Summary
이 연구, 화학 물질, 산업 폐수 또는 하수 및 해수 갑각류에 액상 환경 시료에 의해 진력 장기 (14 일) 치명적인 독성을 결정하는 중요한 방법론 프로토콜의 개발 및 표준화에 관한
Abstract
우리의 연구 활동은 바닷물 / 소금기있는 물 및 침전물에 대한 특정 참조와 함께, 환경 품질 평가를위한 생물 학적 방법의 사용을 타겟팅합니다. 생물 학적 지표의 선택은 표준화된 절차의 예약 상황에, 가능성, 신뢰성있는 과학적 지식을 기반으로해야합니다. 이 문서에서 우리는 화학 물질 및 / 또는 해양 환경 매트릭스의 독성을 평가하기 위해 해양 갑각류 Artemia를 사용한 표준화된 프로토콜을 소개합니다. 과학자들은 소금물 새우 (Artemia)는 전 세계적 활용에 대한 표준 bioassay의 발달에 적합한 후보는 것을 제안합니다. 논문의 숫자는 소금물 새우 (Artemia)에서 다양한 화학 물질과 toxicants의 독성 효과에 공개되었습니다. 독성 연구를 위해이 갑각류의 주요한 이점은 건조 cysts의 전반적인 가용성이며 이들은 즉시 테스트에 사용될 수 있으며, 어려운 재배는 요구하지 않습니다
Protocol
1. 방법 표준
우리의 테스트는 생물의 50 %의 사망 (LC 50) 14 일 동안 노출이 발생할 것입 농도 또는 희석 수준을 결정하는 목적으로 약물 농도의 간격이나 테스트 샘플에 Artemia의 애벌레를 노출하고 정의된 조건을 충족 포함 이 방법에 의해. 필요하고 가능하다면, 다음도 결정될 수 있습니다) 노출 생물의 20 % (LC 20)의 사망 원인이 농도 수준, B)보다 높은 사망률을 결정하지 않는 최고의 분석 농도 수준 부정적인 컨트롤 (NOEC); 십사일, 부정적인 컨트롤 (LOEC)보다 높은 사망률 후 결정 낮은 테스트 농도 수준.
2. 테스트 재료
2.1 Artemia 달걀
테스트를 수행하려면 Artemia franciscana 5에서 얻은 무대 II 또는 III에서 필요합니다. 테스트를 지원하기 위해 활용 공인 계란이나 cysts는 품질 보증 연구 부문, 미국 환경 보호청, 신시내티, 오하이오 45268 미국이나 수생 오염의 생물 학적 연구, 겐트 대학, 벨기에의 연구실에서 예를 들어 상업적으로 사용할 수 있습니다.
2.2 물의 희석
합성 바닷물이 인식 분석 품질 시약 또는 증류수 또는 드 이온화 물에 시판 제제를 해소하여 준비 희석 물로 사용할 수 있습니다. 이상적인 바닷물을 만들기위한 소금 조화가 상업적으로 사용할 수 인스턴트 오션 섞어 예. 그것은 35 (± 2)와 동일한 염도로 희석 물을 권장합니다 PSU뿐만 아니라 채도의 가치의 80 % 이상의 용존산소 농도 및 25의 온도 (± 2) &있길; C. 48시간 적어도 0.45 μm의의 다공성과 필터의 여과를위한 통기 후 희석은 0-4 ° C의 온도에서 어둠 속에서 30 일 최대 저장될 수 있습니다
2.3 Algal 문화
2.0x10 6 셀 / ML - 이것은 시험 생물은 기하 급수적으로 성장하고 1.3x10 6 밀도에 도달 Dunaliella tertiolecta의 microalgae에 피드입니다 것을 권장합니다. 환경 시료를 테스트하는 것은 2.0x10 6 셀 / ML 6보다 높은 밀도와 문화가 필요합니다. 이는 Dunaliella tertiolecta는 해수가 들어있는 문화 매체에서 자랍니다 것이 좋습니다 (30, (± 2) PSU 20 (± 1) ℃) 필수 영양소, 미네랄과 비타민의 추가와. algal 미디어 조성과 준비에 대한 일부 징후는 부록에보고됩니다. 초기 세포 밀도는 약 10 5 세포 / ML로 추천됩니다. algal 문화는 유지되어20 객실 온도 조절기 (± 1) ° C, 어둠의 8 시간 빛의 16 시간 photoperiod 비율과 형광등 3000 (± 300) LX와 조명.
