Konditionsträning protokoll och Longitudinella analyser Performance för Drosophila melanogaster

Summary

Vi beskriver den första uthållighetsträning protokollet för en viktig genetisk modell arter,

Abstract

En av de mest angelägna problemen moderna medicinska forskare är böljande nivåerna av fetma, med åtföljande ökningen i intresseföretag sjukdomar såsom diabetes och hjärt-kärlsjukdomar ^1-3. Ett viktigt ämne för forskning om dessa hälsorelaterade problem innebär rollen av uthållighet motion som en positiv insats.

Träning är ett billigt, icke-invasiva ingrepp med flera positiva resultat, bland annat minskad överviktig ^4, ökad insulinkänslighet i skelettmuskel ^5, ökad anti-inflammatoriska och antioxidativa svar ^6, och förbättrad kontraktila kapacitet i kardiomyocyter ^7. Låg intensitet är kända för att öka mitokondriell aktivitet och biogenes hos människor ⁸ och möss, med transkriptionell samaktivator PGC1-α som en viktig mellanprodukt ^9,10.

Despite vikten av motion som ett verktyg för att bekämpa flera viktiga åldersrelaterade sjukdomar, har omfattande longitudinella genetiska studier försvåras av bristen på en uthållighetsträning protokoll för en kortlivad genetisk modell arter. Mångfalden av genetiska verktyg för användning med Drosophila, tillsammans med sin korta livslängd och billigt underhåll, gör det en tilltalande modell för ytterligare studier av dessa genetiska mekanismer. Med detta i åtanke har vi utvecklat en ny apparat, som kallas Power Tower, för storskalig övning-utbildning i Drosophila melanogaster ^11. Power Tower utnyttjar flugorna kallad konventionen instinktivt negativt geotaxis beteende upprepade framkalla en snabb klättring. Varje gång maskinen hissar, så sjunker, den plattform för flugor flugorna förmås att klättra. Flugor fortsätter att svara så länge maskinen är i drift eller tills de blir för trötta för att svara. Således kan forskaren använda maskinen för att ge vetenskapligtimultaneous träning för ett stort antal åldersmatchade och genetiskt identiska flugor. Dessutom beskriver vi tillhörande analyser användbara för att spåra longitudinella utvecklingen av fly kohorter under träning.

Protocol

1. Power Tower installation och drift

1. The Power Tower placeras på en rektangulär bit plywood som är fastspänd i en tabell. En 4,5 rpm växel motorn från Grainger vilar på toppen av fyra 2 "x6" brädor och en ¾ tums plywoodskivan. Motorn, en AC / DC varvtalsreglering, en säkring och en on / off knappen är kopplade samman till ett skede låda.
2. För att kyla motorn, är ett hål 3 inches i diameter skars i en vertikal ^ tum stycke plywood. Å ena sidan är en 3-tums fläkten ansluten till plywood, och å andra sidan, är en 3-tums diameter metallcylinder bifogas.
3. En skräddarsydd roterande arm med en rulle monterad på änden är ansluten till motorn. Motorn och bifogade armen roterar i en medurs riktning, att trycka ned den ena sidan av en böjd ¾ tum fyrkantröret lager som är fäst vid plywood med en gångjärnet. Ett hjul är fäst vid den övre sidan av röret lager nedanför plattformen för att medge den att rulla mot den plattform som är directly ovanför den.
4. Armen trycker ned en ände av röret lager och lyfter den motsatta änden, höjer en två-nivå plattformen (figur 1D). När rullen på armen rensar rörämnet den tillåter armen att återgå till startläget, släppa plattformen tillbaka ned (fig 1 F).
5. Plattformarna består av rack som är placerade på toppen av plywood och fast med bungee stubin som är anslutna till skruv ögon. Plattformarna glida upp och ner längs låda reglage som är knutna till plywood med konsoler.
6. Flaskorna placeras i ställningar och säkras med ett kvadratiskt rutnät skärm som hålls på plats med bungee rep.
7. En Styrofoam kudde placeras nedanför plattformen för att dämpa chocken av nedgången.
8. Kraften hos motorn justeras så att en fullständig rotationsperioden är 15 sekunder lång.

