакции на отрицательные стимулы geotaxis. КОЛЬЦО техника гвневписанной в Гаргано и соавт. (2005) используется для измерения мух подъем, преодолеваемый ^12. Короче говоря, этот метод измеряет среднюю высоту поднялись на флакон мух в течение определенного времени после индукции отрицательных geotaxis. Высота поднялся в течение определенного времени эквивалентно скорость при наборе высоты. Измерения проводятся прежде, чем поместить мух на машину для ежедневных тренировок, чтобы избежать осложнений от усталости после пробега дня.
2. В нашем стандартном протоколе, мух осуществляются в общей сложности три недели, и подъем, преодолеваемый рассматривается в общей сложности пять недель: три недели во время тренировок, обучения и через две недели после прекращения физической нагрузки (рис. 2). Это позволяет экспериментатору наметить ли эффекты физических упражнений на подвижность сохраняется после прекращения программы.
3. Четыре фотографии ежедневно производительности RING каждой группе, используются для анализа скороподъемность. Шесть флаконов, включенных в каждую фотографию. Отрицательные geotaxis индуцируется, и с помощьюсвоевременное камеры, фотографирования, после определенного количества секунд. Обычно мы используем две секунды, хотя это может варьироваться в зависимости от условий эксперимента. Для каждой фотографии, каждый флакон делится на четыре квадранта одинаковой высоты, а также программное обеспечение для обработки изображений используется для присвоения каждой лету оценка на основе квадранта он достиг в течение отведенного периода времени. Мухи, что подняться на верхний квадрант получить 4 балла, летит в следующем высокий квадранта получают 3, летит второй по величине сектор получит 2, и мухи в нижнем квадранте получить 1. Мухи, которые не подниматься с нижнего на все даны 0 баллов.
4. Для каждого флакона в той или иной фотографии, "восхождение индекс" создается путем усреднения баллов всех мух в этом флаконе. Индексы Каждый флакон из четырех снимков, то средняя дать окончательный индекс восхождение на этот день.
5. Все негативные опыты geotaxis проводится в продольном направлении. Результаты нормализуются тО начальной "перед тренировкой" очков для того, чтобы уменьшить эффект когорты изменения скороподъемность и выделить относительно продольной изменения в восхождении мощности когорты, как результат учения. Первоначальная оценка определяется по среднему восхождения показатели первых трех дней и присваивается значение 1. Последующие испытания, то выражается в процентах от начального индекса.

5. Представитель Результаты

Дикого типа мухи реагируют на выносливость протокол со снижением возрастного снижения восхождение способность, которая сохраняется после окончания обучения, как это отражено в продольном анализов RING через пять недель (рис. 3А). Эта задержка снижения отрицательного geotaxis это стандартная фенотипическая реакция, которая может служить в качестве положительного контроля, чтобы дикого типа учения по реагированию происходит нормально. Этот набор данных представлен как пример того, как индукция осуществление питания TАуэр программа может быть использована в качестве поведенческой вход. Способность различных генетических и экологических факторов модулировать этот эффект может быть оценена.

С другой стороны, Power Tower также может быть использован как выход в различные экспериментальные проекты. Например, генотип, диета, или другие условия могут быть изменены. Затем, влияние этих изменений на осуществление физиология может быть проверена с помощью Power Tower. Здесь мы показываем пример такого подхода. Когда летит с разной процент сахарозы в их рационе были протестированы на время усталость, повышенное содержание сахарозы коррелирует с повышенной выносливости (рис. 3В).

Рисунок 1. Работа Power Tower. (AC) моторизованный согнутую руку с прикрепленным ролик вращается по часовой стрелке, пока не вступает в контакт с изогнутой трубы квадратного сечения. (D, E) рука нажимает на изогнутой трубы квадратного сечения , В результате чего платформа, которая загружена с пузырьками мух снять. (F) как рукой снимает трубку платформы падать вниз, заставляя мух, чтобы вернуться на дно флакона.

Рисунок 2. Предлагаемые упражнения протокола. Мухи подвергаются подготовке протокола производится осуществлять в течение пяти дней в неделю по три-недельный увеличили режим, который постепенно увеличивает продолжительность упражнения от первых 2 часов 30 минут в неделю. Стандартные анализы включают усталость анализы до и после упражнений и тестов RING от 1 недели через неделю 5. Все анализы выполняются в двух экземплярах на равное количество нетренированного мух в качестве отрицательного контроля. Другие различные физиологические и биохимические тесты могут быть проведены как определяется исследователем.