기타 식물성 플랑크톤 종은 또한 먹이를 위해 사용될 수 있지만 Dunaliella tertiolecta에 '동등한'종을 찾는 이들 식물성 플랑크톤 종과 비교 연구를 할 필요가있을 것이다 때문에 실험 조건 (예 : 초기 세포 밀도, 라이트 조명, 온도의 구성 문화 미디어와 노출 시간)은 식물성 플랑크톤 종 중 다릅니다. 다른 오염 물질에 대한 microalgae의 공차가 고려되어야 외에 때문에 또한 Artemia의 식물성 플랑크톤에 미치는 영향의 성장과 발전에 대한 오염 물질 영향.
2.4 참조 물질
이 테스트에서 기준 물질은 나트륨 Dodecyl 황산이다.
2.5 실험실 유리 제품
- 100 ML borosilicate 유리 비커 (18 솔루션을 전송하는 시험과 18 수행)를 포함하여 테스트 컨테이너.
- 표준 용액을 준비하는 플라스크 (예 : 500 ML 플라스크).
- 테스트 솔루션을 준비하는 식스 flasks (예 : 200 ML의 flasks).
- 이동식있는 유리 또는 폴리스티렌 5cm 직경 배양 접시는 cysts를 활성화하고 테스트 컨테이너에 부화 요리에서 Artemia를 전송에 사용되는 다룹니다.
- nauplii를 전송하는 유리 파스퇴르의 pipettes (불꽃에 의해 둥근 팁 포함).
- 유리 캐뉼러 또는 Artemia를 전송하는 파스퇴르 3 ML 일회용 플라스틱 pipettes (절단되어 있어야합니다.)
- Micropipettes 및 단계적 pipettes은 테스트 솔루션을 준비합니다.
- t로 flasks에서 테스트하는 솔루션을 전송하기 위해 6 단계적 실린더 (예 : 50 ML 실린더)그는 용기를 시험.
3. 낭종 활성화
3.1. cysts가 들어있는 배양 접시 +는 물을 붓는
테스트 유기체를 생성하려면, cysts 20 밀리그램은 48 시간 테스트하기 전에 희석 물 12 ML을 포함하는 배양 접시에 넣습니다.
3.2. 빛과 어둠 속에서 부화
배양 접시가 (± 2) 25에서 관리하고 있습니다 ° C와 4000 (± 1000) 럭스 (평방 미터 당 루멘) 1 시간 빛의 강도에.
3.3. 현미경을 사용하여 매체를 교체
24 시간 이내에, 부화 유충은 인공 물이 담겨있는 새로운 배양 접시로 전송됩니다. 송금은 부화, phototropic 애벌레는 광선으로 마이그레이션할 수 있도록 즉, 광원을 사용하여, 현미경을 사용하여 수행됩니다. 유리 파스퇴르 피펫은 그만이 초기 유충 AR을 보장, 전송을 확인하는 데 사용됩니다E는 세포막 아직 cysts이나 애벌레를 양도 및 없습니다.
3.4. 어둠 속에서 부화
애벌레가 들어있는 요리는 25 24 시간 동안 어두운 온도 조절 챔버에 배치됩니다 (± 2) ° C.
4. 테스트 솔루션의 작성
4.1. 물질을 계량하는 것은 + 플라스크에 양도
이것은 시험 물질의 표준 솔루션 500 ML 플라스크에서 물질의 0.5 g을 해소하여 준비하는 것이 좋습니다. 플라스크는 드 이온화 또는 증류수로 가득 차 있으며 시험 물질이 완전히 해소되기 전까지 솔루션은 흔들됩니다. 솔루션은 그것이 물질이 용액에 안정 여부를 알 수 없을 경우를 제외하고 사용 시간에 대비해야합니다. 이 경우, 표준 솔루션은 테스트를 떠나기 2 일 이내에 준비됩니다.