2. Övning protokollet

1. Flugor är inrymda i en 25 ° C inkubator med 50% fuktighet och en 12-timmars ljus / mörkercykel. Both träning och bedömning av arbetsförmåga genomförs i ett 25 ° C temperatur-kontrollerad rum.
2. Flugor uppsamlas och åldersmatchade inom 1-2 dagar efter varandra. Ett minimum av 240 flugor krävs för longitudinell övervakning av uthållighet och negativa geotaxis (klättring) förmåga, två fysiologiska indikatorer som speglar effekterna av träning. Längsgående övervakningen kan isolering av inducerad förändring i förhållande till startvärden för varje årskull, utan störande effekter från variation mellan kohorter. Flugor för ytterligare försök bör samlas in vid behov.
3. Efter uppsamling, är flugor delas in i 120 experimentella flugor, som kommer att utsättas för övningen regimen, och 120 flugor kontroll, som inte kommer att utnyttjas. Flugorna lagras i flaskor om 20 flyger vardera. Flaskorna av experimentella flugor är anslutna med acetat fasta cellulosa Flugs och flaskor för kontroll (ej utnyttjats) flugor är anslutna med mjuk svamp proppar, which kan tryckas ned för att immobilisera flugorna samtidigt på Power Tower. Svamp används för immobilisering, eftersom dess adaptiv storlek tillåter enkel placering nära botten av flaskan. Det mjukare svamp materialet minskar också skador som orsakas av de mer solida Flugs.
4. Flugor på Power Tower lagras och utnyttjas i flaskor som innehåller 5 ml av livsmedel, vilket ger dem en mjukare landning än flugor som utövas på tomma flaskor. Maten består vanligtvis av 10% sackaros, 10% jäst, och 2% agar i vatten, även om vi inte följer flugor att äta ofta under loppet av ett träningspass. Om tomma flaskor används under träning, är andelen flugor som lider skador ökat dramatiskt.
5. The Power Tower drivs i en temperatur-kontrollerad rum som hålls vid 25 ° C. Experimentella flugor placeras på Power Tower och gjorde att klättra. Kontroll flugor också placeras på Power Tower, men svampen proppen trycks ner i vaktuariella ca 3 mm ovanför flugor i syfte att begränsa rörelse. Denna grupp fungerar som en kontroll för eventuella effekter av Power Tower som inte har något att träna. Även om visst utrymme finns fortfarande för dessa flugor att manövrera, har vi observerat vid upprepade tillfällen att flugor under dessa förhållanden löper mycket liten och inte visar en fysiologisk reaktion att utöva. Det kan också vara önskvärt att inkludera ytterligare kontrollgrupp som inte är placerad på Power Tower alls.
6. Flugor utnyttjas fem på varandra följande dagar varje vecka, använder ett sluttande plan (Figur 2). Under vecka ett flugorna utnyttjas för 2 timmar per session, vecka två för 2,5 timmar per session, och vecka tre för 3 timmar per session. Även om andra regimer har testats, producerar detta protokoll enhetliga resultat i hela genotyper och under olika förhållanden. Detta protokoll är dock, med förbehåll för ett brett spektrum av möjliga variationer som kan passa en viss experiment.

3. Motion och motorisk Trötthet

1. Dags att trötthet under uthållighetsträning är en användbar fysiologisk indikator för att bekräfta och / eller kvantifiera fysisk kapacitet för en given kohort. Trötthet analyser kan utföras i längdriktningen på kohorter som kommer att användas i utbildning experiment. Analyser kan utföras antingen före träning, efter avslutad utbildning protokoll eller båda. Andra mellanliggande tidpunkter kan läggas till om att kartlägga små förbättringar under träning önskas. Tröttheten Analysen kan också användas för att mäta träningsuthålligheten som ett svar på behandlingar med undantag för träning protokoll, såsom diet ändring (figur 3B).
2. Trötthet analyser bör genomföras på en dag då utbildningen inte sker. Både experimentella och kontroll flugor placeras på Power Tower i flaskor om 20 vardera och gjorde att klättra fram trött. Trötthet är erkänt som den inte svarar på en negativ geotaxis stimulans med klättring beteende. Trötthet behavior poängsätts genom visuell observation.
3. En flaska med flugor anses "trött" när 5 eller färre flugor kan klättra högre än 2 inches under fyra droppar. Trötta flaskor tas bort från Power Tower medan den fortfarande är i drift, och tiden för avlägsnande registreras. Gånger för avlägsnande kan ritas som en kapslad histogram, eller som en "tid-till-misslyckande" tomt. Ett exempel på data avsatta som en "tid-till-misslyckande" diagram visas i figur 3B.
4. Flaskorna övervakas vid 10 minuters intervaller under maximalt 10 h (fig 3B).