3786fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Упражнения на выносливость изменяет многие аспекты мобильности. (A) кольца анализов выполняется продольно по всей возрастов в одну пару мужской Y ¹ Вт ^67C23 когорт. Подобранных по возрасту, генетически идентичны и осуществляет контроль неиспользованный мухи были измерены в день в течение среднего лазании на скорость. Результаты выражаются через восхождение индекса, нормированная на среднюю высоту восхождение через первые три дня измерений. Упражнение подготовленных мух отображается уменьшение возрастного снижения отрицательного способность geotaxis по сравнению с соответствующего возраста нетренированного братьев и сестер по всей возраста (2-полосная ANOVA, р <0,005). (B) Усталость анализы проводились в течение 8 часов на соответствующего возраста мух женщина Canton S показывают значительное влияние диетических содержание сахарозы в срок до усталости (Вход ранга, р <0,0001). До эксперимента, мухи питались дрожжей / сахара / агар диету, 10% вес / объем концентрации дрожжей, а также различные процентпищевого сахара. Пять флаконов по 20 мух каждого были протестированы на каждой диете. График показывает, сколько флаконов еще пять или более мух работает в данный момент времени. Эти результаты можно рассматривать статистически и графически в виде выживания (или наработка на отказ) кривая, "провал" на флаконе определяется как момент, когда менее чем за пять мух и впредь реагировать на отрицательные стимулы geotaxis. Обратите внимание, что многие другие возможные проекты исследования и статистические методы лечения возможно, и обработка данных и измерений должны быть адаптированы с учетом индивидуальных целей.

Discussion

Общий протокол, представленные здесь успешно документирования физиологические эффекты после обучения. Тем не менее, ряд областей, в этом протоколе могут быть изменены, чтобы соответствовать частности экспериментальных потребностей. Например, продолжительность обучения и количество приступов потенциально могут быть изменены, чтобы сделать программу более или менее сложной задачей, как хотелось бы. Высота контейнера, в котором отрицательные способность geotaxis измеряется могут быть изменены, чтобы увеличить доступное место для улучшения должны быть документированы. Различные методы автоматизации количественного скорость при наборе высоты может быть платной. В принципе, любое программное обеспечение способно отличить мух от фона может быть использована для ускорения процесса сбора данных.

Некоторые аспекты протокол должен быть изменен только с большой осторожностью, тем не менее. Например, предварительные эксперименты убедительно свидетельствуют о том, что по крайней мере один день отдыха в неделю стремится содействовать расширению показыovement чем неустанной ежедневной тренировки. Кроме того, циркадные ритмы и температуры, как известно, влияет на движение холоднокровных животных. Время суток, что обучение проходит может меняться, но всегда должна быть последовательной в отдельные группы по сравнению с тем, чтобы избежать возможности смешанных эффектов циркадные ритмы. Контроль температуры также имеет важное значение, и мы рекомендуем выделенной комнате при постоянной температуре на тренажерах дома. Наконец, мужчины и женщины должны быть выращены и измеряются отдельно, чтобы избежать потенциальных смешанных эффектов плодородия и половые различия в физической нагрузке.

Потенциальные применения этой методики ограничивается только фантазией исследователя. В предварительную работу, мы использовали эту методику в трех основных приложений:

1. Для оценки влияния на выносливость по различным аспектам биологии диких типа через века.
2. ТО измерить эффект упражнения на выносливость по конкретным мутантным фенотипом.
3. Для выявления генетических факторов, которые необходимо выполнить Польза от упражнений

Каждое из этих приложений включает в себя широкий спектр конкретных возможностей. Основываясь на предварительном опыте, мутантный фенотип, как правило, меняются в зависимости от упражнения уровне столько, сколько они меняются в зависимости от диеты. Использование беспозвоночных модели, чтобы лучше понять отношения между диеты, физических упражнений, а также старение физиологии, пожалуй, самый важный общего применения этого протокола.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dayton Gearmotor	Grainger	1LRA6A
Raco Electrical Box	Grainger	5A052
Raco Cover	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fuse	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder	Grainger	1DD33
Carling Technologies Switch	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC Speed	Grainger	4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102