4.2. 희석 물 조류 WI를 추가, 부정적인 제어를 준비10 ML 피펫 일
부정적인 컨트롤은 10 5 세포 / ML의 밀도가 얻어진다되도록 희석 물에 algal 정지 나누어지는를 추가하여 플라스크 (예 : 200 ML 볼륨)에 준비가되어 있습니다.
4.3. 테스트 솔루션을 준비 : 희석 물, 조류 및 표준 용액을 추가
이것은 테스트 솔루션 테스트 원하는 농도가 취득되도록 지정 수량의 희석 물에 표준 용액을 추가하여 최대 5 개의 200 ML의 flasks에 준비가되어 있다고 제안한다. 생물 먹이려면 Dunaliella tertiolecta의 microalgae 서스펜션의 aliquots 사용 및 테스트 솔루션이 준비되면 10 5 세포 / ML의 밀도에 도달 추가될 수 있습니다. 이외의 다음과 같은 순서를 권장합니다 : 희석 물, algal 정지 및 표준 용액을. 테스트 솔루션의 준비 후, 그들은 가능한 한 빨리 분석에 사용해야합니다.
4.4. 후 배양 접시에, 플라스크에서 테스트 컨테이너에 대한 솔루션을 전송하기
테스트 솔루션의 평등 개당 (50 ML)를 졸업 실린더를 이용한 테스트 컨테이너에 소개됩니다. 각 농도에 대한 세 복제본이 만들어집니다. 시험의 각 시리즈의 경우 컨트롤 컨테이너는 테스트 솔루션의 부피와 동일한 희석 물을 금액으로 준비가되어 있습니다. 테스트 솔루션의 동등 권 (12 ML)는 배양 접시에 소개됩니다. 시험의 각 시리즈 들어, 컨트롤 배양 접시가 사용됩니다.
5. 테스트를위한 준비
5.1. II-III 단계에서 Nauplii
낭종 인증 후 마흔 8 시간, nauplii는 II-III 애벌레 단계에 도달하고 테스트 후 사용할 수 있습니다.
5.2. 현미경을 사용하여 배양 접시에 Nauplii 전송
낭종에 사용된 배양 접시 정품 인증은 온도 조절 챔버 밖으로 가져옵니다. 애벌레의 작은 수량은 제어 및 테스트 솔루션을 포함하는 배양 접시로 전송됩니다. 이 작업은 유기체가 손상되지 않도록 충분히 넓은 직경의 피펫을 이용한 현미경으로 수행되어야하는 것입니다. 시험이 단계에서는 전송이 유리 파스퇴르 피펫 (불꽃에 의해 둥근 끝)와 집계에 Artemia을 장려하는 laterally 위치를 광원으로 수행할 수 있습니다.
5.3. 현미경으로 테스트 컨테이너에 페트리 접시에서 Nauplii 전송
열 유충은 테스트 컨테이너에 테스트 솔루션을 배양 접시로부터 전송됩니다. 또한이 작업은 파스퇴르 피펫과 현미경을 이용하여 수행되어야한다. 그것은 한 ML을 초과하지 볼륨 테스트 시스템의 전체적인 볼륨에 영향을 미치지 않도록 애벌레의 흐름 동안 전송되는 것을 권장합니다.
e_step "> 5.4. 전체 컨테이너 parafilm 덮여테스트 비커는 parafilm (공기 통로에 대한 간격을두고)으로 덮여, 25의 온도 (± 2) ° C 시험 전체 기간 동안 900 (± 100) LX의 조명에서 photoperiod과에서 관리하고 있습니다 어둠의 10 시간 빛의 14 시간 비율입니다.