4. Motion, Ålder, och rörelseaktivitet förmåga

1. Eftersom denna utbildning protokoll bygger på inducerad kör beteende, är en primär analys för kvantifiering effekterna av träning för att longitudinellt mäta förändringen i genomsnittlig hastighet under träning. Under utbildningen är 120-fly kohorter utnyttjade och outnyttjade flugor testas dagligen i deras svar på en negativ geotaxis stimulans. Den RING tekniken described i Gargano et al. (2005) används för att mäta flugorna klättring förmåga ^12. I korthet mäter denna teknik medellängd ökade med en flaska flugor under en definierad tid efter induktion av negativa geotaxis. Höjden steg under en definierad tid motsvarar klättring hastighet. Mätningar utförs innan du placerar flugor på maskinen för daglig träning för att undvika komplikationer av trötthet efter dagens körning.
2. I vår standardprotokoll, är flugor utövas i totalt tre veckor och klättringsförmåga undersöks under totalt fem veckor: tre veckor under träning-utbildning och två veckor efter avslutad träning (Figur 2). Detta gör försöksledaren att kartlägga om effekter av motion om rörlighet kvarstår efter avslutad av programmet.
3. Fyra bilder av varje årskull dagliga RING prestanda används för analys av klättring förmåga. Sex flaskor i varje bild. Negativ geotaxis induceras, och med användning av entidsinställd kamera, en bild tas efter ett visst antal sekunder. Vi använder typiskt två sekunder, även om detta kan varieras beroende på försöksbetingelserna. För varje bild, varje flaska uppdelad i fyra kvadranter med samma höjd, och bildbehandling programvara används för att tilldela varje flugan en summa baserad på det kvadranten den nådde inom den tilldelade tidsperioden. Flugor som klättrar på översta kvadranten får en poäng av 4, flyger i det näst högsta kvadranten får en 3, flyger i den näst högsta kvadranten får en 2 och flugor i den lägsta kvadranten få 1. Flugor som inte klättrar bort från botten på alla ges poängen 0.
4. För varje ampull i en given bild, är ett "klättra index" som genereras genom att ta medelvärdet poängen för alla flugor i att ampullen. Varje injektionsflaska: s index från de fyra fotografierna sedan medelvärde för att ge en slutlig klättring index för den dagen.
5. Alla negativa geotaxis experiment genomförs i längdled. Resultaten är normaliserade to första "pre-övning" poäng för att minska effekten av kohorten variation i klättringsförmåga och belysa den relativa längsgående förändring i en kohort s klättring kapacitet som ett resultat av träning. Den initiala poäng bestäms av genomsnittet av de tre första dagarnas klättring index och tilldelas ett värde av 1. Efterföljande försök uttrycks sedan som procent av den initiala indexet.

5. Representativa resultat

Vildtyp flugor svara på en uthållighet protokoll med en minskad åldersrelaterad minskning i klättringsförmåga som kvarstår efter avslutad utbildning, vilket avspeglas i längsgående RING analyser i fem veckors ålder (Figur 3A). Denna fördröjda minskning negativa geotaxis är en standard fenotypiska svaret som kan tjäna som en positiv kontroll för att säkerställa att vildtyp utövandet svar sker på normalt sätt. Denna uppsättning data presenteras som ett exempel på hur induktion av utövande av Power TOwer programmet kan användas som en beteendemässig ingång. Förmågan hos olika genetiska och miljömässiga faktorer som modulerar denna effekt kan sedan bestämmas.

Omvänt kan Power Tower även användas som en utgång i olika experimentella utföranden. Till exempel kan genotyp, diet eller andra betingelser varieras. Sedan kan effekten av dessa variationer på träningsfysiologi testas med hjälp av Power Tower. Här visar vi ett exempel på detta tillvägagångssätt. När flyger med en varierande andel av sackaros i sin kost testades för tid till trötthet, ökad sackaroshalten korrelerad med ökad uthållighet kapacitet (Figur 3B).

Figur 1. Drift av Power Tower. (AC) Den motoriserade böjda armen med bifogade rullen roterar medurs tills den kommer i kontakt med den böjda fyrkantsrör. (D, E) Armen pressar ner på den böjda fyrkantröret , Vilket orsakar att plattformen som är lastad med flaskor av flugor för att lyfta. (F) Då armen rensar röret plattformen tillåts falla tillbaka ned, tvingar flugorna att återgå till botten av flaskan.

Figur 2. Föreslagna Motion protokollet. Flyger utsätts för utbildningen protokollet görs för att träna fem dagar varje vecka under en tre veckor lång lutande regim som successivt ökar varaktigheten av motion från de första 2 timmarna med 30 minuter varje vecka. Standard analyser inkluderar trötthet analyser före och efter träningsprogram och tester RING från vecka 1 till vecka 5. Alla analyser utförs i duplikat på ett lika stort antal outnyttjade flugor som en negativ kontroll. Andra fysiologiska eller biokemiska tester kan utföras som bestäms av forskaren.