6. 중형과 음식 보충 교체
6.1. 서바이벌 속도 제어
테스트가 시작된 이틀 후, 그리고 5, 7, 9, 12 일 후에, Artemia가 생존 속도를 확인하고 매체 및 식품 보충제를 대체하는 현미경으로 관찰한다.
살아있는 생물의 개수는 각 테스트 컨테이너에 계산됩니다. 현미경으로 관찰하고 약간의 기계적 자극 (예 : 유리 파스퇴르 피펫과 애벌레를 만지고) 10의 몇 가지 움직임을 보여주지 않는 생물 후econds 죽은 것으로 간주되어야한다.
6.2. micropipette으로 테스트할 수있는 물질의 10 ML의 피펫과 샘플링과 조류 샘플링을 보여주는 테스트 솔루션의 준비. 플라스크에서 테스트 컨테이너에 대한 해결책을 전송하기
테스트하는 동안 테스트 솔루션은 주기적으로 교체하고, 그들이 사용할 수있는대로 같은 날 준비를해야합니다. 시험 솔루션은 이전에 준비한 표준 용액으로 만들어집니다.
세 개의 새로운 용기로 이전 테스트 컨테이너에서 6.3. Artemia 전송, 잘라내기 파스퇴르 피펫을 활용,
Artemia의 양도 너무과 같은 유기체를 손상하지 않도록 충분히 넓은 직경과 피펫을 사용하여 수행됩니다. 이 단계 동안 3 ML 플라스틱 파스퇴르 피펫은 (절단 예정) 사용할 수 있습니다.
6.4. 어느 라이브 또는 죽은 Artemia을 포함 비커에 애벌레
1 일 이후 테스트의 마지막에 노출된 4 일, 유충에도 살아날 수는 계산하고 워크시트에 기록됩니다. LC 50 및 / 또는 LC 20 NOEC 14 일에서 LOEC는 계산하고 기록뿐만 아니라 자신감을 제한 95% 적절한, 그리고 계산 방법에서.
7. 대표 결과
시험 (14 일)의 끝에 다음 공식에 따라 각 농도에서 사망률의 비율을 계산 :
(M S / N) * 100
장소 :
M S는 분석 표본에서 죽은 개인의 평균 수입니다
N은 노출된 개인의 총계입니다
표 1 보고서 나트륨 Dodecyl 황산에 노출 Artemia과 테스트 (14d)의 데이터 예제를.
| 농도 (MG / L) | "각 복제에서 죽은 개인의> 번호사망률 (%) | |||
| 나 | II | III | ||
| 음성 제어 | 0 | 2 | 일 | 10 |
| 1.56 | 일 | 2 | 0 | 10 |
| 3.12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6.25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12.5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
더욱이을 결정그래픽 가우스 로그 플롯이나 적절한 통계 방법 (예 : 창병-Karber이나 Probit 방법)을 사용하여 LC 50 값. 테이블 1의 데이터에 대한 LC 50 계산은 8.18 (7.15-9.37) MG / L입니다. 최대 농도가 50 %의 낮은 사망률의 원인을 검사하면 다음 신뢰할 심지어 비 계산할 수있을 것이다 LC 50 값의 계산으로 진행해서는 안됩니다. 이 경우 단, 시험 농도의 범위를 확장하여 테스트를 반복하는 적절한 것입니다. 또는 LC 50 값이 더 정확하다면 검사 높은 농도에서 사망률의 비율과 효과 없음에 대응하는 가장 높은 농도를 나타내는 검사 높은 농도보다 클으로 표시됩니다.
다음 조건을 테스트 끝에 충족되었는지 결과는 유효한 것으로 간주됩니다 :
- 컨트롤의 평균 사망률≤ 20 %이다;
- 십사일에 나트륨 Dodecyl 황산, LC 50 사용은 8.0 (± 5) MG / L 간격에 포함되는 위치.
위의 조건이 충족되지 않은 경우, 생물의 동일한 배치로 얻은 모든 데이터는 무효로 간주하고 테스트를 반복해야합니다.
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Discussion
Artemia 우리는 독극물과 Ecotoxicology의 Artemia 사용과 관련된 몇 가지 옵션을 유지하는 것이 가능하다고 명시 수 있도록 지금까지 한 ecotoxicity 테스트 및 연구에 사용할 수있는 가장 가치있는 시험 생물 중 하나입니다. bioassays에 적합한 수종에이 유기체를 돌려 특징은 다음과 같습니다 넓은 지리적 분포, 불리한 환경 조건과 다양한 영양소, 비교적 간단한 실험실 문화 유지 보수, 조작에 대한 저항, 짧은 생명주기, 대형 자손 생산과에 대한 높은 적응성 종 (种)에 대한 정보의 상당한 금액의 존재. Artemia의 이용에 대한 비판은 화학적 노출에의 민감도라고합니다 : 이전의 연구는 동일한 실험 조건 3 아래에 다른 시험 생물에 비해, ecotoxicity 연구에 대해 덜 민감한 종족으로 Artemia를 (테스트 24 시간 노출까지) 참조하십시오. 의 선택ecotoxicity 테스트를위한 방법은 이러한 측면에서 매우 중요합니다. 우리는 노출 4 24 시간 프로토콜 같은 시작 조건 (cysts의 사용에서 얻은 시험 생물로서 nauplii) 가지고 방법을 표준화하려고하지만, 비교적 긴 노출 시간 (14 일)로 자세한 내용을 제공할 수 민감한 반응. 이 프로토콜은 확실하게 급성 시험보다 더 민감한 반응을 허용하지만 우리가 Artemia의 예상 수명을 고려한다면 14 일 노출 관련이 없기 때문에 그것은 만성 시험을위한 대용품으로 사용할 수 없습니다. 이 방법에 대한 최종 선택은 광범위하게 논의되었습니다. 우리는 또한 장기 시험 sublethal 효과의 관찰을 보장 싶어서 처음에는 사망률과 성장 (14 일간 노출 후 즉, 등딱지 길이) 모두가 선정되었다. 그러나 sublethal 종점은 사망률 6에 비해 덜 민감한 것으로 발견되었다. 이런 이유로 사망률이 descript에 언급된 유일한 끝점입니다프로토콜 및 동영상 이온. 이 조사는 생존이 그들 (생존, 성장과 번식)에 의해 고려 사람 중 가장 민감한 종점이다 관찰 다른 연구자의 연구 7,8과 일치합니다.
제안된 방법은 화학, effluents과 환경 매트릭스 9 독성을 평가하는 데 유용합니다. 기능에서는 이러한 생체 (즉, 효소 활동) 10 같은 다른 하위 치명적인 만성 독성 효과를 테스트 재미있을 수도 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
환경 보호 및 연구를위한 연구소 Loredana Manfra (환경 품질 모니터링의 ISPRA -학과) 및 환경 보호를위한 지역기구 (에밀리아 - Romagna, 이탈리아)의 Federica Savorelli에 의해 제작.
바닷물 / 소금기있는 물 및 UNICHIM위원회 수질에 (화학 분야의 기술 표준화 운영을위한 연구원)의 침전 - 생물 학적 방법 그룹 내에서 Artemia 갑각류의 서브 작업 그룹에 대한 참조 멤버.
ISPRA의 마르코 Pisapia (웹 단위)에 의해 Videography 및 편집.
안나 마리아 시세 및 ISPRA의 에리카 Magaletti (환경 품질 모니터링학과)에 의한 생산 조정.
바닷물 / 소금기있는 - 우리는 에밀리아 - Romagna의 환경 보호, 페라라 지점, 생물 학적 방법 그룹에 대해 지역 기관에게 감사를 표합니다Rossella Boscolo과 재정 지원을위한 ISPRA의 마시모 Gabellini (예방과 영향의 완화의학과), 파비오 Matassa와 런던 수질 및 Luciana Migliore, 그들의 협력 토르 Vergata 대학 (로마)에서 UNICHIM위원회 물과 침전물 그들의 언어에 대한 지원 로마의 언어 학원.
References
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