3786fig3.jpg "/>
Figur 3. Uthållighetsträning förändrar flera aspekter av rörlighet. (A) Ring analyser utförs i längdriktningen över åldrar ett enda par av manliga Y ¹ W ^67C23 årskullar. Åldersmatchade, genetiskt identiska utövas och hade utnyttjats kontroll flugor mättes dagligen för genomsnittet klättring hastighet. Resultaten är uttryckta i termer av en klättrande index som är normaliserad till den genomsnittliga klättring höjd tvärs över de första tre dagarna av mätningen. Motion-utbildade flugor uppvisade en minskad åldersrelaterade nedgången i negativ geotaxis förmåga jämfört med åldersmatchade outnyttjade syskon över åldrar (2-vägs ANOVA, p <0,005). (B) Trötthet analyser genomfördes under 8 timmar på åldersmatchade kvinnor Canton S flugor visar en signifikant effekt av kosten sackaroshalt i tid till utmattning (Log-rank, p <0,0001). Före experimentet flugor matas en jäst / sackaros / agar diet med 10% vikt / volym jäst koncentration, och en varierande procentuelli kosten sackaros. Fem flaskor med 20 flugor vardera testades för varje diet. Diagrammet visar hur många flaskor fortfarande har fem eller fler flugor kör vid en given tidpunkt. Dessa resultat kan behandlas statistiskt och grafiskt som en överlevnad (eller tid till brott) kurva, med "misslyckande" för en flaska definieras som en punkt i tiden när mindre än fem flugor fortsätta att svara på negativ geotaxis stimulans. Observera att många andra möjliga studiedesign och statistiska bearbetningar är möjliga, och data behandling och mätning bör anpassas för att passa enskilda syften.

Discussion

Den allmänna protokollet presenteras här har varit framgångsrik i att dokumentera fysiologiska effekter efter träning. Men flera områden i detta protokoll är föremål för ändringar för att passa särskilda experimentella behov. Till exempel kan längden på utbildning och antal matcher potentiellt varieras för att göra programmet mer eller mindre utmanande, om så önskas. Höjden av behållaren, i vilken negativt geotaxis förmåga mäts skulle kunna ändras för att öka den tillgängliga ytan för förbättring dokumenteras. Olika metoder för att automatisera kvantifiering av klättring hastighet kan också vara tillämpliga. I princip kan alla program som kan skilja en fluga från bakgrunden kan användas för att skynda på datainsamling processen.

Vissa aspekter av protokollet bör ändras endast med stor försiktighet, dock. Till exempel preliminära experiment visar tydligt att minst en vilodag per vecka tenderar att underlätta större Visnovement än obeveklig daglig motion. Dessutom är dygnsrytmer och temperatur kända för att påverka rörelsen av kallblodiga djur. Tiden på dagen att utbildning sker kan varieras, men bör alltid vara konsekvent inom vissa grupper som jämförs, för att undvika risken för störande effekter av dygnsrytmen. Temperaturreglering är också viktigt, och vi rekommenderar ett särskilt rum vid konstant temperatur till hus träningsutrustning. Slutligen måste män och kvinnor födas upp och mätas separat, för att undvika den potential som störande effekter av fertilitet och kön skillnader i fysisk kapacitet.

Potentiella tillämpningar av denna metod begränsas endast av fantasin hos forskaren. I förarbetet har vi utnyttjat denna metod i tre breda program:

1. För att mäta effekten av uthållighetsträning om olika aspekter av vildtyp biologin över åldrar.
2. To mäta effekten av uthållighetsträning på specifika mutant fenotyper.
3. För att undersöka genetiska faktorer som är nödvändiga för att utföra fördelarna med motion

Var och en av dessa tillämpningar omfattar en stor variation av specifika möjligheter. Baserat på vår preliminära erfarenhet muterade fenotyper tenderar att variera med motion nivå så mycket som de varierar med diet. Användningen av ryggradslösa modeller för att bättre förstå sambandet mellan kost, motion och åldrande fysiologi är kanske den viktigaste allmänna tillämpningen av detta protokoll.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dayton Gearmotor	Grainger	1LRA6A
Raco Electrical Box	Grainger	5A052
Raco Cover	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fuse	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder	Grainger	1DD33
Carling Technologies Switch	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC Speed	Grainger	4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102